一种抗菌蛋白

摘要

本发明属于生物化学领域公开了一种对人体无刺激性并且抑菌效果好的抗菌蛋白LYS-ABP和在LYS-ABP蛋白N末端添加有MBP的抗菌蛋白MBP-LYS-ABP及制备方法。本发明所述抗菌蛋白LYS-ABP和抗菌蛋白MBP-LYS-ABP对人体无刺激性并且抑菌效果好，抑菌效果明显优于单独的溶菌酶和抗菌肽蛋白，生物活性稳定性好。本发明所述抗菌蛋白MBP-LYS-ABP通过体外重组表达获得，易于制备，成本较低，同时抗菌蛋白MBP-LYS-ABP可溶性表达产量高，适于大量制备。本发明所述抗菌蛋白LYS-ABP通过凝血酶对重组表达制备的MBP-LYS-ABP融合蛋白进行酶切得到，易于制备，成本较低。

权利要求

1.一种抗菌蛋白，其特征在于，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

2.一种抗菌蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

3.编码权利要求1或2所述的抗菌蛋白的DNA分子。

4.编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

5.一种权利要求2所述的抗菌蛋白的制备方法，其特征在于，将编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的DNA分子重组到表达载体pMAL-p2x，转化宿主细胞，并进行表达、提取、纯化。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述重组为获取两端带有酶切位点的编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子，将其插入到表达载体pMAL-p2x的酶切位点之间并测序鉴定。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述酶切位点为EcoRI和HindIII。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌表达菌株，所述大肠杆菌表达菌株为BL21(DE3)pLysS。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述提取包括细菌收集、破碎，离心取上清。

10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述纯化为亲和层析纯化。

说明书

一种抗菌蛋白

技术领域

[0001] 本发明属于生物化学领域，特别涉及一种抗菌蛋白。

背景技术

[0002] 消毒是指杀死病原微生物、但不一定能杀死细菌芽孢的方法。用于消毒的物质叫做消毒剂。而消毒液顾名思义就是液体的消毒剂。理想的消毒剂应具备杀菌谱广、杀菌能力强、作用速度快、稳定性好、无毒、无残留、无腐蚀性、无刺激性、易溶于水、对人和动物安全及价廉易得、对环境污染程度低等特点。

[0003] 目前消毒液产品主要分为环境消毒类、常规手脚消毒液和创伤消毒液。环境消毒类消毒液是指主要应用于卫生防疫和灾区的常规消毒杀菌、游泳池、宾馆、饭店、家庭、学校、医院等公共场所消毒的产品，包括84消毒液、过氧乙酸、来苏水等。常规手脚消毒液是指主要用于手脚皮肤的产品，包括醋酸氯己定、乙醇为等。而创伤消毒液类主要应用于医院内手术或外伤，烧伤以及各种溃疡的创口消毒，以及个人常规的外伤或溃疡消毒处理，包括紫药水、双氧水、酒精等。

[0004] 目前，传统的创伤消毒液在实际应用中有许多缺点，比如紫药水，即2%的甲紫溶液，此溶液有加快伤口结痂和愈合的作用，常用于浅表皮肤、黏膜感染，但因该溶液刺激较大，不宜用在黏膜或开放创面，尤其是大创面，而且可诱发皮肤癌；双氧水，即过氧化氢，具有消毒杀菌作用，但浓度过大时易灼伤患处皮肤，且性质不稳定，存放时间不长，易失效；75%酒精可以有效去除细菌，预防伤口感染，但酒精有破坏细胞和较强的刺激性，故不能用于伤口内、破溃部位以及眼、鼻、口、阴道等部位粘膜的消毒，另外，酒精贮藏的容器应严密，用后瓶口应塞紧，防止挥发造成含量下降影响杀菌效力。

[0005] 由此可见，传统的创伤消毒液往往对伤口或患处有刺激作用。对于化学品消毒剂还存在着化学残留的问题，而对于植物提取的消毒液，存在着原料的质量不能保证一致，并且在提取过程中应用了化学溶剂，也存在着一定的化学残留的问题。

