用于防止干细胞破碎和聚集的方法和组合物

摘要

提供了一种用于防止干细胞破碎和聚集的方法。此外，提供了一种用于血管内给药的干细胞的组合物，其中干细胞悬浮于含阿司匹林的溶液。进一步，提供了一种用于防止干细胞破碎和聚集的组合物，其中干细胞悬浮于含阿司匹林的溶液。根据本发明，可以防止运输和储存期间细胞的破碎和聚集，使得可以稳定地到达不组织并以更有效的方式表现出其活性，从而显著地提高使用干细胞的细胞治疗的效果。

权利要求

1.一种用于防止脂肪组织来源的间充质干细胞(AdMSC)破碎和聚集的方法，所述方法包括：将脂肪组织来源的间充质干细胞悬浮于含阿司匹林的溶液中，其中阿司匹林的含量为0.0001到0.01mg/ml。

2.权利要求1所述的方法，其中所述阿司匹林是异山梨醇基阿司匹林或烟酸基阿司匹林。

3.权利要求1所述的方法，其中所述含阿司匹林的溶液进一步包括生理盐水、Hartman-D溶液或磷酸盐缓冲液(PBS)。

4.一种组合物在用于防止干细胞破碎和聚集中的应用，所述组合物包括干细胞；和含阿司匹林的溶液，其中所述干细胞悬浮于所述含阿司匹林的溶液中,其中所述干细胞为脂肪组织来源的间充质干细胞(AdMSC)，阿司匹林的含量为0.0001到0.01mg/ml。

5.权利要求4所述的应用，其中所述含阿司匹林的溶液进一步包括生理盐水、Hartman-D溶液或磷酸盐缓冲液(PBS)。

说明书

用于防止干细胞破碎和聚集的方法和组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于防止干细胞破碎和聚集的方法，更特定而言，涉及一种用于防止干细胞破碎和聚集的方法，所述方法能够防止在运输或储存期间细胞破碎或聚集。

背景技术

[0002] 干细胞是指能够分化成至少两种类型的细胞同时具有自我复制能力的细胞，干细胞可分为全能干细胞、多能干细胞(pluripotent stem cells)和专能干细胞(multipotent stem cell)。全能干细胞是具有能够发育成一个完整个体的全能性质的细胞，而这些性质为卵母细胞和精子受精之后直到八细胞期的细胞所拥有。当这些细胞分离并移植到子宫内时，这些细胞可发育成一个完整的个体。多能干细胞是能够发育成外胚层、中胚层和内胚层来源的各种细胞和组织的细胞，来源于位于受精4-5天后生成的胚囊内部的内细胞群。这些细胞被称为“胚胎干细胞”，可以分化成各种其他组织细胞，但不能形成新的活生物体。专能干细胞是能够分化成仅特异于包含这些细胞的组织和器官的干细胞，专能干细胞不仅参与胎儿期、新生儿期和成体期的各种组织和器官的生长和发育，还参与成体组织的稳态维持和组织损伤后诱发再生的功能。组织特异性专能细胞统称为“成体干细胞”。

[0003] 通过收获已经存在于人体各种器官中的细胞以使所述细胞发育成干细胞而获得的成体干细胞具有仅分化成特异性组织的特征。然而，近来，用于使成体干细胞分化成包括肝细胞等各种组织的试验取得成功，这成为了热点。特定而言，在再生疗法中，即通过主动利用用于对具有由疾病或事故导致的、功能紊乱或失调的生物组织和器官进行再生并恢复功能的细胞来进行的治疗，主要使用了一种方法，包括：采集干细胞、血液来源的单核细胞或骨髓来源的单核细胞，通过体外培养诱导细胞增殖和/或分化，并通过移植将所选择的未分化(干细胞和/或组细胞)和/或分化细胞转导到患者体内。预期现有通过经典药物治疗方法或外科手术方法来治疗疾病的方法将被如上所述的用健康细胞、组织或器官来替代受损细胞、组织或器官的细胞/组织替代疗法所取代，干细胞的用途将进一步增加。

