多肽及其胰菠酶片组合物和应用

摘要

本发明提供了新的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示或是在SEQ ID NO：2所示序列上添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的。本发明还提供了包含该多肽的药物组合物，优选是胰菠酶片，用于减轻创伤后和手术后水肿，缩短血块凝聚时间，减缓肿胀和炎症引起的疼痛，治疗血栓性静脉炎，治疗泌尿生殖道炎症、治疗关节炎(如，慢性关节炎)或治疗软组织风湿病。

权利要求

1.多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.多核苷酸，其编码权利要求1所述的多肽。

3.权利要求2所述的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.载体，其包含权利要求2或3所述的多核苷酸。

5.细胞，其包含权利要求2或3所述的多核苷酸。

6.制备权利要求1所述的多肽的方法，其包括在适合蛋白质表达的条件下培养权利要求5所述的细胞，然后从培养物中分离出权利要求1所述的多肽。

7.药物组合物，其包括权利要求1所述的多肽和药学上可接受的载体。

8.权利要求7所述的药物组合物，其还包括胰蛋白酶和芦丁。

9.权利要求1所述的多肽在制备用于减轻创伤后和手术后水肿，缩短血块凝聚时间，减缓肿胀和炎症引起的疼痛，治疗血栓性静脉炎，治疗泌尿生殖道炎症、治疗关节炎，或治疗软组织风湿病的药物中的应用。

10.权利要求9所述的应用，其中关节炎是慢性关节炎。

说明书

多肽及其胰菠酶片组合物和应用

技术领域

[0001] 本发明属于蛋白质或多肽技术领域，具体而言，本发明涉及新的多肽及其药物组合物，优选还涉及其与其他活性成分组成的胰菠酶片等。另外，本发明还涉及上述化学产品的制备方法和医药应用等。

背景技术

[0002] Phlogenzym片，也称二酶片或胰菠酶片，其活性成分主要由蛋白质组成，用于减轻创伤后和手术后水肿，缩短血块凝聚时间，减缓肿胀和炎症引起的疼痛，并可用于诸如血栓性静脉炎、泌尿生殖道炎症、关节炎(如，慢性关节炎)和软组织风湿病等疾病的治疗。然而，由于在制备片剂时通常需要高温压片，对于含蛋白质的制剂来说，特别容易使得蛋白质活性降低，因此需要加入更大量的活性蛋白质。而且，高温变性的蛋白质也更容易引起过敏反应，增加了潜在的安全性隐患。

[0003] 为此，中国专利申请第200410030650.7号等现有技术通过直接装入肠溶性胶囊来避免高温压片，但是这并没有从根本上改变活性蛋白质的性质，尤其是长时间高温储存的稳定性。

[0004] 然而，本发明人没有受现有技术“走捷径”的方式影响而通过制剂类型和配方等方式来入手，而是从更为本质的结构改造入手，经过艰苦的研究和长期的实践，令人意外地研发出一种新的多肽，其相对于野生型蛋白质(参见GenBank登录号BAA21929.1)，具有更好的稳定性，特别适合实际的储运和保存。另外，本发明人还研发了一种新的二酶片的生产工艺，充分利用了其高温储存的稳定性，可以直接采用现有高温喷雾包衣的设备，这与现有的肠溶胶囊的改进方向正好相反，也不必额外购买制备Phlogenzym片的低温设备。

发明内容

[0005] 本发明的要解决的技术问题在于提供新的多肽及其药物组合物，优选是胰菠酶片。另外，本发明还涉及上述化学产品的制备方法和医药应用等。

[0006] 具体而言，在第一个方面，本发明提供了多肽，其氨基酸序列

[0007] (1)如SEQ ID NO：2所示；或

[0008] (2)是在SEQ ID NO：2所示序列上添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的。

