一种基于环介导等温扩增技术原理的组织胞浆菌感染分子诊断试剂盒及其应用

摘要

本发明涉及一种基于环介导等温扩增技术原理的组织胞浆菌感染分子诊断试剂盒及其应用。本发明选择了合适的靶序列，针对ITS片段及M抗原基因设计得到合适的LAMP引物组，该引物组特异性十分优异，且灵敏度高，因此适用于组织胞浆菌的早期感染诊断，以及样品中组织胞浆菌的检测和鉴定。使用该引物组诊断组织胞浆菌，具有快速、简便、操作性强、结果判读方便的优势，解决了临床上组织胞浆菌感染确诊时间周期长、对检测人员技术和实验室平台条件要求高等问题，可制备成试剂盒，适于广泛推广应用。

权利要求

1.一种可早期诊断组织胞浆菌感染的引物组，其特征在于，所述的引物组由核苷酸序列分别为SEQ NO.28、SEQ NO.29、SEQ NO.30、SEQ NO.31、SEQ NO.32和SEQ NO.33的六条核苷酸序列组成。

2.权利要求1所述的引物组在制备早期诊断组织胞浆菌感染的试剂中的用途。

3.权利要求1所述的引物组在制备检测样品中组织胞浆菌存在的试剂中的用途。

4.一种可早期诊断组织胞浆菌感染的试剂盒，所述的试剂盒包含权利要求1所述的引物组。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括dNTPs、链置换DNA聚合酶和PCR反应液。

说明书

一种基于环介导等温扩增技术原理的组织胞浆菌感染分子诊

断试剂盒及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分子检测技术领域，具体地说，是一种基于环介导等温扩增技术原理的组织胞浆菌感染分子诊断试剂盒及其应用。

背景技术

[0002] 组织胞浆菌属是一个常见于鸟类和蝙蝠粪便的双相型真菌属，其在自然状态下为菌丝相，而在动物或人体内转化为酵母相。组织胞浆菌属包含三个物种，包括荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、组织胞浆菌杜氏变种(Histoplasma capsulatum var.duboisii)、马皮疽荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum var.farciminosum)，其中马皮疽荚膜组织胞浆菌在马中造成淋巴管炎家畜流行病。组织胞浆菌病(Histoplasmosis，HP)是由双相型组织胞浆菌所引起的广泛分布于全球的真菌病，组织胞浆菌病分由荚膜组织胞浆菌所引起的美洲型HP、由组织胞浆菌杜氏变种和马皮疽荚膜组织胞浆菌引起的非洲型组织胞浆菌病。

[0003] 人类常因吸入被鸟类或蝙蝠粪便污染的泥土或尘埃中的真菌孢子而感染，临床误诊率、死亡率高达80％。1906年美国军事病理学家塞缪尔·泰勒·达林报道了首例，当时研究表明最普遍的是俄亥俄州和密西西比河谷。近百年来的研究大多认为该病是一种地方性流行病，临床表现多样，总体分为无症状型、急性肺型、播散型以及慢性肺型，主要流行于美洲、非洲、亚洲等地区，欧洲相对少见，故既往该病在我国未引起足够重视，然而近20年来相关报道近期呈上升趋势，例如桂希恩等流行病学调查显示我国存在组织胞浆菌感染的人群，并且有地域差异，东南部地区感染率高于西北部；肺部疾病患者感染率高于正常人，尤以肺结核患者为高。

[0004] HP感染的预后与能否早期明确诊断密切相关，如何推动HP诊断的研究，尽早开发出快速、特异且易于操作的诊断技术方法，是目前临床HP感染早期检测技术研究迫切需要解决的问题。