[0004] 因而，目前，已研究了干细胞的各种功能。其中，使用间充质干细胞的细胞疗法已成为热点，并且已开发了一种改良分离自人体的间充质干细胞以便适合于治疗的技术(WO 2006/019357，韩国专利第0795708号和韩国专利第0818214号)。

[0005] 然而，对于制备适合于体内给药并具有优异安全性的干细胞的方法的研究仍没有充分地实施。

[0006] 因此，本发明者们证实在将干细胞悬浮于含阿司匹林的溶液的情况下，可以防止干细胞的破碎和聚集，从而完成了本发明。

发明内容

[0007] 本发明的一个目的是提供一种用于防止干细胞破碎和聚集的方法。

[0008] 本发明的另一个目的是提供一种用于血管内给药的干细胞组合物。

[0009] 本发明的另一个目的是提供一种用于防止干细胞破碎和聚集的组合物。

[0010] 根据本发明的一个方面，提供了一种用于防止干细胞破碎和聚集的方法，包括将干细胞悬浮于含阿司匹林的溶液。

[0011] 根据本发明的另一个方面，提供了一种用于血管内给药的干细胞的组合物，其中干细胞悬浮于含阿司匹林的溶液。

[0012] 根据本发明的另一个方面，提供了一种用于防止干细胞破碎和聚集的组合物，其中干细胞悬浮于含阿司匹林的溶液。

附图说明

[0013] 图1是通过观察暴露于各种浓度的阿司匹林下24小时的干细胞的聚集程度而获得的照片。

[0014] 图2是通过观察暴露于各种浓度的阿司匹林下72小时的干细胞的聚集程度而获得的照片。

具体实施方式

[0015] 除非本文中另有定义，本说明书中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员所理解的含义相同的含义。一般来说，本说明书中使用的名称和以下描述的实验方法是本领域公知且通用的。

[0016] 如本文所使用，术语“干细胞”是指能够分化成至少两种类型的细胞同时具有自我复制能力的细胞，而术语“成体干细胞”是指在发育过程进行由此形成胚胎的各个器官的阶段或者在成体阶段产生的干细胞。

[0017] 如本文所使用，术语“间充质干细胞”是指分离自人或哺乳动物的组织的未分化干细胞，其可来源于各种组织。特定而言，间充质干细胞可以是脐带来源的间充质干细胞、脐带血来源的间充质干细胞、骨髓来源的间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞、肌肉来源的间充质干细胞、神经来源的间充质干细胞、皮肤来源的间充质干细胞、羊膜来源的间充质干细胞和胎盘来源的间充质干细胞，并且从各组织分离干细胞的技术已为本领域所知。

[0018] 如本文所使用，术语“脂肪来源的间充质干细胞”，是一种分离自脂肪组织的未分化成体干细胞，在本说明书中简称为“脂肪来源的成体干细胞”、“脂肪干细胞”或“脂肪来源的干细胞”。脂肪来源的间充质干细胞可以通过本领域已知的普通方法获得。其分离方法的例子如下。即，可以通过以下方法分离脂肪来源的间充质干细胞：培养含悬浮在生理盐水中通过脂肪抽吸获得的脂肪的悬液，之后用胰蛋白酶处理贴附到诸如烧瓶等培养容器的干细胞层，然后回收经处理的干细胞，使用刮刀刮取而直接回收悬浮在少量生理盐水中的干细胞的方法，或类似方法。

[0019] 如本文所使用，术语“运输”是指干细胞本身、填充有含干细胞的溶液的容器等通过诸如运载体等运输工具来运输，术语“储存”包括低温储存以及室温储存。

[0020] 如本文所使用，术语“防止干细胞破碎和聚集”是指以单个细胞的形式保持干细胞不被破坏或聚集。举例而言，其是指被运输或储存的干细胞以单个细胞的形式保持而没有细胞膜破坏或细胞之间的聚集。