[0009] 本发明的第一个方面的多肽的氨基酸序列可以是在SEQ ID NO：2所示序列上添加、缺失和/或取代一个或几个(优选一个至五个，更优选一个至三个)氨基酸残基而得的氨基酸序列。本领域技术人员知晓，通过改变已知多肽的编码基因序列并将其导入表达载体，可以制备出取代、添加或缺失了氨基酸残基的多肽，这些方法广泛记载于《分子克隆实验指南》(北京：科学出版社，2002年)等本领域公知的文献中。在取代的氨基酸残基中，优选取代为与原氨基酸残基侧链性质相似的其他氨基酸，从而更得以保持原有功能活性。侧链性质相似的氨基酸分别有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、含碱性基团侧链的氨基酸(R、K、H)、含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。在本发明的具体实施方式中，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

[0010] 本发明的第一个方面的多肽具有GenBank登录号BAA21929.1所述的野生型蛋白质的酶活性，例如可以根据Harrach等(J Protein Chem,14:41-52)所述的蛋白酶活性检测方法来进行。

[0011] 优选本发明的第一个方面的多肽相对于GenBank登录号BAA21929.1所述的野生型蛋白质的稳定性提高，优选是耐高温稳定性和/或长期保存稳定性的提高。在经历高温和/或一段时间后测定本发明的第一个方面的多肽和野生型蛋白质各自的酶活性，可以方便地显示出本发明的第一个方面的多肽的优势。其中，GenBank登录号BAA21929.1是记录于公共数据库的现有技术，其描述了提取自植物的野生型蛋白质(酶)，目前多直接采用从植物中提取的方法来获得，几乎没有现有技术对其进行基因工程改造，所以更加无法通过该野生型蛋白质的氨基酸序列来获得本发明的第一个方面的多肽。

[0012] 在第二个方面，本发明提供了多核苷酸，其编码本发明的第一个方面的多肽。本发明的多核苷酸，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，优选DNA形式。DNA形式包括天然cDNA和人工合成的cDNA，DNA可以是编码链或模板链。通过常规技术，如PCR方法、重组法或人工合成的方法，本领域技术人员可以获得编码本发明的第一个方面的多肽的核酸分子或其片段。这些序列一旦获得，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过培养宿主细胞进行增殖。优选本发明的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该优选序列优化了在酵母中的分泌表达。

[0013] 在第三个方面，本发明提供了一种载体，其含有本发明第二个方面所述的多核苷酸。本文中的术语“重组表达载体”、“表达载体”或“载体”，在此可以交互替换使用，是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。总之，只要能在宿主细胞中稳定复制，任何质粒和载体都可使用。优选表达载体包含选择标记基因，如细菌的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷选择标志，如His,Leu,Trp等；真核细胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因及荧光蛋白标记基因等。本发明的载体优选为真核载体，更优选是酵母表达载体。

[0014] 在第四个方面，本发明提供了细胞，其含有本发明第二个方面所述的多核苷酸。该细胞可以用本发明第三个方面所述的载体转化或转染而获得。细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。细胞在转化或转染含本发明所述编码融合蛋白的基因序列后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生产所需融合蛋白。合适的转化或转染方法包括但不限于：用于细菌细胞，如氯化钙法、电穿孔法；用于酵母细胞，如电穿孔法和原生质体融合法；用于哺乳动物细胞等，如质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法。优选本发明的细胞是酵母细胞。

[0015] 在第五个方面，本发明提供了制备本发明的第一个方面的多肽的方法，其包括在适合蛋白质表达的条件下培养本发明第四个方面所述的细胞，然后从培养物中分离出本发明的第一个方面的多肽。分离的方法包括但不限于：裂菌(超声波裂菌、渗透压裂菌)，离心，盐析，分子筛色谱(又称为分子尺寸排阻色谱)，离子交换色谱，吸附色谱(亲和层析、金属鏊合层析)，反向色谱，高效液相色谱，毛细管电泳，等电聚焦以及变性/复性处理等。

