选择个性化脑癌疗法的方法

摘要

本发明涉及基于在患病组织中患者的PME‑1表达水平选择个性化脑癌疗法的方法。

权利要求

1.一种用于评估PME-1的表达水平的试剂在制备用于为需要这类疗法的患者选择脑癌疗法的方法的试剂中的用途，其中所述方法包括：a) 评估在从患病的脑组织获得的外科或活检样品中PME-1的表达水平；

b) 使用步骤a)中获得的结果作为用于选择脑癌疗法的标准，所述患者对于所述脑癌疗法是易感的；其中增加的PME-1表达表明所述患者对用STS衍生物的单一疗法是不易感的，但所述患者对于用STS衍生物和PME-1沉默剂的组合疗法是易感的，而未受损的PME-1表达表明所述患者对于用STS衍生物的癌症疗法是易感的；其中所述STS衍生物具有通式(I)：其中

R’为H或烷基;

R1和R2为H或一起形成氧代；

R3和R4独立地为H、OH或一起形成氧代；

R5、R6、R6’、R7和R8独立选自H、烷基、烷氧基、羟基、羟烷基、烷氧羰基或单-和二烷基氨基；

X为CH2或O，和

n为0或1；并且

其中所述PME-1沉默剂是RNAi分子，其选自小双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)、切酶底物siRNA (DsiRNA)、人造微小RNA (miRNA)前体和短发夹RNA (shRNA)。

2.权利要求1的用途，其中所述STS衍生物选自以下结构：、 、 、

、 。

3.一种用于评估PME-1的表达水平的试剂在制备用于为需要这类疗法的患者选择脑癌疗法的方法的试剂中的用途，其中所述方法包括：a) 评估在从患病的脑组织获得的外科或活检样品中PME-1的表达水平；

b) 使用步骤a)中获得的结果作为用于选择脑癌疗法的标准，所述患者对于所述脑癌疗法是易感的；其中增加的PME-1表达表明所述患者对用STS衍生物的单一疗法是不易感的，但所述患者对于用STS衍生物和PME-1沉默剂的组合疗法是易感的，而未受损的PME-1表达表明所述患者对于用STS衍生物的癌症疗法是易感的；其中所述STS衍生物是，并且其中所述PME-1沉默剂是RNAi分子，其选自小双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)、切酶底物siRNA (DsiRNA)、人造微小RNA (miRNA)前体和短发夹RNA (shRNA)。

4.权利要求1、2或3的用途，其中所述患者罹患脑癌，其为神经胶质瘤。

5.权利要求1、2或3的用途，其中所述患者罹患选自以下的脑癌：星形细胞瘤、少突神经胶质瘤和室管膜细胞瘤。

6.权利要求5的用途，其中所述星形细胞瘤选自少年毛细胞性星形细胞瘤、低级星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤和成胶质细胞瘤。

7.权利要求1、2或3的用途，其中所述RNAi分子选自SEQ ID NO: 5-40。

说明书

选择个性化脑癌疗法的方法

发明领域

[0001] 本发明涉及个性化药物领域。更具体地，本发明涉及基于患者在患病组织中的蛋白组学特征选择个性化脑癌疗法的方法。

[0002] 发明背景

[0003] 个性化医学是相对年轻的医疗保健领域，其目标在于鉴别各患者的遗传信息、基因组信息和临床信息，所述信息允许对发展给定疾病的可能性、疾病的预后和对疗法的易感性作出精确的个性化预测。因此，个性化医学能够做出更有见解的医学结论、选择更好靶向的疗法和降低医疗保健费用。

[0004] 神经胶质瘤是种类广泛的原发性脑和脊髓肿瘤，具有表现出神经胶质细胞的特性的肿瘤细胞并占所有脑肿瘤的约42%。根据美国癌症协会，神经胶质瘤可分为三个亚型，即星形细胞瘤、少突神经胶质瘤和室管膜细胞瘤(epedymomas)，取决于受累神经胶质细胞的类型。星形细胞瘤由星形胶质细胞产生并占所有脑肿瘤的约35%。通常，星形细胞瘤为不可医治的，因为它们遍布正常脑组织。星形细胞瘤通常基于对活检样本的显微术检查，依据在显微镜下检查活检的医生所使用的标准而分类为低级、中级或高级。星形细胞瘤的最高级被称为成胶质细胞瘤——最常见的成人恶性脑肿瘤。在诊断后患有多形性成胶质细胞瘤(GBM)的患者的平均存活小于14个月。

[0005] 由于神经胶质瘤的异质基因组特征（heterogeneous genomic landscape），未来的疗法有可能需要针对各患者的肿瘤基因型和蛋白组学特征个性化。事实上，患有少突神经胶质瘤的患者已经从个性化医学受益，因为对化学治疗的响应和染色体特征之间存在清楚的关系(Cairncross等人, J. Natl. Cancer Inst., 1998, 90: 1473-1479)。