[0021] 干细胞可以通过各种方法给药于体内，例如，静脉内给药方法、动脉内给药方法或腹膜内给药方法等。其中，由于静脉内给药方法可简单且安全地治疗疾病而无外科手术，故静脉内给药方法是有用的。然而，为使静脉内给药的干细胞实际并稳定地到达靶位点以获得期望的治疗效果，应当满足各种因素。首先，干细胞需要以单个细胞的形式血管内给药。可以通过用胰蛋白酶等处理来将干细胞以单个细胞的形式制备用于体内给药，但即使是在以单个细胞的形式制备干细胞的情况下，运输或储存期间细胞膜也可能被破坏或细胞之间可能形成聚集。在通过静脉给药等方式将聚集的干细胞而非单个形式的干细胞或者被破坏的细胞体内给药的情况下，所给药的细胞可能附着于血管内皮细胞、血小板等，从而降低血液流速或妨碍血液循环，甚至造成微血管、血管等的闭塞(D.Furlani等,Microvasular Research 77(2009)370-376)。因而，在干细胞血管内给药之前，不形成细胞的破碎或聚集是至关重要的，且在干细胞血管内给药之后，干细胞应当以单个细胞的形式稳定地到达靶位点而没有细胞的破碎或聚集。进一步地，干细胞应当具有适合于血管内给药的尺寸，使得血管内给药的干细胞不降低血液流速或形成凝血。此外，干细胞应当以预定的浓度或更高的浓度给药，以便到达靶位点的干细胞呈现预期的治疗效果。在如上所述的各种因素中，本发明通过在血管内给药之前防止干细胞破碎和聚集，提供了适合于体内给药并具有优异安全性的干细胞。

[0022] 本发明提供了一种用于防止干细胞破碎和聚集的方法，包括将干细胞悬浮于含阿司匹林的溶液。

[0023] 如本文所使用，术语“含阿司匹林的溶液”是指含阿司匹林化合物的溶液，而作为溶剂，可优选生理盐水。除此之外，可以使用任何溶剂而没有限制，例如Hartman-D溶液、磷酸盐缓冲液(PBS)等，只要其是本领域通用的。作为阿司匹林，可以使用类阿司匹林化合物，以及通常市售的阿司匹林产品。在本法明的实施例中，通过向生理盐水中添加乙酰水杨酸(Sigma；A5376)、Arthalgyl注射液或阿司匹林赖氨酸(Shinpoong)来制备含阿司匹林的溶液。在此情况下，优选所添加的阿司匹林的含量在0.0001到0.01mg/ml。在所添加的阿司匹林的含量高于上述范围的情况下，会降低细胞的存活率，而在含量低于上述范围的情况下，防止细胞破碎或聚集的效果可能不明显。

[0024] 由于在含阿司匹林的溶液中悬浮干细胞的情况下，运输或储存期间不发生干细胞的破碎和聚集，故这些干细胞可直接应用于体内给药，使得这些干细胞是有用的。因而，优选地，在血管内给药时使用的干细胞可在悬浮于含阿司匹林的生理盐水中之后使用。

[0025] 另一方面，本发明提供了一种用于血管内给药的干细胞组合物，其中干细胞悬浮于含阿司匹林的溶液。

[0026] 另一方面，本发明提供了一种用于防止干细胞破碎和聚集的组合物，其中干细胞悬浮于含阿司匹林的溶液。

[0027] 作为本发明中使用的干细胞，优选地可以使用成体干细胞。其中，可以使用从脂肪组织或诸如毛囊、羊膜等的上皮组织获得的成体干细胞。最优选地，可以使用脂肪组织来源的成体干细胞。可以使用间充质干细胞(MSC)，更特定而言，可以使用脂肪组织来源的间充质干细胞(AdMSC)。

[0028] 优选地，脂肪组织或上皮组织来源于哺乳动物，更优选地，脂肪组织或上皮组织来源于人。在本发明的实施例中，使用人脂肪组织来源的间充质干细胞(hAdMSC)。

