一种重组糖苷水解酶用于生物转化制备人参二醇型皂苷的工艺

摘要

本发明公开了一种制备人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的方法。本发明所提供的制备人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的方法，包括以人参二醇型皂苷为底物用蛋白质进行催化反应得到含有人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2反应物的步骤，所述蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：a)氨基酸序列是SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的蛋白质；b)将SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的蛋白质所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有人参皂苷水解酶活性的蛋白质。实验证明本发明提供的制备人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的方法具有较强的实用性。

权利要求

1.制备人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的方法，包括以人参二醇型皂苷为底物用蛋白质进行催化反应得到含有人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2反应物的步骤，所述蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：a)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；

b)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；

所述人参二醇型皂苷包括Rb1、Rb2、Rc和Rd。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括从所述反应物中纯化得到人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的步骤。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述以人参二醇型皂苷为底物用蛋白质进行催化反应在液体中进行，所述液体中所述蛋白质和所述人参二醇型皂苷的配比为

1IU所述蛋白质：0.5-2mg所述人参二醇型皂苷，所述IU为所述蛋白质的β-糖苷水解酶酶活。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述催化反应进行1-3小时，所述催化反应在25-35℃。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述纯化包括以下步骤：将所述反应物进行离心，使人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2进入上清液中，收集上清液，得到含有人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的上清液，将所述上清液干燥，得到含有人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的干燥粉，除去所述干燥粉中的杂质，分别得到人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：除去所述干燥粉中的杂质包括以下步骤：将所述干燥粉溶于溶液A中，得到含有人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的液体混合物，将所述液体混合物进行硅胶柱层析，用所述溶液A洗脱，分别收集含有人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的级分，将各所述级分干燥，得到人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2；

所述溶液A由氯仿、甲醇和水组成，所述溶液A中氯仿、甲醇和水的体积比为65:35:10。

7.权利要求1所述方法中的所述蛋白质在制备人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2中的应用。

8.与权利要求1所述方法中的所述蛋白质相关的生物材料在制备人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2中的应用。

9.权利要求1所述方法中的所述蛋白质在催化人参二醇型皂苷制备人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2中的应用；所述人参二醇型皂苷包括Rb1、Rb2、Rc和Rd。

10.与权利要求1所述方法中的所述蛋白质相关的生物材料在催化人参二醇型皂苷制备人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2中的应用；所述人参二醇型皂苷包括Rb1、Rb2、Rc和Rd。

说明书

一种重组糖苷水解酶用于生物转化制备人参二醇型皂苷的

工艺

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域中一种制备人参皂苷的方法。

背景技术

[0002] 人参二醇型皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2，被报道具有良好的药理学活性，例如抗肿瘤活性、抗炎活性等，具有一定的应用潜力。但是这些人参皂苷在天然人参中含量甚微甚至根本不存在，从天然人参中进行提取分离十分困难，这极大地限制了它们的应用。

[0003] 在人参总皂苷中，二醇型人参皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd的含量，超过人参总皂苷含量的60％以上。对比人参皂苷Rb1与Gyp XVII、Rb2与compound O、Rc与Mb、Rd与F2的结构可知，它们的皂苷元结构相同，只是连接在C-3位置上的糖基数目有所不同。因此，可以通过水解人参二醇型皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd的C-3位的外侧葡萄糖基，来分别得到人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2。

[0004] 以往有研究者通过部分酸水解人参总皂苷来制备一些糖基数目较少的人参皂苷。但酸水解的稳定性差，不同批次之间质量不稳定。此外，酸水解的专一性差，容易产生副产物，造成了目标产物的产率偏低，且后续的产品分离纯化比较困难。也有研究者利用细菌、真菌等微生物分泌的糖苷水解酶来生物转化人参总皂苷、人参二醇型皂苷混合物或某种人参二醇型皂苷单体，制备Gyp XVII、compound O、Mb和F2，或其中的一种或几种。生物转化与酸水解相比，具有条件温和、专一性好等优越性。但是由于细菌或真菌分泌的糖苷水解酶数量较少，而且微生物容易变异、退化，造成了这一生物转化过程的效率很低，这一生产过程不适合放大，给生产过程增添了不稳定性，不适用于工业规模的应用。现在急需通过基因工程的手段，直接克隆和表达所需要的酶的基因，实现人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的稳定制备。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种制备人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的方法。