[0006] 蛋白磷酸酶甲基转移酶1(PME-1)已经被鉴定为癌症相关的蛋白，其表达与低级星形细胞神经胶质瘤向恶性成胶质瘤细胞(GBM)的进展相关(Puustinen等人, Cancer Res. 2009, 69: 2870-2877)。PME-1与蛋白磷酸酶2A(PP2A)相互作用，对蛋白磷酸酶2A(PP2A)的抑制是人类细胞转化的先决条件(综述于Westermarck和Hahn，Trends Mol. Med.，2008，
14：152-160)。已暗示PME-1通过其酶促甲基酯酶活性抑制PP2A活性，所述酶促甲基酯酶活性对于在催化性PP2Ac亚基上的保守性亮氨酸309的去甲基化为必须(Janssens等人, Trends Biochem. Sci., 2008, 33:113–21)。抑制的备选机制已基于对PME-1-PP2A复合物的结构分析而提出，所述分析表明PME-1直接结合PP2Ac亚基的催化裂口(catalytic cleft)(Xing等人, Cell, 2008, 133:154–163)。然而，PME-1在神经胶质瘤发展和它们的化学抗性中的作用仍待确定。

[0007] 尽管最近的研究已经找到作为可能的未来靶标的一些备选分子在神经胶质瘤的治疗中用于个性化治疗法，但也有对鉴定和阐明标记物的鉴定需要，所述标记物可用于将有可能受益于化学疗法的患者与不大可能响应于所述疗法的那些区分开。

[0008] 发明简述

[0009] 本发明涉及为需要这类疗法的患者选择脑癌疗法的方法。所述方法包括以下步骤：a) 评估在从所述患者获得的样品中PME-1的表达水平；b) 使用步骤a)中获得的结果作为用于选择脑癌疗法的标准，所述患者对于所述脑癌疗法是易感的。

[0010] 在一个实施方案中，增加的PME-1表达表明所述患者对用STS衍生物的单一疗法是不易感的。

[0011] 在另一实施方案中，增加的PME-1表达表明所述患者对用STS衍生物和PME-1沉默剂的组合疗法是易感的。

[0012] 在更另一实施方案中，未受损的（intact）PME-1表达表明所述患者对于用STS衍生物的癌症疗法是易感的。

[0013] 在进一步的实施方案中，所述STS衍生物具有下文描述的通式(I)。

[0014] 在仍进一步的实施方案中，所述患者罹患脑癌，其选自神经胶质瘤、星形细胞瘤、少年毛细胞性星形细胞瘤（juvenile pilocytic astrocytoma）、低级星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤（anaplastic astrocytoma）、成胶质细胞瘤、少突神经胶质瘤和室管膜细胞瘤。

[0015] 本发明的其它方面、具体的实施方案、目标、细节和优点在下面的附图、详述和实施例中阐明。

[0016] 附图简述

[0017] 在下面，本发明将参考附图通过优选实施方案更详细地描述，在所述附图中：

[0018] 图1A为蛋白质印迹，其展示用杂乱的dsRNA(Scr.)和PME-1特异性dsRNA(PME-1)转染的人类成胶质细胞瘤T98G细胞中PME-1的表达水平。

[0019] 图1B显示在T98G成胶质细胞瘤细胞中的细胞凋亡性核断裂的量，所述细胞用杂乱的或PME-1特异性dsRNA转染48小时，并随后用所示浓度的不同药物/化学抑制剂处理另外24小时。缩写词：Chl Cl - 氯化白屈菜季铵碱（chelerythrine chloride）, TMZ - 替莫唑胺, STS - 星形孢菌素。

[0020] 图1C显示在T98G成胶质细胞瘤细胞中的细胞凋亡性核断裂的量，所述细胞用杂乱的或PME-1特异性dsRNA转染48小时，并随后用所示浓度的星形孢菌素(STS)或细胞死亡诱导配体、重组FasL或TRAIL处理另外24小时。

[0021] 图1D显示与杂乱的dsRNA转染的细胞相比在渐增的星形孢菌素的浓度下PME-1 dsRNA转染的T98G细胞的细胞凋亡方面的剂量依赖性增加。

[0022] 图1E和1F分别表示在转染杂乱的dsRNA或PME-1 dsRNA并用所示浓度的星形孢菌素处理2天之后T98G和U118MG成胶质细胞瘤细胞的克隆生成潜能，

[0023] 图2A表示通过与星形孢菌素处理组合的三种不同PME-1 dsRNA——PME-1.1 (SEQ ID NO:1)、PME-1.2 (SEQ ID NO: 2)和PME-1.3 (SEQ ID NO: 3)对细胞凋亡性核断裂的诱导。