发明内容

[0006] 本发明的目的是针对现有技术的缺点，提供了一种对人体无刺激性并且抑菌效果好的抗菌蛋白，用于创伤消毒。

[0007] 为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

[0008] 一种抗菌蛋白，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

[0009] 在一些实施方案中，所述的抗菌蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

[0010] 本发明还提供了编码所述的抗菌蛋白的DNA分子。

[0011] 其中，在一些实施方案中，编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

[0012] 本发明还提供了一种氨基酸序列如SEQ ID No.2所示抗菌蛋白的制备方法，将编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的DNA分子重组到表达载体pMAL-p2x，转化宿主细胞，并进行表达、提取、纯化。

[0013] 在一些实施方案中，所述重组为获取两端带有酶切位点的编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子，将其插入到表达载体pMAL-p2x的酶切位点之间并测序鉴定。

[0014] 在一些实施方案中，所述酶切位点为EcoRI和HindIII。

[0015] 在一些实施方案中，所述大肠杆菌表达菌株为BL21（DE3）pLysS。

[0016] 在一些实施方案中，所述提取包括细菌收集、破碎，离心取上清。

[0017] 在一些实施方案中，所述纯化为亲和层析纯化及离子交换纯化。

[0018] 本发明提供了一种对人体无刺激性并且抑菌效果好的抗菌蛋白LYS-ABP，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。同时提供了在LYS-ABP蛋白N末端添加有MBP的融合目的蛋白，即抗菌蛋白MBP-LYS-ABP，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明所述抗菌蛋白LYS-ABP和抗菌蛋白MBP-LYS-ABP对人体无刺激性并且抑菌效果好，抑菌效果明显优于单独的溶菌酶和抗菌肽蛋白，生物活性稳定性好。本发明还提供了所述抗菌蛋白LYS-ABP和抗菌蛋白MBP-LYS-ABP的制备方法。本发明所述抗菌蛋白MBP-LYS-ABP通过体外重组表达获得，易于制备，成本较低，同时抗菌蛋白MBP-LYS-ABP可溶性表达产量高，适于抗菌蛋白MBP-LYS-ABP的大量制备。本发明所述抗菌蛋白LYS-ABP通过凝血酶对重组表达制备的MBP-LYS-ABP融合蛋白进行酶切得到，易于制备，成本较低，适于抗菌蛋白LYS-ABP的大量制备。

附图说明

[0019] 图1为实施例4目的蛋白的高效表达，其中；泳道A为空菌对照；泳道B为MBP-LYS-ABP融合蛋白；泳道C为分子量Marker，从上到下分别为97.4kD、66.2kD、43kD、31kD、20.1kD；箭头所指目标蛋白为抗菌蛋白MBP-LYS-ABP。

具体实施方式

[0020] 本发明公开了一种抗菌蛋白，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0021] 为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

[0022] 溶菌酶（lysozyme，LYS）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。溶菌酶主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解，从而达到杀死细菌的目的。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用，且无毒、无副作用。

[0023] 抗菌肽(antimicrobial peptide，ABP)是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，分子量在2000～7000左右，由20～60个氨基酸残基组成，抗菌肽的抗菌作用机理是抗菌肽分子可以在细菌细胞质膜上穿孔而形成离子孔道，造成细菌细胞膜结构破坏，引起胞内水溶性物质大量渗出，而最终导致细菌死亡。抗菌肽具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。抗菌肽对细菌，尤其是对某些耐药性病原菌有很强的杀伤作用。此外，某些抗菌肽对部分病毒、真菌、原虫和癌细胞等有杀灭作用，甚至能提高免疫力、加速伤口愈合过程。

[0024] 溶菌酶可以从蛋清中提取而大量得到，但这种方法存在着原材料质量不易控制，有潜在病菌污染的危险。抗菌肽可以从果蝇中提取得到，但这种方法原材料的来源不易控制，提取得到的抗菌肽产量低，活性差，质量不稳定也不易控制。此外，溶菌酶和抗菌肽生物稳定性很差，室温放置几天活性就下降至原来的50%以下，因此，溶菌酶或抗菌肽无法单独作为创伤消毒剂使用。

