软骨藻酸分子印迹固相萃取小柱及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种软骨藻酸分子印迹固相萃取小柱及其制备方法，是将模板分子1,3,5-三羧基戊烷、功能单体2-(三氟甲基)丙烯酸、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯按1:8:40摩尔比加入致孔剂乙腈中，混匀后加入引发剂偶氮二异丁腈，密封水浴反应得到蓬松的粉末状软骨藻酸印迹分子聚合物，经索氏提取和酸碱交替洗脱去除杂质后过350目标准筛，将所得聚合物湿法装填入SPE空柱。本发明的分子印迹固相萃取小柱可选择性吸附软骨藻酸，吸附能力强，高效、灵敏，用于海水中痕量软骨藻酸的选择性分离富集，能够将海水中的软骨藻酸浓缩500倍，可快速检测海水中的痕量软骨藻酸。

权利要求

1.一种软骨藻酸分子印迹固相萃取小柱，其特征在于：将模板分子1,3,5-三羧基戊烷、功能单体2-(三氟甲基)丙烯酸、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯聚合成软骨藻素印迹分子聚合物，填充在聚丙烯外壳的固相萃取小柱内；

软骨藻酸分子印迹固相萃取小柱制备方法包括以下步骤：

1.1在冰浴中将模板分子1,3,5-三羧基戊烷、功能单体2-(三氟甲基)丙烯酸加到致孔剂中，混匀后加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯，之后加入引发剂；然后移出冰浴，通氮气除氧5min，密封60℃水浴反应24h，得到蓬松的粉末状软骨藻素印迹分子聚合物；

1.2将所得软骨藻素印迹分子聚合物研磨后60℃烘干，将烘干后的粉末用3层慢速定量滤纸包好，在索氏提取器中用5％(v/v)的甲酸甲醇进行提取，提取时间为48h，水浴温度为

80℃，除去模板分子及未反应的化合物；

1.3将索氏提取后的软骨藻素印迹分子聚合物用碱和酸交替进行洗脱，直至紫外分光光度计检测不出模板分子为止，最后用甲醇将酸洗净，60℃下烘干，过筛；

1.4称取100mg软骨藻素印迹分子聚合物，湿法装填入3mL固相萃取小柱内。

2.根据权利要求1所述的软骨藻酸分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其特征在于，所述的模板分子1,3,5-三羧基戊烷、功能单体三氟甲基酸丙烯酸、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯的用量摩尔比为1:8:40。

3.根据权利要求1所述的软骨藻酸分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其特征在于，所述的致孔剂为乙腈，用量为35mL。

4.根据权利要求1所述的软骨藻酸分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其特征在于，所述的引发剂为偶氮二异丁腈，用量为10mg。

5.根据权利要求1所述的软骨藻酸分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其特征在于，所述的过筛是用350目标准筛对聚合物进行筛选，取小于350目的颗粒。

6.根据权利要求1所述的软骨藻酸分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其特征在于，所述的湿法是在固相萃取小柱中装入一块筛板，将聚合物粉末加入2mL甲醇中配成悬浊液，将悬浊液加入固相萃取小柱中，同时用甲醇润洗一下，真空抽干，装入另一块筛板，压实，在柱中加入3mL甲醇，真空抽干后完成装柱。

7.软骨藻酸分子印迹固相萃取小柱在海水中痕量软骨藻酸的选择性分离富集中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的富集是将海水中的软骨藻酸浓缩

500倍。

说明书

软骨藻酸分子印迹固相萃取小柱及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及检测技术中的样品前处理，尤其涉及一种软骨藻酸分子印迹固相萃取小柱及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 近三十年来，海洋环境污染日趋加重，赤潮频繁发生，软骨藻酸作为一种兴奋性脯氨酸衍生物和神经毒素，主要由形成赤潮的一种硅藻-多列拟菱形藻产生，其最早是在1987年加拿大因食用紫贻贝而造成的食物中毒事件中被发现。软骨藻酸可影响人和动物的消化道、心血管系统、中枢神经系统，它对与内脏功能有关的脑干区域具有兴奋作用，对与记忆有关的脑区域具有明显的神经毒性作用。中毒者出现胃肠道症状，以及一种或多种神经性障碍如神志不清、方位不辨、记忆力丧失，严重者心脏病发作、昏迷甚至死亡，中毒者即使在病愈后仍然丧失记忆长达十几个月，因此称之为记忆丧失性贝类中毒。软骨藻酸作为一类与赤潮发生密切相关的神经毒素严重危害渔业、水产业经济的发展，并影响水生生物和人类的健康。在加拿大、美国海岸，软骨藻酸引起的危害事件不断被报道，目前我国检出软骨藻酸的报导十分罕见，但在我国海区，已经检测到多种能产生软骨藻酸毒素的拟菱形藻。目前，我国关于痕量软骨藻酸的检测方法并不完善，尤其是针对海水的研究非常少，因此，迫切需要研究软骨藻酸的新型检测技术，建立快速、简捷、灵敏的痕量软骨藻酸检测方法，为掌握该类藻毒素的信息和采取有效手段防止危害发生提供信息。