[0029] 作为用于获得干细胞的培养基，可以使用作为适于培养干细胞的培养基的本领域已知的普通培养基。例如，有最低必需培养基(MEM)、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、Roswell Park Memorial Institute培养基(RPMI)和角质形成细胞无血清培养基(K-SFM)。此外，可以使用本领域使用的培养基。优选地，可优选使用选自下组的培养基：M199/F12(混合物)(GIBCO)、MEM-α培养基(GIBCO)、低葡萄糖的DMEM培养基(Welgene)、MCDB 131培养基(Welgene)、IMEM培养基(GIBCO)和K-SFM。特别地，其中，可优选使用K-SFM培养基。

[0030] 用于获得干细胞的培养基可以补充有本领域已知的添加剂，所述添加剂抑制干细胞的分化同时促进未分化的干细胞的表型的增殖。此外，培养基可含有在等渗溶液中的中性缓冲液(例如，磷酸盐和/或高浓度碳酸氢盐)和蛋白质营养素(例如，诸如胎牛血清(FBS)的血清、血清替代物、白蛋白、或者诸如谷酰胺的必需或非必需氨基酸)。进一步，培养基可含有脂质(脂肪酸、胆固醇、血清的HDL或LDL提取物)以及其他存在于大多数这类保藏培养基中的其他成分(如胰岛素或转铁蛋白、核苷或核苷酸、丙酮酸盐、诸如葡萄糖的糖源、以任何离子化形式或盐的硒、诸如皮质醇的糖皮质激素和/或诸如β-巯基乙醇的还原剂)。

[0031] 此外，有益的是，培养基包含抗聚集剂，例如Invitrogen(Cat#0010057AE)出售的抗聚集剂，以防止细胞彼此粘附、粘附到容器壁或形成过大的团簇。

[0032] 其中，有利地是使用一种或多种以下额外的添加剂：

[0033] ·干细胞因子(SCF,Steel因子)、使得c-kit二聚体化的其它配体或抗体，以及同一信号转导途径的其它活化剂；

[0034] ·针对其它酪氨酸激酶相关受体的配体、如针对血小板来源生长因子(PDGF)的受体、巨噬细胞集落刺激因子、Flt-3配体和血管内皮生长因子(VEGF)；

[0035] ·提高环腺苷酸(cyclic AMP)水平的因子，如毛喉素(forskolin)；

[0036] ·诱导gp130的因子，如LIF或抑瘤素-M(Oncostatin-M)；

[0037] ·造血生长因子，如促血小板生成素(TPO)；

[0038] ·转化生长因子，如TGFβ1；和

[0039] ·Neurotrophines，如CNTF。

[0040] 特定而言，在本发明示例性实施方式中用于培养脂肪干细胞的培养基优选包含NAC、钙、胰岛素、皮质醇和抗氧化剂。更特定而言，可以使用含有FBS、NAC、钙、rEGF、胰岛素、皮质醇和抗氧化剂中的两种或更多种成分的培养基。作为抗氧化剂，可以使用选自以下物质的抗氧化剂：硒、抗坏血酸、维生素E、儿茶酚、番茄红素、β-胡萝卜素、辅酶Q10、二十碳五烯酸(EPA)、二十碳六烯酸(DHA)等等。其中，可优选使用硒。在本发明的实施例中，使用硒作为抗氧化剂，所使用的硒的优选量为0.5到10ng/ml。

[0041] 在本发明的实施例中，在具有上述组合物的培养基中培养脂肪来源的间充质干细胞。可通过以下方法获得脂肪来源的间充质干细胞。首先，将通过脂肪抽吸或类似方法从获自腹部的人脂肪组织分离并用PBS洗涤。然后，将分离的组织细切、用补充有胶原酶的DMEM培养基消化、用PBS洗涤，再在1000rpm下离心5分钟。去除上清液，并将剩余在底部的沉淀用PBS洗涤，接着在1000rpm下离心5分钟。使用100目筛去除漂浮物质，并将得到的细胞再次用PBS洗涤。将得到的细胞在DMEM(10％FBS、2mM NAC、0.2mM抗坏血酸)培养基中培养，过夜后，将没有附着到培养容器底部的细胞用PBS洗涤。然后，培养剩余的细胞，同时将培养基每隔一天用含NAC、抗坏血酸、钙、rEGF、胰岛素和皮质醇的K-SFM培养基更换，使得间充质干细胞被分离和传代培养，从而使得可以获得间充质干细胞。然而，可通过本领域已知的方法以及上述方法获得间充质干细胞。