[0005] 目前，国内外临床真菌实验室血清学试验曾使用乳胶凝集、免疫扩散、补体结合、免疫萤光及放射免疫检验抗体，但发病的早期诊断率低。组织胞浆菌素皮试可能有助于慢性患者的诊断，但免疫缺陷者常不出现反应，因此皮肤试验仅主要用于流行病调查。近来国外亦常检测患者尿液、血清、胸水或脑脊液的组织胞浆菌多糖抗原，其中尿液阳性率最高，并提示活动性感染，可作为早期的诊断依据。以培养、病理检查为代表的病原真菌形态学诊断方法虽有耗时长等局限，但仍是临床上侵袭性真菌病诊断的金标准，组织胞浆菌病亦不例外，但由于其菌体大小及形态与利什曼原虫无鞭毛体相似，二者常被混淆，后者存在细小杆状着色深的动基体，而前者无动基体，这是形态上区别两种病原体的关键，但是却对病理镜检人员要求颇高。最可靠的病原诊断是真菌培养或动物接种，骨髓、病变组织穿刺物、血、痰均可作培养，但存在假阴性率较高、耗时长(培养时间至少2周)等缺陷。

[0006] 近年来，非培养诊断技术逐渐成为国内外侵袭性真菌病早期诊断技术研究的热点，其技术路线主要是基于免疫学原理的血清学方法和以核酸检测技术为代表的分子生物学方法。总体而言，这两大类技术方法各有优势，虽然部分血清学技术方法经过改进相对成熟，敏感性及特异性尚可，但基于免疫学原理的固有属性也导致无法规避假阳性、假阴性等问题；而以核酸检测技术为代表的分子生物学技术方法虽尚未完全成熟，但具有很好地弥补目前血清学方法的弊端的技术优势，具有较高的发展潜力与临床应用价值。

[0007] 基于核酸检测原理的HP早期诊断技术主要包括DNA条形码图谱技术和DNA序列分析等。理论上讲，DNA序列分析是鉴定组织胞浆菌的金标准。但PCR技术需要PCR仪器，对基础设施和人员要求较高，常因国内实验室不能严格分区、实验人员经验不足加上高灵敏度易污染使结果呈现阴性、假阳性等。LMAP技术是2000年由日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，短短几年，该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中，在2009年甲型H1N1流感事件中，日本荣研化学株式会社(以下简称“荣研公司”)接受WHO的邀请完成了H1N1环介导等温扩增法检测试剂盒的研制，通过早期快速诊断对防止该病症的快速蔓延发挥了积极作用。LMAP技术的优点为：灵敏度高(比传统的PCR方法高2～5个数量级)；反应时间短(30～60分钟就能完成反应)；临床使用对样本纯度要求低(能直接扩增从临床标本中提取的DNA样本)；不需要特殊的仪器(推荐用实时浊度仪，不需要将反应后的反应管打开，避免污染)；操作简单(不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、酶和模板混合于反应管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左右保温30～60分钟，肉眼观察结果)。其存在的缺点是引物设计要求比较高，这正是研究突破的重点。

[0008] 综上所述，基于针对HP菌株基因组各DNA片段的序列分析，筛选出适当的靶基因，研发一种基于LAMP技术原理的组织胞浆菌感染早期快速诊断的技术方法，对于解决临床上组织胞浆菌感染确诊时间周期长、对检测人员技术和实验室平台条件要求高等问题具有十分重要的意义，将为临床上早期诊断和及时治疗提供便利。

发明内容

[0009] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种可早期诊断组织胞浆菌感染的引物组。

[0010] 本发明的再一的目的是，提供所述的引物组的用途。

[0011] 本发明的另一的目的是，提供一种可早期诊断组织胞浆菌感染的试剂盒。

[0012] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

[0013] 一种可早期诊断组织胞浆菌感染的引物组，所述的引物组由核苷酸序列分别为SEQ NO.28、SEQ NO.29、SEQ NO.30、SEQ NO.31、SEQ NO.32和SEQ NO.33的六条核苷酸序列组成。

[0014] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

[0015] 如上所述的引物组在制备早期诊断组织胞浆菌感染的试剂中的用途。

[0016] 如上所述的引物组在制备检测样品中组织胞浆菌存在的试剂中的用途。

[0017] 如上所述的引物组在制备试剂中的用途，所述的试剂用于从粗球孢子菌、申克孢子丝菌、马尔尼菲青霉菌、荚膜青霉菌、曲霉菌属、鳞质霉属、孢子菌属、金孢子菌属、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、裸子囊菌属、犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、犬小孢子菌、毛霉菌属、嗜热毁丝霉属、毛孢子菌属、念珠菌属、新型隐球菌、格特隐球菌以及组织胞浆菌中鉴别出组织胞浆菌。