[0003] 海水基质复杂且软骨藻酸在海水中的浓度过低，检测前样品必须通过预处理对痕量软骨藻酸进行分离富集。因此，改进预处理方法是发展软骨藻酸快速检测法的重要手段。软骨藻酸的分离富集主要采用固相萃取技术(solid phase extraction,SPE)，目前使用较普遍的是C18柱、SAX(阴离子交换)柱、HLB柱等，这些SPE柱中的材料虽然能够吸附软骨藻酸，但同时也会吸附海水中的其他杂质，对软骨藻酸的测定造成干扰。因此需要研制新型吸附材料填入SPE柱，使之既能够强力吸附软骨藻酸，又不会或较少吸附其他物质。分子印迹技术(molecular imprinting technique,MIT)是通过人工合成手段获得在空间结构和结合位点上与模板分子完全匹配、具有分子识别功能的聚合物(即分子印迹聚合物，molecularly imprinted polymer，MIP)的一种新型实验制备技术。目前MIT已应用于仿生传感器、固相萃取、酶催化模拟等领域，其具有构效预定性、选择识别性和广泛实用性等特点。自从1994年Sellergren将MIP用于戊脒的固相萃取之后，基于MIP的固相萃取(MISPE)技术已被广泛应用于药物、生物、食品、环境样品分析，作为检测药物、生物大分子、烟碱、除草剂、农药等的前处理技术。将MIT与SPE两项技术联用是目前较为新颖的研究方向，MIP具有较高的选择性和对目标分子的富集能力，将其作为SPE的填充材料，可以弥补现有SPE填料选择性差的缺点，从而大大提高选择性和准确性，降低检出限，尤其适合于复杂样品中痕量目标物的萃取，具有良好的应用前景。

发明内容

[0004] 本发明的目的，就是为了解决上述现有技术存在的问题，提供一种软骨藻酸分子印迹固相萃取小柱及其制备方法和应用。

[0005] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种软骨藻酸分子印迹固相萃取小柱，将模板分子1,3,5-三羧基戊烷、功能单体2-(三氟甲基)丙烯酸、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯聚合成软骨藻素印迹分子聚合物，填充在聚丙烯外壳的固相萃取小柱内。

[0006] 一种软骨藻酸分子印迹固相萃取小柱的制备方法，包括以下步骤：

[0007] 2.1在冰浴中将模板分子1,3,5-三羧基戊烷、功能单体2-(三氟甲基)丙烯酸加到致孔剂中，混匀后加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯，之后加入引发剂；然后移出冰浴，通氮气除氧5min，密封60℃水浴反应24h，得到蓬松的粉末状软骨藻素印迹分子聚合物；

[0008] 2.2将所得软骨藻素印迹分子聚合物研磨后60℃烘干，将烘干后的粉末用3层慢速定量滤纸包好，在索氏提取器中用5％(v/v)的甲酸甲醇进行提取，提取时间为48h，水浴温度为80℃，除去模板分子及未反应的化合物；

[0009] 2.3将索氏提取后的软骨藻素印迹分子聚合物用碱和酸交替进行洗脱，直至紫外分光光度计检测不出模板分子为止，最后用甲醇将酸洗净，60℃下烘干，过筛；

[0010] 2.4称取100mg软骨藻素印迹分子聚合物，湿法装填入3mL固相萃取小柱内。

[0011] 所述的模板分子1,3,5-三羧基戊烷、功能单体三氟甲基酸丙烯酸、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯的用量摩尔比为1:8:40。