[0042] 在将在具有上述组合物的培养基中培养的干细胞用胰蛋白酶处理的情况下，可以获得单个细胞形式的干细胞。在此情况下，用胰蛋白酶处理以抑制细胞的聚集，从而允许细胞具有单个细胞形式，并且可以使用任何物质来代替胰蛋白酶，只要该物质可抑制细胞的聚集。

[0043] 下面，将通过实施例详细描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明本发明，本领域技术人员将理解，这些实施例并非构建为限制本发明的范围。

[0044] 实施例

[0045] 实施例1：人脂肪组织来源的间充质干细胞的分离

[0046] 通过脂肪抽吸从腹部脂肪分离脂肪组织并用PBS洗涤。将分离的脂肪组织细切，然后在37℃下，在补充了I型胶原酶(1mg/ml)的DMEM培养基中消化2小时。在用PBS洗涤经胶原酶处理的组织之后，将消化的组织在1000rpm下离心5分钟，以去除上清液，并用PBS洗涤沉淀，然后在1000rpm下离心5分钟。在通过用100目筛过滤来去除漂浮物质之后，将得到的细胞用PBS洗涤，并在补充了10％FBS、2mM N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)和0.2mM抗坏血酸的DMEM中培养。

[0047] 过夜之后，用PBS洗涤未附着的细胞。然后，每隔一天用含5％FBS、2mM NAC、0.2mM抗坏血酸、0.09mM钙、5ng/ml rEGF、5ng/ml胰岛素、10ng bFGF、74ng/ml皮质醇和1ng/ml硒的Keratinocyte-SFM培养基(K-SFM)更换培养基，同时对剩余细胞进行传代培养，从而分离脂肪来源的间充质干细胞。

[0048] 实施例2：人脂肪组织来源的间充质干细胞的分离

[0049] 1-1：干细胞的单个细胞保持能力

[0050] (1)用含各种浓度的乙酰水杨酸的生理盐水处理

[0051] 在将实施例1中分离的脂肪组织来源的间充质干细胞用胰蛋白酶处理之后，将经胰蛋白酶处理的脂肪组织来源的间充质干细胞(1.0X 107个细胞)悬浮于含各种浓度的乙酰水杨酸(Sigma；A5376)的生理盐水，并观察12和24小时的存活率。含乙酰水杨酸的生理盐水是通过向生理盐水中添加各种浓度的乙酰水杨酸并在37℃下进行超声处理30分钟来制备的。

[0052] 表1

[0053] [表1]

[0054]

[0055] 作为实验结果，可以证实在添加到10ml生理盐水中的阿司匹林的量为1.0mg或更多时，展现出细胞毒性效果。

[0056] (2)用含各种浓度的Arthalgyl注射液的生理盐水处理

[0057] 在将实施例1中分离的脂肪组织来源的间充质干细胞用酪蛋白酶处理之后，将经酪蛋白酶处理的脂肪组织来源的间充质干细胞(1.0X 107个细胞)悬浮于含各种浓度的Arthalgyl注射液的生理盐水，并观察12、24、48和72小时的存活率。

[0058] 表2

[0059] [表2]

[0060]

[0061] 作为实验结果，可以证实在添加到10ml生理盐水中的阿司匹林的量为0.001至0.1mg的情况下，阿司匹林不影响脂肪干细胞的存活。在含阿司匹林的溶液中悬浮脂肪干细胞时，经悬浮的脂肪干细胞可储存达72小时，但优选经悬浮的脂肪干细胞在24小时内被处理。

[0062] (3)用含各种浓度的Arthalgyl注射液的生理盐水处理的干细胞的增殖能力[0063] 在将实施例1中分离的脂肪组织来源的间充质干细胞用酪蛋白处理之后，将经酪蛋白处理的脂肪组织来源的间充质干细胞(1.0X 107个细胞)悬浮在含各种浓度的Arthalgyl注射液的生理盐水中，并观察24小时后的存活率。