[0024] 图2B为蛋白质印迹，其证明杂乱的dsRNA(Scr.)和三种不同PME-1特异性dsRNA(PME-1.1，即SEQ ID NO: 1，PME-1.2，即SEQ ID NO: 2和PME-1.3，即SEQ ID NO: 3)在T98G细胞中的PME-1沉默活性。

[0025] 图2C是对上述蛋白质印迹图像的密度计分析，其显示与杂乱的siRNA转染的细胞相比，用PME-1特异性dsRNA(PME-1.1，即SEQ ID NO: 1，PME-1.2，即SEQ ID NO: 2和PME-1.3，即SEQ ID NO: 3)转染的T98G细胞中剩余的PME-1水平。

[0026] 图2D显示与未转染的细胞相比在渐增的星形孢菌素的浓度下PME-1 dsRNA转染的T98G细胞在细胞凋亡上的剂量依赖性增加。

[0027] 图3A显示PME-1 dsRNA转染和星形孢菌素处理对T98G细胞成活力的作用。

[0028] 图3B显示PME-1 dsRNA转染和星形孢菌素处理对T98G细胞中有活性的胱天蛋白酶-3和-7的水平的作用。

[0029] 图3C显示泛胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK处理对PME-1 dsRNA和星形孢菌素介导的细胞凋亡（测量为核断裂的量）的作用。

[0030] 图4A显示用PP2A抑制剂冈田酸预处理T98G细胞对PME-1 dsRNA和星形孢菌素介导的细胞凋亡的作用（以核断裂的量估量）。

[0031] 图4B显示了相比于杂乱的dsRNA转染的细胞在星形孢菌素处理时PME-1特异性或CIP2A特异性dsRNA的细胞凋亡的诱导潜能之间的比较。

[0032] 图4C为蛋白质印迹图像，其证明了杂乱的dsRNA (Scr.)、PME-1特异性dsRNA(PME-1)和CIP2A特异性dsRNA(CIP2A)在人类成胶质细胞瘤T98G细胞中的PME-1和CIP2A沉默活性。

[0033] 图5A显示在用杂乱的或PME-1特异性dsRNA转染48小时，并用所示浓度的不同星形孢菌素衍生物/衍生物处理另外24小时之后T98G成胶质细胞瘤细胞中的细胞凋亡性核断裂的量。

[0034] 图5B表示在用所示浓度的星形孢菌素衍生物PKC412和K252a处理2天之后杂乱的或PME-1特异性dsRNA转染的T98G成胶质细胞瘤细胞的克隆生成潜能。

[0035] 图5C和5D分别表示在用所示浓度的星形孢菌素(STS)、 PKC412和K252a处理2天之后杂乱的或PME-1特异性dsRNA转染的U251MG和U87MG成胶质细胞瘤细胞的克隆生成潜能。

[0036] 发明详述

[0037] 本发明基于以下意想不到的发现：可将PME-1在神经胶质瘤细胞中的表达水平而非另一PP2A抑制剂蛋白CIP2A的表达水平用于选择所讨论的患者对其易感的脑癌疗法。在一些实施方案中，PME-1的表达水平可用于预测相应癌症对某些小分子化学治疗剂即星形孢菌素(STS)衍生物的敏感性。

[0038] 更详细而言，现已发现具有未受损水平的PME-1表达的脑癌细胞与PME-1表达阳性的脑癌细胞相比统计学上显著更好地响应于用STS衍生物的处理(实施例2)。因此设想在从脑癌患者获得的样品中的PME-1的表达水平可用作分层标准，用于鉴别有可能受益于用STS衍生物的治疗的个体和不大可能受益于该治疗的个体。

[0039] 如本文使用的术语“STS衍生物”是指结构上与STS类似的任何化合物，其包括但不限于式(I)的化合物及其任何立体异构体、外消旋体、盐、溶剂化物或前药。所述式(I)的化合物具有以下通用结构：

[0040]

[0041] 其中

[0042] R’为H或烷基；

[0043] R’’为H或烷氧基；

[0044] R1和R2为H或一起形成氧代；

[0045] R3和R4独立地为H、OH或一起形成氧代；

[0046] R5、R6、R6’、R7和R8独立地选自H、烷基、烷氧基、羟基、羟烷基、烷氧羰基或单-和二烷基氨基；

[0047] X为CH2或O；和

[0048] n为0或1。

[0049] 前面提到的术语“烷基”包括直链的和支链的C1-6烷基基团两者，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基等等。在一些实施方案中，烷基基团为含有1-3个碳原子的C1-3烷基基团。

[0050] 如本文使用的术语“烷氧基”是指直链的和支链的C1-6烷氧基基团两者，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基等等。在一些实施方案中，所述烷氧基基团为含1-3个碳原子的C1-3烷氧基基团。