[0006] 本发明提供的制备人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的方法，包括以人参二醇型皂苷为底物用蛋白质进行催化反应得到含有人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2反应物的步骤，所述蛋白质的名称为CcBgl1A，来源于纤维菌(Cellulosimicrobium sp.)21，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

[0007] a)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；

[0008] b)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；

[0009] c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有人参皂苷水解酶活性的蛋白质；

[0010] d)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有人参皂苷水解酶活性的蛋白质。

[0011] 其中，SEQ ID No.2由390个氨基酸残基组成，是天然人参皂苷水解酶CcBgl1A(名称为N CcBgl1A)的氨基酸序列；SEQ ID No.4由410个氨基酸残基组成，是重组人参皂苷水解酶CcBgl1A(名称为R CcBgl1A)的氨基酸序列；SEQ ID No.4是在SEQ ID No.2的氨基末端添加氨基酸序列：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH得到的氨基酸序列。

[0012] 上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

[0013] 上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。上述d)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述d)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上SEQ ID No.3所示的His-Tag的编码序列得到。

[0014] 上述方法中，所述方法包括从所述反应物中纯化得到人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的步骤。

[0015] 上述方法中，所述以人参二醇型皂苷为底物用CcBgl1A进行催化反应在液体中进行，所述液体中CcBgl1A和所述人参二醇型皂苷的配比为1IU CcBgl1A：0.5-2mg所述人参二醇型皂苷(如0.8IU CcBgl1A：1mg所述人参二醇型皂苷)，所述IU为CcBgl1A的β-葡萄糖苷酶酶活。

[0016] 上述方法中，所述催化反应进行1-3小时，所述1-3小时可为1-2小时或1.5-2小时或2-3小时或2-2.5小时或2小时。

[0017] 上述方法中，所述催化反应在25-35℃，所述25-35℃可为25-30℃或30-35℃。

[0018] 上述方法中，所述纯化包括以下步骤：将所述反应物进行离心，使人参皂苷进入上清液中，收集上清液，得到含有人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的上清液，将所述上清液干燥，得到含有人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的干燥粉，除去所述干燥粉中的杂质，得到人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2。

[0019] 上述方法中，除去所述干燥粉中的杂质包括以下步骤：将所述干燥粉溶于溶液A中，得到含有人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的液体混合物，将所述液体混合物进行硅胶柱层析，用所述溶液A洗脱，分别收集含有人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的级分，将所述级分干燥，得到人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2。

[0020] 上述方法中，所述离心在常温、6000rpm条件下进行10min；所述溶液A由氯仿、甲醇、水组成，所述溶液A中氯仿、甲醇、水的体积比为65:35:10(下层溶液)。

[0021] CcBgl1A在制备人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2中的应用也在本发明的保护范围，如CcBgl1A生物转化人参二醇型皂苷和/或Rb1和/或Rb2和/或Rc和/或Rd制备人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2，或其中的一种或几种。

[0022] 与CcBgl1A相关的生物材料在制备人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2中的应用也在本发明的保护范围，如所述生物材料生物转化人参二醇型皂苷和/或Rb1和/或Rb2和/或Rc和/或Rd制备人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2，或其中的一种或几种。所述生物材料为下述B1)至B16)中的任一种：

[0023] B1)编码CcBgl1A的核酸分子；

[0024] B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

[0025] B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

[0026] B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

[0027] B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

[0028] B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

[0029] B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

[0030] B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

[0031] B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；

[0032] B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

[0033] B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

[0034] B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；

[0035] B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

[0036] B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

[0037] B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

[0038] B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

[0039] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

[0040] 上述生物材料中，B1)所述核酸分子具体可为如下1)或2)或3)或4)或5)所示的核酸分子：

[0041] 1)编码序列是序列表中SEQ ID No.1的第1-1173位核苷酸的DNA分子或cDNA分子；

[0042] 2)编码序列是序列表中SEQ ID No.3的第1-1233位核苷酸的DNA分子或cDNA分子；

[0043] 3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码CcBgl1A的cDNA分子或基因组DNA分子；

[0044] 4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的核苷酸序列杂交，且编码CcBgl1A的cDNA分子或基因组DNA分子。