[0012] 所述的致孔剂为乙腈，用量为35mL。

[0013] 所述的引发剂为偶氮二异丁腈，用量为10mg。

[0014] 所述的过筛是用350目标准筛对聚合物进行筛选，取小于350目的颗粒。

[0015] 所述的湿法是在固相萃取小柱中装入一块筛板，将聚合物粉末加入2mL甲醇中配成悬浊液，将悬浊液加入固相萃取小柱中，同时用甲醇润洗一下，真空抽干，装入另一块筛板，压实，在柱中加入3mL甲醇，真空抽干后完成装柱。

[0016] 软骨藻酸分子印迹固相萃取小柱在海水中痕量软骨藻酸的选择性分离富集中的应用。

[0017] 所述的富集是将海水中的软骨藻酸浓缩500倍。

[0018] 本发明合成的软骨藻酸分子印迹聚合物是一种蓬松的粉末状聚合物，它对软骨藻酸分子的立体结构具有“记忆”功能，可选择性吸附软骨藻酸，吸附能力强。本发明合成的软骨藻酸分子印迹聚合物作为固相萃取小柱的填料，可应用于海水中痕量软骨藻酸的高选择性分离富集。本发明制备的固相萃取小柱与常规的C18、SAX和HLB固相萃取小柱相比，专一性更好，对痕量软骨藻酸的检测效果更佳。

附图说明

[0019] 图1、图2为软骨藻酸分子印迹聚合物的电镜扫描图片。

[0020] 图3为软骨藻酸分子印迹聚合物的吸附等温线。

[0021] 图4、图5为不同模板分子-功能单体配比下的分子印迹聚合物吸附等温线。

[0022] 图6为不同引发剂用量下的分子印迹聚合物吸附等温线。

具体实施方式

[0023] 下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

[0024] 实施例1.

[0025] 将0.2mmol模板分子1,3,5-三羧基戊烷(1,3,5-PeTA)、1mmol功能单体TFMAA加到35mL致孔剂乙腈中，混匀后加入5mmol交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，之后加入
10mg引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，以上过程在冰浴中进行。然后通氮气除氧5min，密封60℃水浴反应24h，得到蓬松的粉末状聚合物。上述聚合物稍加研磨后60℃烘干，通过索氏提取和酸碱交替洗脱除去模板分子及未反应的化合物，最后用甲醇将聚合物中的酸洗净，60℃下烘干，过350目筛，称取100mg分子印迹聚合物，湿法装填入3mL SPE空柱。

[0026] 实施例2.

[0027] 与实施例1的不同之处在于：实施例2的致孔剂乙腈为10mL。

[0028] 实施例3.

[0029] 与实施例1的不同之处在于：实施例3的致孔剂乙腈为20mL。

[0030] 实施例4.

[0031] 与实施例1的不同之处在于：实施例4的致孔剂乙腈为30mL。

[0032] 实施例5.

[0033] 与实施例1的不同之处在于：实施例5的致孔剂乙腈为40mL。

[0034] 实施例6.

[0035] 与实施例1的不同之处在于：实施例6的模板分子1,3,5-三羧基戊烷(1,3,5-PeTA)为1mmol。

[0036] 实施例7.

[0037] 与实施例1的不同之处在于：实施例7的模板分子1,3,5-三羧基戊烷(1,3,5-PeTA)为0.5mmol。

[0038] 实施例8.

[0039] 与实施例1的不同之处在于：实施例8的模板分子1,3,5-三羧基戊烷(1,3,5-PeTA)为0.25mmol。

[0040] 实施例9.

[0041] 与实施例1的不同之处在于：实施例9的模板分子1,3,5-三羧基戊烷(1,3,5-PeTA)为0.167mmol。

[0042] 实施例10.

[0043] 与实施例1的不同之处在于：实施例10的模板分子1,3,5-三羧基戊烷(1,3,5-PeTA)为0.125mmol。

[0044] 实施例11.

[0045] 与实施例1的不同之处在于：实施例11的模板分子1,3,5-三羧基戊烷(1,3,5-PeTA)为0.1mmol。

[0046] 实施例12.

[0047] 与实施例1的不同之处在于：实施例12的模板分子1,3,5-三羧基戊烷(1,3,5-PeTA)为0.05mmol。

[0048] 实施例13.