[0016] 在第六个方面，本发明提供了药物组合物，其包括本发明的第一个方面的多肽和药学上可接受的载体。本文中所用的“药物组合物”或“药物”或“药品”，如不特别指明，指的是人用的药物组合物或药物或药品。本文中使用的药学上可接受的载体指无毒的填充剂、稳定剂、稀释剂、佐剂或其他制剂辅料。本领域的技术人员可以根据治疗目的、给药途径(如注射或口服)的需要将药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位剂量形式，如冻干剂、片剂、胶囊、粉剂、乳液剂、注射剂或喷雾剂，更优选该药物组合物为口服制剂，如片剂、胶囊，优选是肠溶片。优选其中的药学上可接受的载体是微晶纤维素、乳糖、二氧化硅和/或淀粉。

[0017] 优选本发明第六个方面的药物组合物还包括胰蛋白酶和芦丁，更优选本发明第六个方面的药物组合物由本发明的第一个方面的多肽、胰蛋白酶和芦丁以及药学上可接受的载体组成。在本发明的具体实施方式中，即提供了由本发明的第一个方面的多肽、胰蛋白酶和芦丁以及药学上可接受的载体组成的二酶片(即，胰菠酶片)。本发明的第一个方面的多肽、胰蛋白酶和芦丁的重量比可以为1～3：0.5～2：1～3，优选为1.5～2.5：0.75～1.5：1.5～2.5，如为约2：1：2。该药物组合物可以用于减轻创伤后和手术后水肿，缩短血块凝聚时间，减缓肿胀和炎症引起的疼痛，治疗血栓性静脉炎，治疗泌尿生殖道炎症、治疗关节炎(如，慢性关节炎)或治疗软组织风湿病，等。

[0018] 优选本发明第六个方面的药物组合物是经历高温制备的。其中，高温为25～60℃，优选为35～50℃，更优选为40～45℃。本发明第六个方面的药物组合物可以在高温下通过喷雾包衣而制得，这在本发明的具体实施方式中有示例性的描述。所以，在第七个方面，本发明提供了本发明第六个方面的药物组合物的制备方法，其包括在高温下对本发明的第一个方面的多肽喷雾包衣的步骤。

[0019] 在第八个方面，本发明提供了本发明的第一个方面的多肽在制备用于减轻创伤后和手术后水肿，缩短血块凝聚时间，减缓肿胀和炎症引起的疼痛，治疗血栓性静脉炎，治疗泌尿生殖道炎症、治疗关节炎(如，慢性关节炎)或治疗软组织风湿病的药物中的应用。该应用可以是本发明的第一个方面的多肽单独在制备药物中的应用，也可以是联合其他活性成分(如，胰蛋白酶和芦丁)在制备药物中的应用。

[0020] 本发明取得的有益效果在于：突破了现有技术的改进方向，提供了稳定性更好的多肽，可用于制备二酶片，特别适合实际的运输和保存，便于推广应用；没有受现有技术改进方向的限制，仍旧采用了高温制备的工艺，方便采用现有的设备，节约了成本。

[0021] 为了便于理解，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，其全文内容均纳入本文进行参考。

[0022] 以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。

具体实施方式

[0023] 以下实施例将具体描述本发明，其中如有未详尽之处，可参见《分子克隆实验指南》、《细胞实验指南》等实验手册所述的方法进行，或者根据实验中具体用到的试剂、仪器的厂商所提供的说明书或手册来进行。

[0024] 实施例1本发明的多肽的制备

[0025] 经长期研究，本发明人研发了本发明的多肽及其在酵母中的优化表达基因列，其中，该基因的核苷酸如SEQ ID NO：1所示，其编码的本发明的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。我们委托西安新通药物研究有限公司合成该基因并克隆入酵母细胞，简而言之，用如SEQ ID NO：3和4所示的上下游引物以该合成的基因为模板，进行PCR扩增，扩增产物经EcoR I和Xba I双酶切后连接到pPICZαA(可购自Invitrogen公司)的EcoR I和Xba I的多克隆位点之间，经测序确认正确后，将阳性质粒转化入酵母GS115株(可购自Invitrogen公司)中，以Zeocin筛选出阳性酵母细胞。