[0045] 其中，SEQ ID No.1由1173个核苷酸组成，SEQ ID No.1的第1-1173位核苷酸编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。纤维菌(Cellulosimicrobium sp.21)中的CcBgl1A基因的基因组基因编码SEQ ID No.2的蛋白质。SEQ ID No.3由1233个核苷酸组成，编码SEQ ID No.4所示的氨基酸序列，SEQ ID No.3的第1-60位核苷酸为pET-28a(+)载体上的序列，SEQ ID No.3的第13-30位核苷酸编码His-Tag，SEQ ID No.3的第61-1233位核苷酸编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

[0046] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码CcBgl1A的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的CcBgl1A的核苷酸序列70％或者更高同一性的核苷酸，只要编码CcBgl1A且具有人参皂苷水解酶活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

[0047] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的启动子核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

[0048] 上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

[0049] 上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％、95％以上的同一性。

[0050] 上述生物材料中，B2)所述的含有编码CcBgl1A的核酸分子的表达盒(CcBgl1A基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达CcBgl1A的DNA，该DNA不但可包括启动CcBgl1A基因转录的启动子，还可包括终止CcBgl1A转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

[0051] 可用现有的表达载体构建含有所述CcBgl1A基因表达盒的重组载体。

[0052] 上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

[0053] 上述生物材料中，B5)-B8)所述的微生物可为酵母、细菌、藻和真菌，如大肠杆菌。

[0054] 上述生物材料中，B9)-B12)所述的转基因植物细胞系和转基因动物细胞系不包括繁殖材料。所述转基因动物细胞系可为昆虫细胞。

[0055] 在本发明的一个实施方式中，CcBgl1A的编码基因通过含有CcBgl1A的编码基因的表达盒的重组载体导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中。所述重组载体为用SEQ ID No.1的第1-1173位所示的DNA分子替换pET-28a(+)的Nde I和BamH I识别位点间的片段得到的重组载体pET-28a/CcBgl1A。CcBgl1A在催化人参二醇型皂苷制备人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2中的应用也在本发明的保护范围。

[0056] 上述B1)至B16)任一种与CcBgl1A相关的生物材料在催化人参二醇型皂苷制备人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2中的应用也在本发明的保护范围。

[0057] 实验证明，可以利用CcBgl1A作为人参皂苷水解酶，以人参二醇型皂苷作为底物进行催化反应得到人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2。利用本发明的CcBgl1A制备人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2，反应条件温和，对设备要求低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，由于酶催化具有高效、专一的选择性，且转化率高，生物转化速率快，在2h内即可完成，此法生产人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2无副产物产生，纯化方便。反应绝大部分溶剂为水，三废排放低，绿色环保，并实现了人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的稳定制备，解决了传统的生物转化与酸水解制备人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的产量低、原料浪费、成本高、质量不稳定等问题。本发明提供的制备人参皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的方法具有较强的实用性。

[0058] 生物材料保藏说明

[0059] 生物材料的分类命名：纤维菌(Cellulosimicrobium sp.)

[0060] 生物材料的菌株编号：21

[0061] 生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心[0062] 生物材料的保藏单位简称：CGMCC

[0063] 生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101

[0064] 生物材料的保藏日期：2013年05月14日

[0065] 生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.7587

附图说明

[0066] 图1为CcBgl1A基因的PCR琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1为DNA marker，泳道2为CcBgl1A基因的PCR扩增产物。

[0067] 图2为重组载体pET-28a/CcBgl1A的Nde I和BamH I双酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1为DNA marker，泳道2为pET-28a(+)，泳道3为pET-28a/CcBgl1A，泳道4为pET-28a/CcBgl1A的NdeI和BamH I双酶切产物。

[0068] 图3为蛋白诱导表达的聚丙酰胺凝胶电泳图。其中，泳道1为蛋白质分子量marker，泳道2为重组菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)诱导前总蛋白溶液，泳道3为重组菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)诱导后总蛋白溶液，泳道4为重组菌pET-28a/CcBgl1A/E.coli BL21(DE3)诱导前总蛋白溶液，泳道5为重组菌pET-28a/CcBgl1A/E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后总蛋白溶液，泳道6为Ni柱纯化后的CcBgl1A蛋 白。