[0051] 如本文使用的术语“羟烷基”是指被-OH取代的任何上面提及的C1-6烷基基团。

[0052] 如本文使用的术语“烷氧羰基”是指被-COOH取代的任何上面提及的C1-6烷氧基基团。

[0053] 术语“氨基”是指-NH2。

[0054] 术语“单烷基氨基”包括用氨基基团取代的任何上面提及的烷基基团。

[0055] 术语“二烷基氨基”是指用两个氨基基团取代的任何上面提及的烷基基团。

[0056] 如本文使用的术语“立体异构体”为对单个分子的所有异构体的通称，所述异构体仅在其原子空间取向中不同。它包括对映异构体和具有超过一个手性中心的相互不为镜像的化合物的异构体(非对映异构体)。

[0057] 如本文使用的术语“手性中心”或“不对称中心”是指与之连接着四个不同基团的碳原子。

[0058] 术语“对映异构体”是指不可叠加在它的镜像上的并由此旋光的分子，其中该对映异构体以一个方向旋转偏振光平面而它的镜像以相反方向旋转偏振光平面。

[0059] 术语“外消旋体”是指相等份的对映异构体的混合物并且其为非旋光的。

[0060] 式(I)的STS衍生物的非限制性实施例包括以下：

[0061] 星形孢菌素(STS)；化学名称[9S-(9α,10β,11β,13α)]-2,3,10,11,12,13-六氢-10-甲氧基-9-甲基-11-(甲氨基)-9,13-环氧-1H,9H-二吲哚并[1,2,3-gh:3',2',1'-lm]吡咯并-[3,4-j][1,7]苯并二氮芳壬(diazonin)-1-酮，CAS号62996-74-1：

[0062]

[0063] PKC412，也被称为米哚妥林、4'-N-苯甲酰星形孢菌素或CGP 41251；化学名称[9S-(9α,10β,11β,13α)]-N-(2,3,10,11,12,13-六氢-10-甲氧基-9-甲基-1-氧代-9,13-环氧-1H,9H-二吲哚并[1,2,3-gh:3',2',1'-lm]吡咯并-[3,4-j][1,7]苯并二氮芳壬-11-基)-N-甲基苯甲酰胺；CAS号120685-11-2：

[0064]

[0065] K252a,也被称为SF 2370；化学名称9S,10R,12R)-2,3,9,10,11,12-六氢-10-羟基-9-甲基-1-氧代-9,12-环氧-1H-二吲哚并[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]吡咯并-[3,4-i][1,6]苯并二氮芳辛-10-甲酸甲基酯；CAS号99533-80-9:

[0066]

[0067] UCN-01,也被称为7-羟基-星形孢菌素；化学名称(9S)-2,3,10,11,12,13-六氢-3α-羟基-10α-甲氧基-9-甲基-11α-甲氨基-9β,13β-环氧-1H,9H-二吲哚并[1,2,3-gh:3',2',1'-lm]吡咯并-[3,4-j][1,7]苯并二氮芳壬-1-酮；CAS号112953-11-4：

[0068]

[0069] CEP-701，也被称为来他替尼（Lestaurtinib）；化学名称(9S,10S,12R)-2,3,9,10,11,12-六氢-10-羟基-10-(羟甲基)-9-甲基-9,12-环氧-1H-二吲哚并[1,2,3-fg:3',2',
1'-kl]吡咯并-[3,4-i][1,6]苯并二氮芳辛-1-酮；CAS号111358-88-4：

[0070] ，和

[0071] SB-218078；化学名称9,10,11,12-四氢-9,12-环氧-1H-二吲哚并[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]吡咯并-[3,4-i][1,6]苯并二氮芳辛-1,3(2H)-二酮；CAS号135897-06-2：

[0072]

[0073] 本文中，表述“对用STS衍生物的治疗响应”等同于表述“对STS衍生物敏感”和“对用STS衍生物的治疗易感”，并意指STS衍生物在待向其给予STS衍生物的患者中可潜在地具有治疗效果。

[0074] 如本文使用的术语“治疗”和“治疗效果”并不仅指疾病的完全治愈，而且还指疾病或其相关症状的预防、缓解和改善。术语“治疗”和“疗法”可互换地使用。因此，术语“癌症疗法”包括，例如，癌症进展、肿瘤大小、和/或转移的数量的抑制或稳定。

[0075] 在患者中的治疗效果可通过对于治疗癌症相关病症的临床领域中具有普通技术的那些人员已知的任何方法而监控。这类方法包括但不限于X线断层术和癌症标记物的检测。