[0025] 本发明通过基因工程技术将溶菌酶与抗菌肽融合得到一种抗菌蛋白LYS-ABP，其具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本发明所述抗菌蛋白LYS-ABP既具有溶菌酶破坏细胞壁功能又具有抗菌肽破坏细菌细胞膜的功能，同时溶菌酶与抗菌肽产生协同效应大大增强了抗菌蛋白的杀菌效果。本发明所述抗菌蛋白LYS-ABP具有杀菌谱广、杀菌效果好、种属特异性高，无刺激性的特点，从而达到对人体无刺激性并且抑菌效果好的目的，适合用于创伤消毒。

[0026] 由于抗菌肽和溶菌酶的分子量较小，直接进行表达存在着表达量很低、极易形成包涵体的问题，从而提高了纯化的难度，增加了生产成本。本发明进一步通过基因工程技术将上述抗菌蛋白与伴侣蛋白进行融合得到一种溶菌酶、抗菌肽与伴侣蛋白融合的抗菌蛋白。

[0027] 伴侣蛋白(chaperone）是指那些协助其他大分子结构折叠/退褶、组装/解体的蛋白质，在这些大分子结构具备了正常的生物学功能后停止工作。伴侣蛋白可以防止不正确折叠中间体的形成和没有组装的蛋白亚基的不正确聚集，协助多肽链跨膜转运以及大的多亚基蛋白质的组装和解体。在抗菌蛋白LYS-ABP的N末端添加一段伴侣蛋白,使抗菌蛋白LYS-ABP与伴侣蛋白融合，可以提高抗菌蛋白LYS-ABP在大肠杆菌中的表达量，同时帮助抗菌蛋白LYS-ABP在大肠杆菌体内的正确折叠，使抗菌蛋白LYS-ABP可溶，避免形成包涵体。

[0028] 在一些实施方案中，所述伴侣蛋白为麦芽糖结合蛋白（MBP），即所述溶菌酶、抗菌肽与伴侣蛋白融合的抗菌蛋白为溶菌酶、抗菌肽与麦芽糖结合蛋白融合的抗菌蛋白MBP-LYS-ABP。

[0029] 在某些具体实施方案中，所述抗菌蛋白MBP-LYS-ABP，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

[0030] 本发明也提供了编码本发明所述抗菌蛋白的DNA分子。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的抗菌蛋白的核苷酸序列。对于编码本发明所述抗菌蛋白的DNA分子，本领域技术人员可以很容易的利用现有公知的方法制造合成。诸如，通过选择对应于构成所设计的氨基酸序列的氨基酸残基的密码子，可很容易地确定和提供相应于抗菌蛋白的氨基酸序列的DNA分子。

[0031] 在一个实施方案中，本发明提供了可以编码具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的抗菌蛋白LYS-ABP的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

[0032] 本发明还提供了所述抗菌蛋白MBP-LYS-ABP的制备方法。

[0033] 一种氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的抗菌蛋白的制备方法，将编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的DNA分子重组到表达载体pMAL-p2x，转化宿主细胞，并进行表达、提取、纯化。

[0034] pMAL-p2x融合蛋白表达载体自身含有麦芽糖结合蛋白基因序列，选择pMAL-p2x作为表达载体，将编码LYS-ABP蛋白的核苷酸序列重组到pMAL-p2x中，可以获得在LYS-ABP蛋白N末端添加有MBP的融合目的蛋白，即抗菌蛋白MBP-LYS-ABP。

[0035] 在一些实施方案中，上述制备方法的重组为获取两端带有酶切位点的编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子，将其插入到表达载体pMAL-p2x的酶切位点之间并测序鉴定。