[0069] 图4为重组人参皂苷水解酶CcBgl1A水解人参二醇型皂苷的反应产物的HPLC-C18反相柱分析图谱。其中，曲线a为转化底物—人参二醇型皂苷图谱，曲线b为转化产物—人参二醇型皂苷转化2h后的图谱，曲线c为人参皂苷标准品图谱。

[0070] 图5为重组表达载体pET-28a/CcBgl1A的构建示意图。

[0071] 图6为重组人参皂苷水解酶CcBgl1A的生物学特性。其中，a为最适pH曲线，b为pH稳定性曲线，c为最适温度曲线，d为温度稳定性曲线。

具体实施方式

[0072] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

[0073] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0074] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0075] 纤维菌(Cellulosimicrobium sp.)21由东北师范大学从土壤中筛选得到，于2013年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该保藏中心登记入册编号：CGMCC No.7587。

[0076] 实施例1、人参皂苷水解酶重组载体的构建

[0077] 将来自纤维菌(Cellulosimicrobium sp.)21(保藏号为CGMCC No.7587)的人参皂苷水解酶的多核苷酸(SEQ ID No.1)通过PCR的方式获得，克隆到表达载体pET-28a中，得到可以表达人参皂苷水解酶的重组质粒。具体步骤包括：

[0078] 1)纤维菌(Cellulosimicrobium sp.)21基因组DNA的提取：

[0079] 将纤维菌(Cellulosimicrobium sp.)21在LB琼脂培养基上，37℃活化12h。活化的菌种接一环至LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养12h。5000rpm、4℃离心10min收集菌体，用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，按照说明书提取纤维菌(Cellulosimicrobium sp.)21基因组DNA。

[0080] 2)CcBgl1A基因的扩增：

[0081] 以纤维菌(Cellulosimicrobium sp.)21的基因组DNA为模板进行PCR，扩增CcBgl1A基因。扩增引物为：Primer-F 5′-GGAATTCCATATGGTGTCGATCACCTTCCCCGAGTC-3′；Primer-R 5′-CGGGATCCTTATCAGTCGTCGAGCGAGACGGTC-3′。扩增条件为：98℃预变性30s；98℃10s，65℃45s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，如图1所示。对获得的片段进行测序，测序结果表明获得的片段含有SEQ ID No.1所示的DNA分子，SEQ ID No.1所示的DNA分子是天然人参皂苷水解酶CcBgl1A的编码序列，编码SEQ ID No.2所示的人参皂苷水解酶CcBgl1A，将该天然人参皂苷水解酶CcBgl1A命名为N CcBgl1A。

[0082] 3)重组载体pET-28a/CcBgl1A的构建

[0083] 如图5所示，用PCR产物纯化试剂盒回收PCR产物。用限制性内切酶Nde I和BamH I(New England Biolabs)酶切回收的PCR产物与pET-28a(+)载体(Novegan)(图2)，酶切结束后用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司，DP209)回收酶切产物。胶回收试剂盒回收的经过相同酶切处理的pET-28a(+)载体与PCR产物在T4DNA连接酶(TAKARA，2011A)的作用下连接过夜。连接产物转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，筛选阳性克隆并送上海生工生物股份有限公司测序，验证序列的正确性。 将用SEQ ID No.1的所示CcBgl1A基因替换pET-28a(+)的Nde I和BamH I位点间的片段(保持pET-28a(+)的其它序列不变)得到的重组载体命名为pET-28a/CcBgl1A。将含有pET-28a/CcBgl1A重组表达载体的阳性克隆命名为重组菌pET-28a/CcBgl1A/E.coli BL21(DE3)。重组菌pET-28a/CcBgl1A/E.coli BL21(DE3)表达SEQ ID No.4所示的重组人参皂苷水解酶CcBgl1A，将该重组人参皂苷水解酶CcBgl1A命名为R CcBgl1A。SEQ ID No.4的第21-410位氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

[0084] 将空载体pET-28a(+)载体导入E.coli BL21(DE3)得到含有pET-28a(+)的重组菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)，作为空载体对照菌。