[0076] 本文中，术语“患者”是指需要脑癌疗法的人类或动物个体。因此，本发明的方法适用于人类和兽医应用两者。

[0077] 本文中，术语“神经胶质瘤”是指由神经胶质细胞所产生的原发性脑肿瘤并包括星形细胞瘤例如少年毛细胞性星形细胞瘤、低级星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤或成胶质细胞瘤、少突神经胶质瘤和室管膜细胞瘤。

[0078] 从神经胶质瘤患者获得的外科或活检样品为用以分析PME-1的表达水平的典型样品种类。依据一些实施方案，从患病的脑组织获得的外科或活检样品也含有邻近的健康的组织以便能够在所述组织中的PME-1表达水平之间进行比较。组织样本中PME-1的表达水平可通过本领域已知的任何合适的直接或间接的检测方法而确定。这类方法包括但不限于使用PME-1特异性抗体的免疫组织化学法。这类抗体是在本领域可得的并且另外的抗PME-1抗体可如技术人员已知地开发。抗PME-1抗体结合的检测可通过标签例如荧光标签、发光标签、生色标签、光度测定（fotometric）标签或放射性标签实施。此外，设想PME-1蛋白表达水平可与PME-1 mRNA表达水平相关并可例如通过如本领域已知的实时PCR确定。

[0079] 术语“增加的PME-1表达”或“PME-1表达阳性”意指与相关非恶性组织相比明显增加的PME-1表达。在一些实施方案中，所述明显增加为统计上显著的。用于评估PME-1表达水平中差异的显著性的统计学方法为本领域中可容易得到的。

[0080] 在一些实施方案中，PME-1的表达水平与对应的健康组织相比至少为1.5倍、优选至少2倍，以便被看作为增加的。

[0081] 本文中，术语“未受损的PME-1表达”意指患病组织与对应的健康组织相比不表达明显更高水平的PME-1。

[0082] 但是，在一些实施方中，PME-1的表达与对应的非恶性组织相比可微微增加（即少于1.5倍），仍看作未受损的。

[0083] 依据本发明的实施方案，其神经胶质瘤组织为PME-1阳性的患者与其神经胶质瘤组织表达未受损水平的PME-1的对应患者相比有可能从用STS衍生物的治疗中受益更少。因此，用STS衍生物的治疗之外的治疗方案被推荐用于PME-1表达阳性的患者。

[0084] 另一方面，设想其神经胶质瘤组织呈现增加的PME-1表达的患者可从PME-1表达的沉默（在转录或转录后水平上）和用STS衍生物的治疗的组合受益。这种组合疗法可同时地、序贯地或分别地给予。在一些实施方案中，所述组合疗法可包括恶性组织的外科手术。

[0085] 用于沉默PME-1表达的工具和方法在本领域中为可容易得到的，包括但不限于RNA干扰(RNAi)。适合于介导RNAi的小RNA非限制性实例包括小双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)、切酶底物siRNA (DsiRNA)、人造微小RNA (miRNA)前体和短发夹RNA (shRNA)。PME-1特异性siRNA分子已经公开于例如美国专利公开US 2009/182134 (SEQ ID NO:s 5-
34)，而且Finnish专利申请FI 20115640公开PME-1特异性siRNA和shRNA (SEQ ID NO:s 
35-40)。如技术人员已知的，另外的dsRNA分子可通过使用商售的和非商售的算法而设计。

[0086] 如本领域周知，沉默PME-1表达的其它方式的实例包括单链反义寡核苷酸(RNA或DNA)和核酶技术的使用。

[0087] 被用于沉默PME-1基因表达的任何分子可根据本领域已知的标准方法修饰。

[0088] 根据本发明另外的实施方案，其神经胶质瘤组织表达未受损水平的PME-1的患者有可能从用STS衍生物的单一疗法中受益。如本文使用的术语“单一疗法”是指用至少一种STS衍生物的疗法，而不沉默PME-1表达。如果需要，所述STS疗法可与外科手术和/或与任何协同性或相加性化学疗法组合。

[0089] 对于本领域技术人员显而易见的是，随着技术进步，本发明概念可用多种方式执行。本发明及其实施方案不限于上面描述的实例而可在权利要求的范围内变化。实施例

[0090] 材料和方法

[0091] 真核细胞培养和小干扰RNA(siRNA)转染：对于此研究，我们使用T98G、U118MG、U251MG和U87MG人类成胶质细胞瘤细胞系。将T98G和U251MG细胞在Eagle’s MEM中、U118MG在DMEM(Sigma-Aldrich)中和U87MG在DMEM/F-12(Gibco Products，Invitrogen)培养基中，在5% CO2的潮湿空气中于37℃下培养，所述培养基用10%热灭活的FCS和青霉素(100单位/mL)–链霉素(100 Ag/mL)补充。小干扰RNA(siRNA)转染用Lipofectamine RNAiMAX试剂(Invitrogen)根据厂商的说明书实施。在除CellTiter-glo和Caspase-glo测定（其中在96-孔板中进行反向转染）外的所有实验中使用正向转染方案进行转染。使用以下siRNA序列：杂乱的(5’-GUA ACA AUG AGA GCA CGG C-3’；SEQ ID NO:4)、PME-1 (5’-GGA AGU GAG UCU AUA AGC A-3’；SEQ ID NO:1)、PME-1 (5’-UCA UAG AGG AAG AAG AAG A-3’；SEQ ID NO:2)或PME-1 (5’-AGG UCA AGA AUC CUG AAG A-3’；SEQ ID NO:3)。