[0026] 将构建好的阳性酵母细胞接种于25ml种子培养基，于30℃、220rpm震荡培养，直至OD600达到4.5，其中种子培养基的配方为：2％(W/W)蛋白胨、1％(W/W)酵母提取物、1.34％(W/W)YNB(无氨基酵母氮源)、4*10-5％(W/W)生物素、和0.05M pH7.8磷酸缓冲液。然后，将25ml种子培养产物接种入100ml发酵培养基中，于32℃、200rpm震荡培养，每12小时补加甲醇至0.5％(V/V)，培养48小时，其中发酵培养基的配方为：2％(W/W)蛋白胨、1％(W/W)酵母提取物、1.34％(V/V)YNB(无氨基酵母氮源)、4*10-5％(W/W)生物素、0.5％(V/V)甲醇和
0.05M pH7.8磷酸缓冲液。然后，于4℃、1500rpm离心发酵培养产物，保留上清液，上样于Sephadex G-75层析柱，以0.05M pH7.8磷酸缓冲液进行洗脱，收集280nm紫外检测出的最大洗脱峰，经SDS-PAGE检测，其分子量约为33kDa，归一计算其表达量为2.8g/L。然后将收集的洗脱峰冷冻干燥，于-20℃保存，即制备出本发明的多肽。

[0027] 另外，参照以上方法，将野生型蛋白质(参见GenBank登录号BAA21929.1)的编码基因导入酵母GS115中，表达出野生型蛋白质作为对照多肽。

[0028] 实施例2本发明的多肽的稳定性研究

[0029] 参照Harrach等(J Protein Chem,14:41-52)所述的蛋白酶活性检测方法，分别检测高温保存不同时间的实施例1制备的本发明的多肽和对照多肽对底物L-Pyr-Phe-Leu-pNA的水解活性。为方便比较，以1mg对照多肽在高温保存0天(即从-20℃保存状态下拿出立刻进行检测)时的活性计为1，1mg不同多肽在不同条件下保存后的相对活性如表1所示。

[0030] 表1多肽的稳定性

[0031]

[0032] 由表1可见，等量的本发明的多肽与野生型的对照多肽的活性在新鲜制备时是基本相同的，但是随着高温保存时间的推移，在没有添加稳定剂的情况下，对照多肽快速失活，即使在室温(25℃)下，保存两个月也仅剩下37％的活性；而本发明的多肽的稳定性则强得多，在45℃的高温下保存两个月，仍旧能检测出30％的活性，而在更符合实际储运情况的室温(25℃)下，保存两个月的活性仍旧能保持90％左右，这样的性质是特别有益于实际应用的。

[0033] 实施例3二酶片的制备

[0034] 取淀粉502克和乳糖130克，加入50％(V/V)乙醇制成软材，制粒，在45℃下干燥至含水量低于5％(W/W)，过20目筛整理，即制得丸芯。

[0035] 取90克实施例1制备的本发明的多肽、48克胰蛋白酶和100克芦丁，与5克二氧化硅微粉、25克微晶纤维素和上述丸芯混合均匀，压片，压成1000片。

[0036] 取160克oprdry标准型包衣粉，溶于4L 75％(V/V)乙醇中，配制成肠溶包衣液。将上述成形的片置于流化床内，启动流化床，以雾化喷嘴向这些成形的片喷肠溶包衣液，其中流化床设置的参数为：流化床的床层温度40℃，流化气速为2.0m/s，包衣液的流速为0.3ml/min，雾化气压为0.20mpa。包衣完成后，继续保温10分钟，即得本发明的二酶片。