[0085] 实施例2、重组人参皂苷水解酶CcBgl1A的制备

[0086] 1、将实施例1的重组菌pET-28a/CcBgl1A/E.coli BL21(DE3)接种于含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。挑一环接种到5ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12h(以含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基为空白对照)，即为种子液。将种子液按照1:50的比例接种到200ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在1L摇瓶中，37℃、200rpm培养。待OD600到达0.5(以发酵培养基为空白对照)时降温至25℃，并加0.4mM IPTG诱导20h。诱导结束后，5000rpm离心10min收集菌体，用PBS洗菌体1次后重新悬浮在50ml的PBS缓冲液中，超声破碎细胞，15000g、4℃离心30min，收集上清液，上清液即为重组菌pET-28a/CcBgl1A/E.coli BL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液。同时取诱导前的重组菌pET-28a/CcBgl1A/E.coli BL21(DE3)菌体，用PBS洗菌体1次后重新悬浮在50ml的PBS缓冲液中，超声破碎细胞，15000g、4℃离心30min，收集上清液，得到重组菌pET-28a/CcBgl1A/E.coli BL21(DE3)的诱导前总蛋白溶液。

[0087] 2、按照本实施例中步骤1的方法，将实施例1的重组菌pET-28a/CcBgl1A/E.coli BL21(DE3)替换为重组菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)，其它步骤不变，分别得到重组菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液和重组菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)的诱导前总蛋白溶液。

[0088] 3、重组人参皂苷水解酶CcBgl1A的纯化

[0089] 在重组菌pET-28a/CcBgl1A/E.coli BL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液中加入咪唑使其终浓度为10mM，得到总蛋白的咪唑溶液，将总蛋白的咪唑溶液与5ml的Ni Sepharose fastflow凝胶(GE healthcare)在4℃条件下缓慢振荡30min，得到蛋白-凝胶混合物，将蛋白-凝胶混合物装入直径为1.6cm、高10cm的玻璃层析柱中。然后用2倍层析柱体积的10mM咪唑/PBS溶液洗脱，再用5倍层析柱体积的300mM的咪唑/PBS溶液洗脱。收集300mM咪唑洗脱的级分，得到含有重组人参皂苷水解酶CcBgl1A的酶液，用截留分子量为10kDa的超滤膜(Millipore公司)除去酶液中的咪唑，得到纯化的重组人参皂苷水解酶CcBgl1A。

[0090] 4、将重组菌pET-28a/CcBgl1A/E.coli BL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液、重组菌pET-28a/CcBgl1A/E.coli BL21(DE3)的诱导前总蛋白溶液、重组菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液、重组菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)的诱导前总蛋白溶液和纯化的重组人参皂苷水解酶CcBgl1A分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图3所示，表明只有重组菌pET-28a/CcBgl1A/E.coli BL21(DE3)的诱导前总蛋白溶液和重组菌pET-28a/CcBgl1A/E.coli BL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液和纯化的重组人参皂苷水解酶CcBgl1A中有46kDa的蛋白(即CcBgl1A)条带，重组菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液和重组菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)的诱导前总蛋白溶液均没有该46kDa的蛋白(即CcBgl1A)条带。

[0091] 用考马斯亮蓝G-250法测定重组菌pET-28a/CcBgl1A/E.coli BL21(DE3)诱导后总蛋白溶液的蛋白含量为10mg/ml。

[0092] 5、重组人参皂苷水解酶CcBgl1A活性的测定

[0093] 1)以人工底物p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside(pNPG)检测重组人参皂苷水解酶CcBgl1A和野生型菌株人参皂苷水解酶的酶活力。人参皂苷水解酶酶活力测定体系为：100μl反应体系中，依次加入10μl适当稀释的重组菌pET-28a/CcBgl1A/E.coli BL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液或重组菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液或野生型菌株纤维菌(Cellulosimicrobium sp.)21的总蛋白溶液，10μl pNPG(5mM)和80μl NaAc-HAc缓冲液(50mM,pH 5.5)，37℃反应10min后，加入100μl 1M NaOH终止反应。参照pNP标准曲线计算糖苷水解酶的酶活。

[0094] β-葡萄糖苷酶的酶活单位(IU)定义为每分钟催化底物生成1μmol pNP所需要的酶量为1IU。

[0095] 根据检测的结果计算得到的重组菌pET-28a/CcBgl1A/E.coli BL21(DE3)的诱导后总蛋白中β-葡萄糖苷酶的酶活为17IU/mg总蛋白，重组菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)的诱导后总蛋白并无β-葡萄糖苷酶酶活。实验结果表明CcBgl1A蛋白具有β-葡萄糖苷酶酶活，证明CcBgl1A蛋白为β-葡萄糖苷酶。