[0092] 化学抑制剂和药物：含有H-7、H-8、H-89、氯化白屈菜季铵碱(Chl Cl)、舒尼替尼（Sunitinib）、坦度替尼（Tandutinib）、拉帕替尼（Lapatinib）、凡德他尼（Vandetanib）、PKC412和K252a）的小抑制剂筛选集从Biaffin GmbH & Co KG购买。盐酸托泊替康从Selleck Chemicals购买。UO126、 LY 294002、RO-31-8220、GÖ 6976和SB 218078从Calbiochem购买。星形孢菌素(STS)、CEP-701、UCN-01从Sigma-Aldrich获得；替莫唑胺(TMZ)、Arcyriaflavin-A和K252c来自Tocris Bioscience；蝴蝶霉素（Rebeccamycin）来自Enzo Life Sciences，Enzastaurin来自LC laboratories。泛胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK、PP2A抑制剂冈田酸和活化剂硒酸钠和木酮糖-5-磷酸酯从Sigma-Aldrich获得。另一PP2A活化剂FTY720从Cayman chemicals购买。人重组Fc-FasL融合蛋白和人重组异亮氨酸-拉链TRAIL(TRAIL)为来自John Eriksson教授(Åbo Akademi大学)的赠品。所有化学品如供应商推荐在水或DMSO中重构。

[0093] 蛋白质印迹法和抗体：将经培养和处理的细胞于2×SDS样品缓冲液/ Laemmli缓冲液裂解，煮沸并通过SDS-PAGE使用10%丙烯酰胺凝胶而解析。将蛋白转移至PVDF膜。将膜封闭并与在5%牛奶-PBS-Tween20中的所需稀释度的一抗和1:5000稀释度的二抗孵育所需持续时间并通过增强的化学发光(ECL)显影。抗PME-1(克隆H-226)和抗CIP2A(克隆2G10-3B5) 抗体(1:1000稀释度)从Santa Cruz Biotechnology购买。抗肌动蛋白(克隆AC-40)抗体(1:10,000稀释度)从Sigma-Aldrich购买。对蛋白质印迹的密度计分析使用MCID图像分析仪软件进行。

[0094] 细胞成活力测定：细胞成活力通过CellTiter-glo (CTG)测定（其测量细胞的ATP水平作为有代谢活性和有成活力的细胞的指示物）确定。CTG试剂盒从Promega Corp.购买且遵照其建议实施测定。测定在白色聚苯乙烯96孔板(Nunc, Thermo Fisher Scientific Inc.)中实施并且用Perkin Elmer Victor2读板器测量发光。

[0095] 胱天蛋白酶-3和-7活性的分析：通过基于发光的方法测量胱天蛋白酶-3和-7的活性，所述方法利用含胱天蛋白酶-3和-7靶标肽DEVD的底物，被称为Caspase-glo 3/7测定(Promega Corp.)。测定依据厂商的说明书在白色聚苯乙烯96孔板(Nunc, Thermo Fisher Scientific Inc.)中实施并用Perkin Elmer Victor2读板器测量发光。

[0096] 通过亚-G0/G1级分估算的细胞凋亡测定：将含用碘化丙锭(PI)染色的断裂的核的亚-G0/G1级分的百分比作为细胞凋亡细胞的量度。将3.5-4×104个细胞铺板在24孔板中，用siRNA转染48小时，并随后在新鲜培养基中用所示浓度的测试化合物处理。在处理24小时之后，将漂浮和附着的细胞通过离心收获。将细胞沉淀物再悬浮于400µl低渗PI缓冲液（其含有在PBS中的40mM柠檬酸三钠(Merck)、0.3% Triton X-100 (Sigma-Aldrich)）和50µg/ml碘化丙锭(Sigma-Aldrich)），并在黑暗中于室温下孵育10分钟。分别使用FACScan流式细胞仪和软件(Becton Dickinson)实施PI染色核的流式细胞计数分析和分析所记录的数据。