[0036] 在一些实施方案中，所述编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子两端的酶切位点为EcoRI和HindIII。本发明所述两端带有EcoRI和HindIII酶切位点的编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

[0037] 目前利用基因工程技术获得DNA分子的方法有很多种，包括全基因合成、限制性内切酶酶切以及PCR扩增。本发明所述制备方法优选全基因合成所述DNA分子。

[0038] 在一些实施方案中，上述制备方法的重组为全基因合成SEQ ID NO:4所示核苷酸序列，将其插入到表达载体pMAL-p2x的EcoRI和HindIII位点之间并测序鉴定。

[0039] 本发明所述制备方法所述宿主细胞为大肠杆菌表达菌株，包括Rosetta系列和BL21系列菌株。在一些实施方案中，宿主细胞为BL21(DE3)pLysS菌株。BL21(DE3)pLysS带有pLysS质粒，该质粒带有编码T7溶菌酶的基因。T7溶菌酶可降低T7启动子后面的目的基因的表达背景，但是不影响诱导产生的目的蛋白表达水平。

[0040] 本发明将LYS-ABP蛋白片段重组到pMAL-p2x表达载体中，利用IPTG诱导目标蛋白的表达。IPTG是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质，广泛应用于原核细胞蛋白质表达中。

[0041] 原核细胞蛋白质表达后需要从宿主细胞中提取，然后进行分离纯化，得到目标蛋白。本发明所述制备方法所述提取包括细菌收集、破碎，离心取上清。

[0042] 进一步的，本发明通过亲和层析的方法对表达出的目标蛋白进行分离纯化。

[0043] 亲和层析是利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用而进行分离的一种层析技术。它是将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，达到分离目的。

[0044] 在一些实施方案中，所述亲和层析的层析介质为Amylose resin。

[0045] 本发明还提供了所述抗菌蛋白LYS-ABP的制备方法。

[0046] 一种具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的抗菌蛋白LYS-ABP的制备方法，为通过凝血酶对重组表达制备的MBP-LYS-ABP融合蛋白进行酶切得到。

[0047] 进一步的，本发明离子交换层析对抗菌蛋白LYS-ABP进行分离纯化。

[0048] 在一些实施方案中，所述抗菌蛋白LYS-ABP的制备方法为将重组表达得到的MBP-LYS-ABP融合蛋白与凝血酶混合,25℃放置5小时，得到Lys-ABP与MBP的混合物，然后通过离子交换层析分离纯化得到抗菌蛋白。

[0049] 本发明采用抑菌斑法比较本发明所述抗菌蛋白与抗菌肽、溶菌酶的抗菌效果。结果显示本发明所述抗菌蛋白MBP-LYS-ABP2μg/mL的浓度的抑菌效果与氨苄青霉素100μg/mL的浓度的抑菌效果相当，抑菌效果明显好于相同浓度的溶菌酶蛋白的抑菌效果，也明显好于相同浓度的抗菌肽蛋白的抑菌效果，表明本发明所述抗菌蛋白MBP-LYS-ABP的抑菌效果要优于单独的溶菌酶和抗菌肽蛋白的抑菌效果。

[0050] 本发明加速试验法观察研究本发明所述抗菌蛋白MBP-LYS-ABP的生物活性稳定性。结果显示2μg/mL的本发明所述抗菌蛋白MBP-L YS-ABP溶液于37℃恒温恒湿培养箱中保存3个月后，对大肠杆菌的抑菌效果与保存前的抑菌效果没有区别表明本发明所述抗菌蛋白MB P-LYS-ABP具有良好的生物活性稳定性。

[0051] 本发明提供了一种对人体无刺激性并且抑菌效果好的抗菌蛋白LYS-ABP，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。同时提供了在LYS-ABP蛋白N末端添加有MBP的融合目的蛋白，即抗菌蛋白MBP-LYS-ABP，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明还提供了所述抗菌蛋白LYS-ABP和抗菌蛋白MBP-LYS-ABP的制备方法。本发明所述抗菌蛋白LYS-ABP和抗菌蛋白MBP-LYS-ABP对人体无刺激性并且抑菌效果好，抑菌效果明显优于单独的溶菌酶和抗菌肽蛋白，生物活性稳定性好。