[0049] 与实施例1的不同之处在于：实施例13的模板分子为己二酸。

[0050] 实施例14.

[0051] 与实施例1的不同之处在于：实施例14的模板分子为邻苯二甲酸。

[0052] 实施例15.

[0053] 与实施例1的不同之处在于：实施例15的模板分子为4,4’-OBA。

[0054] 实施例16.

[0055] 与实施例1的不同之处在于：实施例16的引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)为20mg。

[0056] 实施例17.

[0057] 与实施例1的不同之处在于：实施例17的引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)为40mg。

[0058] 聚合物的形态表征：

[0059] 四种模板分子的产物均是分散的颗粒，粒径主要分布在几百纳米到几微米之间。1,3,5-三羧基戊烷(1,3,5-PeTA)作为模板分子，模板分子与功能单体摩尔比为1:8时的电镜扫面图片如图1图2所示。

[0060] 吸附性能评价：

[0061] 本发明分子印迹聚合物的吸附变化趋势比较平缓，在吸附的前8个小时内，溶液中软骨藻酸浓度逐渐降低，直至8h后达到平衡状态，吸附动力学曲线比较平缓，较为稳定。附图3为分子印迹聚合物的吸附动力学曲线。

[0062] 致孔剂用量的影响：

[0063] 本发明以乙腈为溶剂，同时乙腈也作为致孔剂，通过增大致孔剂用量，使得其他成分处于较稀浓度，这样可避免发生聚合的颗粒团聚成块状。一般情况下，沉淀聚合法能得到较均匀的微粒，甚至是单分散的微球状聚合物。比较不同乙腈用量发现，10mL乙腈得到的聚合物颗粒粒径较大，且产量多，体系中几乎已经没有溶剂残留；20、30、35、40mL乙腈得到的颗粒从表观上没有看出太大差异；45mL乙腈制得的聚合物颗粒较小，产量也较少，且体系中残留有较多溶剂；而当乙腈用量为50mL时得到澄清溶液，没有聚合物生成。

[0064] 模板分子种类的影响：

[0065] 分子印迹聚合物对于软骨藻酸的识别与模板分子所含有的羧基数目无关，而与羧基的结构和空间距离有关。以1,3,5-PeTA、邻苯二甲酸、己二酸、4,4’-OBA分别为模板分子制备分子印迹聚合物。已二酸为模板分子时在低浓度时的吸附性能优于其他三种模板分子，但在高浓度时变化幅度大，不稳定；1,3,5-PeTA为模板时的稳定性优于其他三种模板分子，同时吸附性能也较好，因此选择1,3,5-PeTA作为制备MIP的模板分子。

[0066] 模板分子与功能单体配比的影响：

[0067] 分子印迹聚合物对于模板分子的识别，直接来源于制备过程中功能单体与模板分子相互作用形成的空穴，因而模板分子与功能单体的比例对于聚合物的吸附能力有直接的影响。模板分子与功能单体之间存在一个最佳比例。当TFMAA相对含量太低时，只有少部分1,3,5-PeTA能与TFMAA形成多作用结合的稳定配合物，而剩余的模板分子与TFMAA形成的配合物仅依靠单个或少量的作用力结合，甚至会有模板分子处于游离状态，这会造成聚合物中记录模板分子空间结构的空穴密度降低，或由于空穴中存在单个或少量结合作用位点，在识别过程中结合作用力微弱，不能有效捕获模板分子。但当加入的TFMAA相对于模板分子比例过高时，会使大量过剩的TFMAA残留在聚合物中，在识别分离过程中，游离的TFMAA的功能键同样会以非空间特异性结合作用产生竞争。这种非特异性吸附作用不利于随后样品处理中的净化作用。不同模板分子与功能单体配比的分子印迹聚合物吸附等温线如图4、图5所示。

[0068] 引发剂用量的影响：

[0069] 比较了以1,3,5-PeTA为模板分子，AIBN用量分别为10mg、20mg、40mg的分子印迹聚合物的平衡吸附容量，见附图6。随着引发剂AIBN用量的增大，聚合物的稳定性下降，当引发剂用量为40mg时，无法用单一的F模型进行拟合，相关性太低，说明结合位点的均一性较差，而10mg用量的引发剂所制备的MIP的吸附性能最好。