[0097] 在使用泛胱天蛋白酶抑制剂的实验中，从转染后18小时开始将细胞保持在含30µM Z-VAD-FMK的生长培养基中直至PI染色。

[0098] 集落形成测定：让以非常低的密度(4-6 x 103)铺板于6孔板中的细胞生长约7天直到它们形成小集落。随后依据厂商的说明书使用Lipofectamine RNAiMAX试剂(Invitrogen)用杂乱的或PME-1 siRNA转染这些细胞。在48小时之后，用所示浓度的化学药物处理另外48小时。将细胞集落用PBS洗涤，在室温下用3.7%甲醛固定和用0.2%结晶紫溶液(其用10%乙醇制成)染色各15分钟。过量的染剂通过用PBS重复洗涤除去。将板干燥，用Olympus SP-600UZ照相机或Epson perfection V700扫描仪成像并用ImageJ分析。

[0099] 统计学分析：两组数据的平均值之间差异的显著水平使用非配对斯氏t检验（unpaired Student’s t-test），假设样本均值间相等的方差而评估。所有p-值为双尾的。将具有概率值p<0.05的参数描述为统计学上显著的和具有概率值p<0.001的参数描述为高度显著性差异。

[0100] 结果

[0101] 为研究PME-1在癌症细胞存活和对不同化学药物的敏感性中的作用，用PME-1 siRNA瞬时转染人类成胶质细胞瘤T98G细胞72小时以有效降低PME-1蛋白水平(图1A)。用不同的化学药物处理含正常或降低水平的PME-1的T98G细胞(分别用在SEQ ID NO:4中描述的杂乱的siRNA或在SEQ ID NO:1中描述的PME-1 siRNA转染的细胞)，所述化学药物包括丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶的广泛特异性抑制剂(H7、H8、H89、氯化白屈菜季铵碱、UO126、LY 294002和星形孢菌素)、酪氨酸激酶的抑制剂(舒尼替尼、坦度替尼、拉帕替尼和凡德他尼)、DNA拓扑异构酶I抑制剂(托泊替康)和DNA甲基化药物替莫唑胺(TMZ)（其目前被用于治疗多形性成胶质细胞瘤(GBM)）。

[0102] 对siRNA转染48小时的T98G细胞给予药物处理24小时并随后将其裂解，并将它们的核使用低渗的碘化丙锭缓冲液染色。通过流式细胞术(FACS)对裂解物分析断裂的核的亚-G0/G1级分中的变化(图1B)。核的浓缩和断裂是重要的细胞凋亡的生化特征并且亚-G0/G1分析已经广泛用于细胞凋亡的检测(FEBS Lett., 1986, 194(2):347-50; Cytometry, 1991, 12(4):323-329; Nature Protocols, 2006, 1:1458-1461)。

[0103] 如图1B中所示，表达未受损水平的PME-1的T98G细胞不良好地响应于用除TMZ和STS之外的药物处理。然而，PME-1的缺失显著地增加细胞对STS的敏感性，如通过被诱导的非常高水平的核断裂判断。PME-1的缺失某种程度上增加了所有测试的化学品的细胞凋亡诱导效果，但仅H7、舒尼替尼、LY 294002和TMZ的效果被认为中等的。换句话说，PME-1缺失的协同作用被发现对STS为特异的，因为用多数化学化合物(图1B)或用细胞死亡诱导配体FasL (重组Fc-FasL融合蛋白)和TRAIL (图1C)的细胞处理没有展现出相同的趋势。

[0104] 此外，STS被发现在杂乱的siRNA转染的细胞中不诱导细胞死亡的浓度下以剂量依赖性方式在PME-1缺失的细胞中诱导细胞凋亡(图1D)。然而，在高于50 nM的浓度下，即使在对照(杂乱的siRNA转染的)T98G细胞中单独的STS也开始诱导细胞死亡。

[0105] 接着，PME-1表达对成胶质细胞瘤细胞对STS的敏感性的作用通过集落形成测定在T98G成胶质细胞瘤细胞和另一成胶质细胞瘤细胞系U118MG中测试。对于此实验，让这些细胞在6孔板中生长直至形成小集落，将所述小集落随后用杂乱的或PME-1 siRNA转染48小时，接着用处于所示浓度的STS处理另外48小时。将集落用甲醛固定，用结晶紫染色和用Image J分析图像。表达未受损水平的PME-1的细胞没有良好响应于STS处理，然而PME-1缺失使细胞敏化并导致集落几乎完全丢失(图1E和1F)。用两种成胶质细胞瘤细胞系都获得类似结果。