[0052] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

[0053] 实施例1：LYS-ABP基因获得

[0054] 根据Genbank设计出LYS-ABP基因的多肽序列，再按照密码最优原则设计出LYS-ABP基因序列，通过全基因合成LYS-ABP融合蛋白基因序列，并在两端分别加上EcoRⅠ-HindIII酶切位点，基因序列如SEQ ID NO:4所示。

[0055] 实施例2：抗菌蛋白MBP-LYS-ABP的制备

[0056] 1、重组质粒pMAL-p2x/LYS-ABP的构建与转化

[0057] 将全基因合成的LYS-ABP融合蛋白基因片段进行EcoRI-HindIII双切后，回收后作为待插入片段。

[0058] 表达载体pMAL-p2x购自NEB公司，将pMAL-p2x质粒用EcoRI-HindIII双切后回收大片段作为载体，与上述LYS-ABP片段用T4连接酶连接，再用CaCl2法转化到E.Coli DH5a中，具体步骤按《分子克隆》手册上的方法进行。用酶切筛选阳性克隆，有约490bp左右条带者为插入目的基因的质粒，命名为pMAL-p2x/LYS-ABP。

[0059] 筛选出的重组质粒转化到表达菌BL21(DE3)pLysS中，得到重组表达菌pMAL-p2x-LYS-ABP/BL21(DE3)pLysS。

[0060] 2、目标蛋白的表达

[0061] 材料：重组表达菌pMAL-p2x-LYS-ABP/BL21(DE3)pLysS；LB培养基（蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L pH7.2）分装入250mL、2000mL三角摇瓶，121℃高压灭菌15min，备用。

[0062] 方法：在长有重组表达菌pMAL-p2x-LYS-ABP/BL21(DE3)pLysS菌落的LB平板上，挑取单菌落接种于5mL LB培养基中，37℃培养至OD600=0.6时，转接入250mL LB培养基中放大培养大约15小时至OD600=0.6时停止培养。将250mL LB培养的重组表达菌转接到含LB的2000mL三角烧瓶中，37℃，200rpm，继续培养20hr，培养至OD600=0.6时，加入IPTG至终浓度
1mM于37℃诱导培养3hr。

[0063] 3、目标蛋白的分离纯化

[0064] 将诱导表达的菌液放在4度冰箱里，放置24小时使菌体自然沉淀，菌体自然沉淀后去上清，加等量的缓冲液(50mM Tris-HCl,2mM EDTA,0.1%Triton X-100,PH8.0)，转到另外的容器中，放入-20度冰箱中，待完全冰冻以后，取出完全溶解以后，再重复冻融两次。

[0065] 向冻融后的液体中加入DNA酶以降解菌体释放的DNA，常温放置约5小时消化DNA。

[0066] 亲和层析纯化：层析介质：Amylose-Resin；层析柱规格：内径50cm，高40cm，介质高约10cm，介质体积约200mL；监测：280nm；平衡液为25mM pH8.0Tris-HCl缓冲液。首先用平衡液平衡层析柱5个柱体积以上，流速20mL/min，然后将消化DNA的菌液样品用平衡液稀释3倍后，进行上样，流速为20mL/min，上完样后继续平衡约5个柱体积，使用25mM pH8.0Tris-HCl缓冲液，0.15M NaCl洗杂蛋白至紫外吸收回复到基线，使用洗脱液（25mM pH8.0Tris-HCl缓冲液、0.15M NaCl和10mM麦芽糖）进行洗脱，并收集得到目的蛋白。最后用水对介质进行再生，之后介质可以加入20%的乙醇放入4℃进行保存。

[0067] 实施例3：抗菌蛋白LYS-ABP的制备

[0068] 配制25mM pH8.0Tris-HCl缓冲液，将含MBP的Lys-ABP纯品加入溶液中，蛋白终浓度为每毫升1毫克，加入凝血酶适量，25℃放置5小时，切割得到Lys-ABP与MBP的混合物，放4℃冰箱备用。