[0064] 表3

[0065] [表3]

[0066]

[0067] 作为实验结果，可以证实在添加到10ml生理盐水中的阿司匹林的量为0.001至0.1mg的情况下，阿司匹林不影响脂肪干细胞的增值能力。

[0068] 此外，作为通过观察培养所悬浮的细胞(1.0X 106个细胞)7天之后的细胞数目和存活率获得的结果，如表4所示，存活率为86至90％，且如表5所示，细胞数目几乎没有因添加阿司匹林而改变(0.001-0.1mg/10ml)。

[0069] 表4

[0070] [表4]

[0071] <在各种浓度的阿司匹林24小时之后的存活率(n＝3)>

[0072]

[0073] 表5

[0074] [表5]

[0075] <在各种浓度的阿司匹林悬浮24小时并培养时，增值能力的影响(n＝3)>[0076]

[0077] (4)用含各种浓度的Arthalgyl注射液的生理盐水处理的干细胞的聚集

[0078] 在将实施例1中分离的脂肪来源的间充质干细胞用酪蛋白处理，并将经酪蛋白处理的脂肪来源的间充质干细胞悬浮在含各种浓度的Arthalgyl注射液的生理盐水中之后，观察24和72小时后的聚集。

[0079] 作为结果，可以证实在24小时后，在对照组中，几乎频繁地观察到聚集，并且可以理解，在所添加的Arthalgyl注射液的量在0.001至0.1mg的情况下，脂肪干细胞减少(图1)。在高浓度(1X 105个细胞)干细胞实验组以及低浓度(5X 104个细胞)干细胞试验组中，证实了防止阿司匹林聚集的效果。

[0080] 作为通过证实72小时之后的聚集程度获得的结果，在对照组和用1μg/ml阿司匹林处理的组中，观察到与聚集现象一同发生的细胞凋亡，但在用至少10μg/ml阿司匹林处理的组中，如图2所示，没有观察到该现象。

[0081] (5)用含阿司匹林赖氨酸(Aspirin Lysine,Shinpoong)的生理盐水处理干细胞的特征

[0082] 在将实施例1中分离的脂肪组织来源的间充质干细胞用酪蛋白处理之后，将经酪蛋白处理的脂肪组织来源的间充质干细胞(1.0X 106个细胞)悬浮在含各种浓度的阿司匹林赖氨酸(Shinpoong)的生理盐水中，并培养5天，测量细胞数目。然后，在低温储存24小时之后，测量FACS，从而证实细胞的特征。

[0083] 表6

[0084] [表6]

[0085]表达率 阿司匹林浓度(mg/10ml)

[0086]  0 0.1
CD29 99.97％ 99.97％
CD31 0％ 0.21％
CD44 99.45％ 99.25％
CD45 0.19％ 0.17％

[0087] 作为实验结果，依赖于阿司匹林赖氨酸浓度的细胞存活率略微降低，但该降低并不明显。此外，存在个体差异，但在培养5天后细胞数目也几乎没有改变。在将脂肪来源的间充质干细胞在悬浮于含阿司匹林的生理盐水中24小时之后低温储存24小时的情况下，没有观察到阿司匹林浓度的影响。

[0088] 作为实验结果，没有显示阿司匹林赖氨酸对存活率的细胞毒性效应，且观察到在含阿司匹林的生理盐水中储存脂肪来源的间充质干细胞的情况下，可以防止聚集而不会造成细胞特征的改变。

[0089] 工业实用性

[0090] 根据本发明，可以防止运输和储存期间干细胞的破碎和聚集，使得可以得到适于体内给药且具有优异安全性的干细胞，从而显著地提高通过干细胞给药的细胞治疗的效果。

[0091] 尽管本发明已经基于其具体特征详细地进行了描述，但对本领域技术人员显然的是，这些具体技术仅仅是优选地实施方式，因而本发明的范围并不限于所述实施方式。因此，本发明的实质范围由所附权利要求书及其等同方式所限定。