[0106] 为排除在上面的实验中使用的PME-1 siRNA(SEQ ID NO: 1)序列特异性脱靶作用的可能性，将三种不同的PME-1特异性siRNA序列(SEQ ID NO:s 1-3)转染至T98G细胞并且在STS处理之后分析细胞凋亡性核断裂(图2A)。这些PME-1 siRNA的效力通过蛋白质印迹法测量(图2B)，并将条带强度定量和针对β-肌动蛋白标准化(图2C)。所有PME-1 siRNA序列能够使成胶质细胞瘤T98G细胞对STS介导的细胞凋亡敏化。为消除任何可能的由杂乱的siRNA的转染引起的背景作用，用渐增浓度的STS处理未转染的T98G细胞并将这些细胞中的细胞凋亡性核断裂与接收PME-1 siRNA和相同浓度的STS的细胞作比较(图2D)。使用单独的STS在超过30nM的浓度下我们观察到有限量的细胞死亡。另一方面，PME-1下调的细胞对于STS诱导的细胞死亡甚至在此实验使用的最低浓度下高度敏感。

[0107] 为研究由STS在PME-1缺失的细胞中诱导的细胞杀伤的特征，我们首先通过Cell-titer-glo (CTG)测定分析了PME-1 siRNA和STS处理的这种双重组合对成胶质细胞瘤T98G细胞成活力的作用(图3A)。该结果与亚-G0/G1分析非常相关，因为PME-1缺失降低小部分细胞的成活力但是当同一种细胞也接受STS处理时，在细胞成活力中有急剧的降低。

[0108] 细胞凋亡另一生化特性为效应子半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶胱天蛋白酶-3和7的激活。单独的PME-1缺失被发现增加胱天蛋白酶-3/7活性至超过2倍，在与STS处理组合的情况下所述活性升高至超过6倍(图3B)，这暗示胱天蛋白酶涉及细胞凋亡诱导。为进一步验证胱天蛋白酶诱导的作用，在整个实验中用泛胱天蛋白酶抑制剂z-VAD-fmk处理接受PME-1 siRNA和STS处理的细胞，并通过核断裂测定分析细胞凋亡(图3C)。我们发现在PME-1缺失的细胞中通过抑制胱天蛋白酶活性完全逆转STS介导的细胞凋亡，这暗示此细胞凋亡完全依赖于胱天蛋白酶的诱导。

[0109] 然后，我们的焦点在于研究在PME-1介导的成胶质细胞瘤细胞对STS诱导的细胞凋亡的抗性后面的可能的机制。由于PME-1的唯一确立的直接靶标为PP2A，我们使用PP2A的化学抑制剂冈田酸(OA)，推测它应该逆转PME-1的抑制作用并由此促进细胞存活。的确，在STS处理之前用OA预处理成胶质细胞瘤T98G细胞24小时足以以剂量依赖性方式拯救细胞免于PME-1 siRNA和STS介导的细胞凋亡(图4A)。这引导我们进一步调查这些PP2A介导的细胞凋亡作用是对PME-1是特异的还是与其它PP2A抑制性/调节性蛋白共有的，我们比较了CIP2A和PME-1缺失使成胶质细胞瘤细胞对响应于STS处理的细胞凋亡敏化的能力。我们发现CIP2A下调非常小的程度地增加细胞凋亡，因此其不可被看作如由PME-1缺失的细胞介导的协同作用(图4B)，这支持下列观点：这些作用对于PME-1下调是特异的。经其各自的siRNA对CIP2A和PME-1有效的下调通过蛋白质印迹法验证(图4C)。

[0110] 所有上述结果表明PME-1阳性的成胶质细胞瘤细胞没有良好响应于用STS的处理。另一方面，具有未受损PME-1表达的成胶质细胞瘤细胞对STS介导的细胞凋亡是敏感的。

[0111] 因为在文献中已经将STS记载为激酶的广泛特异性抑制剂，它不被认为是临床相关治疗剂。但是，一些STS衍生物是已知的，其为远更特异性的并具有更少的副作用，目前处于临床试验中用于治疗不同疾病。因此，我们在我们的实验设置中以不同浓度用它的衍生物：PKC412、K252a、RO-31-8220、GÖ 6976、SB 218078、Arcyriaflavin A、K252c、蝴蝶霉素、Enzastaurin、UCN-01或CEP-701代替STS(图5A)。出乎我们的意料，我们发现PKC-412、K252a、UCN-01和CEP-701能够在PME-1缺失的成胶质细胞瘤细胞中以甚至比STS自身更高的水平诱导细胞凋亡。SB 218078在更高浓度下诱导中等水平的细胞凋亡。表达未受损水平的PME-1的成胶质细胞瘤细胞不响应于任何测试的STS衍生物。

[0112] 在T98G细胞中使用两种活性药物PKC412和K252a的集落形成测定也证实上面的发现(图5B)。为了避免细胞系特异性作用，我们也研究了细胞凋亡敏化药物STS、PKC412和K252a在其它PME-1缺失的成胶质细胞瘤细胞系U251MG和U87MG中的效力。在所有研究的细胞系中PME-1缺失增强了STS、PKC412和K252a的细胞杀伤活性，尽管在处理组合的效力中有细胞类型依赖性差异(图5C和5D)。