[0069] 离子交换层析纯化：层析介质：Q Sepharose Fast Flow；层析柱规格：内径50cm，高40cm，介质高约10cm，介质体积约200mL；监测：280nm；平衡液为25mM pH8.0Tris-HCl缓冲液。首先用平衡液平衡层析柱5个柱体积以上，流速20mL/min，然后将消化DNA的菌液样品用平衡液稀释3倍后，进行上样，流速为20mL/min，上完样后继续平衡约5个柱体积，使用25mM pH8.0Tris-HCl缓冲液和0.15M NaCl洗杂蛋白至紫外吸收回复到基线，使用洗脱液（25mM pH8.0Tris-HCl缓冲液、梯度NaCl）洗脱，并收集得到目的蛋白。最后用再生液（25mM pH8.0Tris-HCl缓冲液、2M NaCl）对介质进行再生，介质水洗后可以加入20%的乙醇放入4℃进行保存。

[0070] 实施例4：MBP-LYS-ABP目的蛋白的可溶性表达量

[0071] 取实施例2的蛋白溶液，采用聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的蛋白的表达量，结果见图1。

[0072] 由图1结果可见，实施例2制备得到的抗菌蛋白MBP-LYS-ABP的可溶性表达产量高，适合大规模生产。

[0073] 实施例5：抑菌效果研究

[0074] 采用抑菌斑法比较本发明所述抗菌蛋白与抗菌肽、溶菌酶的抗菌效果。

[0075] 试验仪器和试剂：隔水式电热恒温培养箱、LB培养基、氨苄青霉素、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞。

[0076] 试验方法及结果：根据《中国药典》三部（2005版）附录IX A抑菌圈法，在8厘米培养皿中倒入含1.5%琼脂的LB培养基20mL左右，冷却凝固后备用。取培养到OD600约为0.6的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌液各50μL，与5mL冷却到50℃左右的，含0.5%琼脂的LB培养混匀后倒入前面准备好的培养皿中，冷却凝固作为测定板。在测定板中用打孔器均匀打孔，在孔中分别加入：100μg/mL氨苄青霉素、2μg/mL抗菌蛋白MBP-LYS-ABP、2μg/mL抗菌蛋白LYS-ABP、2μg/mL溶菌酶、2μg/mL抗菌肽、生理盐水各150μL，在37℃培养24小时后用肉眼观察孔周围是否出现抑菌圈及抑菌圈直径，结果见表1。有抑菌圈出现为有抑菌作用，没有抑菌圈出现为没有抑菌作用。

[0077] 表1抑菌效果试验结果

[0078]

[0079] 由表1结果可见，浓度为2μg/mL的本发明所述抗菌蛋白MBP-LYS-ABP和抗菌蛋白LYS-ABP的抑菌效果与浓度为100μg/mL的氨苄青霉素的抑菌效果相当，抑菌效果明显好于相同浓度的溶菌酶蛋白的抑菌效果，也明显好于相同浓度的抗菌肽蛋白的抑菌效果，表明本发明所述抗菌蛋白MBP-LYS-ABP的抑菌效果要优于单独的溶菌酶和抗菌肽蛋白的抑菌效果。

[0080] 实施例6：抗菌蛋白的生物活性稳定性

[0081] 采用加速试验法观察研究本发明所述抗菌蛋白MBP-LYS-ABP和LYS-ABP的生物活性稳定性。

[0082] 试验仪器和试剂：隔水式电热恒温培养箱、LB培养基、大肠杆菌。

[0083] 试验方法：本试验参照《消毒技术规范》(第2002年版)2.2.3.2.1条的方法进行试验。具体方法如下：各取配置好的2μg/mL的本发明所述抗菌蛋白MBP-LYS-ABP和LYS-ABP溶液100mL分别放置于200mL的容量瓶中，然后放置于37℃恒温恒湿培养箱中保存3个月后，按照《中国药典》三部（2005版）附录IX A抑菌圈法进行抑菌试验，结果见表2。