[0070] 实施例18

[0071] 将本发明的软骨藻酸分子印迹固相萃取小柱与传统的C18、SAX和HLB固相萃取小柱进行测试比较。

[0072] 具体SPE过程如下：

[0073] (1)活化：在SPE柱中加入3mL甲醇，再加2mL0.1mol/L盐酸过柱。

[0074] (2)上样：加1mL1mg/L软骨藻酸标准溶液(用海水定容，pH＝1)过柱，取流出液用HPLC测定软骨藻酸残留浓度。

[0075] (3)淋洗：加1mL0.4％甲酸水溶液过柱，将SPE柱抽干。

[0076] (4)洗脱：加1mL1％甲酸甲醇过柱，接流出液用氮气吹干后加水定容至1mL用HPLC检测，再加1mL1％甲酸甲醇重复上述步骤，共用2mL洗脱液。

[0077] (5)SPE柱再生：加5mL50％甲醇水溶液(含0.1MNaOH)洗去SPE柱中多余的酸及可能残留的软骨藻酸，再依次加5mL水、1mL0.1MHCl、6mL甲醇过柱，真空抽干，备用。

[0078] 具体的HPLC色谱条件如下：

[0079] 流动相A：乙腈，流动相B：0.1％三氟乙酸水溶液，A:B＝16:84(v/v)，检测波长242nm，流速1mL/min，柱温35℃，进样量10μL。

[0080] 本发明的固相萃取小柱回收率为66.35±0.81％，C18、SAX、HLB柱的回收率分别为11.08±3.47％、60.62±1.70％、75.48±3.16％。本发明的固相萃取小柱与SAX、HLB柱的回收率接近，但是其专一性更好，对痕量软骨藻酸的检测效果更佳。

[0081] 实施例19

[0082] 使用本发明的软骨藻酸分子印迹固相萃取小柱对海水进行前处理，建立HLB柱-MIP柱联用的SPE-HPLC方法，检测海水中软骨藻酸的含量。

[0083] 具体前处理过程如下：

[0084] 1.水样前处理

[0085] 海水采集后先经定量滤纸过滤除去泥沙等大颗粒杂质，后经0.22μm微孔滤膜过滤除去小颗粒杂质，4℃保存。水样测试前用1M盐酸调节pH＝3。测试水样分为空白样和加标样两份，水样加标是在500mL水样中加入1mL1mg/L的软骨藻酸标准工作液。

[0086] 2.HLB-MIP柱联用的SPE过程：

[0087] (1)HLB柱活化：在HLB柱中加入6mL甲醇，再加4mL0.1mol/L盐酸过柱。

[0088] (2)上样：加500mL水样(pH＝3)过柱，流速为2mL/min。

[0089] (3)淋洗：加1mL0.4％甲酸水溶液过柱，将HLB柱抽干。

[0090] (4)洗脱：加2mL1％甲酸甲醇过柱，接流出液用氮气吹干后加3.5％NaCl水溶液(pH＝1)定容至1mL。

[0091] (5)MIP柱活化：在NIP/MIP柱中加入3mL甲醇，再加2mL0.1mol/L盐酸过柱。

[0092] (6)上样：加(4)中定容后的溶液过柱，取流出液用HPLC测定软骨藻酸残留浓度。

[0093] (7)淋洗：加1mL0.4％甲酸水溶液过柱，将NIP/MIP柱抽干。

[0094] (8)洗脱：加1mL1％甲酸甲醇过柱，接流出液用氮气吹干后加水定容至1mL用HPLC检测，再加1mL1％甲酸甲醇重复上述步骤，共用2mL洗脱液。

[0095] (9)SPE柱再生：加5mL50％甲醇水溶液(含0.1MNaOH)洗去SPE柱中多余的酸及可能残留的软骨藻酸，再依次加5mL水、1mL0.1MHCl、6mL甲醇过柱，真空抽干，备用。

[0096] 3.HPLC色谱

[0097] 具体条件见实施例18

[0098] 4.结果分析

[0099] 为了实现海水样品进一步浓缩富集，建立了HLB-MIP柱联用的SPE-HPLC方法。该方法可将海水中的软骨藻酸浓缩500倍，检出限为20ng/L，加标回收率大于80％。表明HLB-MIP柱联用的SPE-HPLC方法能够应用于实际海水的检测，今后可直接检测海水中的软骨藻酸藻毒素，时效性强，操作简便，具有良好的应用前景。