[0096] 重组菌pET-28a/CcBgl1A/E.coli BL21(DE3)的诱导后总蛋白中β-葡萄糖苷酶的酶活为17IU/mg总蛋白，野生型菌株纤维菌(Cellulosimicrobium sp.)21总蛋白中β-葡萄糖苷酶酶活为0.5IU/mg总蛋白，表明重组菌pET-28a/CcBgl1A/E.coli BL21(DE3)的诱导后总蛋白中β-葡萄糖苷酶的酶活是野生型菌株总蛋白中β-葡萄糖苷酶酶活的34倍，说明重组菌pET-28a/CcBgl1A/E.coli BL21(DE3)的诱导后的总蛋白具有更高的β-葡萄糖苷酶酶活。其中，总蛋白含量均用考马斯亮蓝G-250法测定。

[0097] 2)将纯化的重组β-葡萄糖苷酶CcBgl1A按照上本实施例中步骤5中1)的测定酶活的方法测定β-葡萄糖苷酶酶活，结果表明纯化的重组β-葡萄糖苷酶CcBgl1A的β-葡萄糖苷酶比活力为32IU/mg蛋白。

[0098] 实施例3、重组β-葡萄糖苷酶CcBgl1A的生物学特性

[0099] 1、pH对重组β-葡萄糖苷酶CcBgl1A活力的影响

[0100] 将适当稀释的纯化的重组β-葡萄糖苷酶CcBgl1A与底物pNPG在不同pH值的缓冲液中，37℃条件下反应10min，测定重组β-葡萄糖苷酶CcBgl1A在不同pH条件下的酶活力。采用的缓冲液分别为：pH 2.0-6.0，50mM NaAc-HAc缓冲液；pH 6.0-8.0，50mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液；pH 8.0-11.0，50mM Glycine-NaOH缓冲液。实验结果表明，重组β-葡萄糖苷酶CcBgl1A的最适pH值为5.5(图6中a)。

[0101] 2、pH对重组β-葡萄糖苷酶CcBgl1A稳定性的影响

[0102] 将10μl适当稀释的纯化的重组β-葡萄糖苷酶CcBgl1A酶液与50μl浓度为100mM的各种不同pH值(4.0-10.0)的缓冲液混合(采用的缓冲液分别为：pH 4.0-6.0，50mM NaAc-HAc缓冲液；pH 6.0-8.0，50mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液；pH 8.0-10.0，50mM Glycine-NaOH缓冲液)，分别在4℃冰箱中保温24h后，取10μl保温后的酶液测定残余酶活。对照组为10μl适当稀释的酶液与50μl去离子水混合(酶活定义为100％)，结果表明重组β-葡萄糖苷酶CcBgl1A在pH 6.0-10.0范围内保温24h后，仍保留50％以上的酶活力(图6中b)。

[0103] 3、温度对重组β-葡萄糖苷酶活力的影响

[0104] 在20-80℃水浴中，以pNPG为底物，按照实施例2中步骤5中的1)的方法测定纯化的重组β-葡萄糖苷酶CcBgl1A的酶活力。实验结果表明，重组β-葡萄糖苷酶CcBgl1A的最适反应温度为35℃(图6中c)。

[0105] 4、温度对重组β-葡萄糖苷酶CcBgl1A稳定性的影响

[0106] 将纯化的重组β-葡萄糖苷酶CcBgl1A分别在30、35、40、45、50℃的水浴中保温1h测定酶活力。以未处理的纯化的重组β-葡萄糖苷酶CcBgl1A作为对照(酶活为100％)。实验结果发现，纯化的重组β-葡萄糖苷酶CcBgl1A分别在30、35、40、45、50℃保温1h后，其残余酶活力分别为95％、21％、6％、1.2％、0.2％(图6中d)。

[0107] 实施例4、用重组β-葡萄糖苷酶CcBgl1A制备人参二醇型皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2