[0084] 表2抗菌蛋白对大肠杆菌抑菌效果稳定性试验结果

[0085]组别 保存前抑菌圈直径（mm） 保存后抑菌圈直径（mm）
抗菌蛋白MBP-LYS-ABP 56 55
抗菌蛋白LYS-ABP 50 48

[0086] 由表2结果可见，2μg/mL的本发明所述抗菌蛋白MBP-LYS-ABP和LYS-ABP溶液于37℃恒温恒湿培养箱中保存3个月后，对大肠杆菌的抑菌效果与保存前的抑菌效果没有显著区别，依据《消毒技术规范》(第2002年版)2.2.3.2.1条所述37℃恒温恒湿保存3个月可以代表2年的稳定性，因此试验证明，本发明所述抗菌蛋白MBP-LYS-AB P和LYS-ABP都具有良好的生物活性稳定性。

[0087] 实施例6：抗菌蛋白的安全性

[0088] 采用急性眼刺激试验观察研究本发明所述抗菌蛋MBP-LYS-ABP和LYS-ABP的安全性。

[0089] 试验方法：参照《消毒技术规范》(第2002年版)2.3.4条的方法进行试验。使用3只家兔。试验前检查家兔双眼，有异常者不能用于试验。具体方法如下：吸取受试蛋白0.1mL，蛋白浓度均为2μg/mL,滴入家兔一侧眼结膜囊内。另一侧眼以生理盐水作为正常对照。滴受试蛋白后，将眼被动闭合4s，30s后用生理盐水冲洗。于滴眼后1h、24h、48h、72h、7d、14d和21d，将眼被动闭合4s，30s后用生理盐水冲洗。与恢复情况。如果72h内未出现刺激反应，或第7d或第14d，眼睛刺激反应完全恢复，即可提前终止试验。必要时，用2%荧光素钠溶液或裂隙灯、放大镜检查角膜及虹膜变化。

[0090] 评价规定：按表3对家兔眼角膜、虹膜和结膜的急性刺激反应进行评分，并分别计算每只动物在三个不同观察时间（24h、48h和72h）角膜损害、虹膜损害、结膜充血和结膜水肿四方面的“平均评分”（即每只动物的24h、48h和72h评分之和除以观察数3）。分别以动物眼角膜、虹膜和结膜充血、水肿的平均评分和恢复时间进行，按表4、表5眼刺激反应分级标准判定受试物对眼睛的刺激强度。

[0091] 表3家兔急性眼刺激反应的评分标准

[0092]

[0093] 表4眼刺激性反应分级标准

[0094]

[0095] 注：完全恢复是指动物的眼刺激反应评分：角膜损害=0，虹膜损害=0，结膜充血=0或1，结膜水肿=0或1；**刺激性：接触受试物后所产生的可逆性炎性反应；***腐蚀性：接触受试物后所产生的不可逆性组织损伤。

[0096] 表5眼刺激性反应分级标准

[0097]

[0098] *:恢复时间:为动物刺激反应评分恢复至角膜损害=0，虹膜损害=0，结膜充血=0或1，结膜水肿=0或1的时间；**：腐蚀性：至少有1只动物于21d尚存在角膜粘连或血管翳，也可判为腐蚀性。

[0099] 结果：实验证明浓度为2μg/mL的抗菌蛋白MBP-LYS-ABP和LYS-ABP对家兔眼睛无刺激性，具有很高的安全性，结果见表6-9。

[0100] 表6抗菌蛋白对家兔眼角膜损伤的影响

[0101]

[0102] 表7抗菌蛋白对家兔眼虹膜损伤的影响

[0103]

[0104] 表3抗菌蛋白对家兔眼结膜充血的影响

[0105]

[0106] 表4抗菌蛋白对家兔眼结膜水肿的影响

[0107]

[0108] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。