[0108] 1、人参二醇型皂苷PPDGM各组分及其含量的检测

[0109] 本实施例利用实施例2步骤3纯化得到的重组β-葡萄糖苷酶CcBgl1A以人参二醇型皂苷PPDGM为底物制备人参二醇型皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2。其中，人参二醇型皂苷PPDGM按照文献(《番茄叶霉病原菌转化人参皂甙的研究》，王娟，东北师范大学硕士学位论文)的方法，从干燥人参根中提取得到。该人参二醇型皂苷PPDGM的各组分及所占百分比分别为：Rb1：37.8％；Rb2：17.1％；Rc：24.3％；Rd：9.5％。检测人参二醇型皂苷PPDGM各组分及其含量的方法为HPLC-C18反相柱法，方法如下所述：

[0110] 色谱柱：Shim-pack PREP-ODS(H)反相柱(250×4.6mm,5μm)

[0111] 上样量：20μl

[0112] 流动相：A：水；B：乙腈

[0113] 程序：0-10min，32％B，68％A；10-40min(不包括10min)，B的体积百分含量由32％匀速增加到60％，A的体积百分含量由68％匀速降低到40％；40-50min(不包括40min)，60％B，40％A

[0114] 柱温：25℃

[0115] 检测器：紫外检测器，203nm

[0116] 流速：1.0mL/min

[0117] 其中，标准品分别为人参皂苷Rb1，Rb2，Rc，Rd，Gyp XVII，compound O，Mb和F2(国家标准物质资源网，商品目录号分别为Rb1SS0769；Rb2SS0770；Rc SS0767；Rd SS0768；Gyp XVII A0638；F2SG-G021；compound O和Mb为按照文献(Efficient biotransformation for preparation of pharmaceutically active ginsenoside Compound K by Penicillium oxalicum sp.68.Annals of Microbiology,63,139-149,2013)制备并鉴定)。

[0118] 2、用重组β-糖苷水解酶CcBgl1A制备人参皂苷Gyp XVII，compound O，Mb和F2[0119] 用重组β-糖苷水解酶CcBgl1A制备人参皂苷Gyp XVII，compound O，Mb和F2实验重复三次，每次实验的具体步骤如下：

[0120] 将实施例2步骤3纯化得到的重组β-糖苷水解酶CcBgl1A用50mM NaAc缓冲液(pH 5.5)调整蛋白浓度为1mg/ml(即32IU/ml)的酶液，在100ml上述酶液中加入2.5g人参二醇型皂苷PPDGM，使其终浓度为25mg/ml，30℃、100rpm搅拌条件下反应2h。反应结束后，80℃加热
10min使酶失活，离心，上清液旋转蒸发至20ml，-70℃预冻后，冷冻干燥得到转化产物干燥粉。按照本实施例上述HPLC-C18反相柱法以人参皂苷Gyp XVII，compound O，Mb和F2(国家标准物质资源网，商品目录号分别为Gyp XVII A0638；F2SG-G021；compound O和Mb为按照文献(Efficient biotransformation for preparation of pharmaceutically active ginsenoside Compound K by Penicillium oxalicum sp.68.Annals of Microbiology,
63,139-149,2013)制备并鉴定)为标准品检测转化产物，根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量分析(图4)，结果表明转化产物中的人参皂苷Gyp XVII， compound O，Mb和F2含量分别为35％、16.5％、23.9％、8.9％(质量百分含量)。

[0121] 将转化产物干燥粉溶于少量由体积比为65:35:10(v/v/v，下层)的氯仿、甲醇和水组成的液体中，上样至100mL硅胶柱层析。用由体积比为65:35:10(v/v/v，下层)的氯仿、甲醇和水组成的液体进行洗脱，分别收集含有人参皂苷Gyp XVII，compound O，Mb和F2的级分，旋转蒸发至无有机溶剂流出，-70℃预冻后分别冷冻干燥，得到人参皂苷Gyp XVII，compound O，Mb和F2纯品。所述的人参皂苷Gyp XVII，compound O，Mb和F2纯品经上述HPLC分析结果表明含量均超过95％。结果表明该2.5g人参二醇型皂苷PPDGM分别得到人参皂苷Gyp XVII，compound O，Mb和F2纯品0.75±0.1g、0.35±0.05g、0.46±0.05g、0.20±0.04g，人参皂苷Gyp XVII，compound O，Mb和F2的产率分别为30％、14％、18.4％、8％(各人参皂苷产量/投料PPDGM量*100％)。