[0018] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

[0019] 一种可早期诊断组织胞浆菌感染的试剂盒，所述的试剂盒包含由核苷酸序列分别为SEQ NO.28、SEQ NO.29、SEQ NO.30、SEQ NO.31、SEQ NO.32和SEQ NO.33的六条核苷酸序列组成的引物组。

[0020] 优选地，所述的试剂盒还包括dNTPs、链置换DNA聚合酶和PCR反应液。

[0021] 本发明优点在于：本发明选择了合适的靶序列，针对ITS片段及M抗原基因设计得到合适的LAMP引物组，该引物组特异性十分优异，且灵敏度高，显著优于其他引物，因此适用于组织胞浆菌的早期感染诊断，以及样品中组织胞浆菌的检测和鉴定。使用该引物组诊断组织胞浆菌，具有快速、简便、操作性强、结果判读方便的优势，解决了临床上组织胞浆菌感染确诊时间周期长、对检测人员技术和实验室平台条件要求高等问题。

附图说明

[0022] 图1.第六套引物与靶序列结合并成环的结构位点图。

[0023] 图2.六套引物和阳性对照、阴性对照样本扩增曲线。

[0024] 图3.第六套引物的菌株凝胶电泳结果。从左至右1～7为组织胞浆菌属：CBS114.388、CBS215.53、CBS136.72、CBS633.91、CBS205.35、CBS537.84；7～26为相近属种：
CBS144.34、ATCC10268、ATCC201013、CBS134186、CBS113.61、ATCC64704、CBS113838、CBS130793、CBS221.64、CBS204.48、ATCC38033、ATCC36031、ATCC10215、ATCC200787、CBS117.65、ATCC20735、CBS1878、CBS1920、B3501、WM178。

[0025] 图4.针对第六套引物，LAMP反应后各管浊度表现结果。从左至右1～7为组织胞浆菌属：CBS114.388、CBS215.53、CBS136.72、CBS633.91、CBS205.35、CBS537.84；7～16为相近属种：CBS144.34、ATCC10268、ATCC201013、CBS134186、CBS113.61、ATCC64704、CBS113838、CBS130793、CBS221.64、CBS204.48，LAMP反应体系下，65℃，90min后，表现为阳性样本显示荧光绿。

[0026] 图5.针对第六套引物，不同浓度梯度的DNA与引物反应后的扩增曲线。对应数值为：53ng：1860，0.187；5.3ng：2160，0.171；530pg：2460，0.148；53pg：2600，0.14；5.3pg：2700，0.13。

[0027] 图6.针对第六套引物，不同浓度梯度的组织胞浆菌DNA可见性实验反应结果。从左至右1～7样本里DNA含量依次为53ng、5.3ng、530pg、53pg、5.3pg、530fg、53fg，第8个样本为ddH2O，LAMP反应体系下，65℃，90min后，表现为阳性样本显示荧光绿，从左至右1～5样本均显示荧光绿。

[0028] 图7.针对第三套引物，不同浓度DNA LAMP扩增后电泳图。其中8为阴性对照，1～7依次为53ng、5.3ng、530pg、53pg、5.3pg、530fg、53fg。

具体实施方式

[0029] 下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

[0030] 实施例1用于早期诊断组织胞浆菌感染的引物的筛选及其特异性和敏感性验证[0031] 一、主要实验材料及设备

[0032] 1 菌株

[0033] 26株组织胞浆菌标准菌株(均购于荷兰CBS国际真菌多样性研究中心)、4株临床与环境分离菌株(均为组织胞浆菌杜氏变种)及50株相关种属菌株(来源于ATCC、CBS及第二军医大学长征医院皮肤病真菌病研究所真菌库)。

[0034] 2 设备

[0035] 超净工作台：CA-1390-1垂直层流洁净工作台，上海上净净化设备有限公司；生物安全柜：NUAIRE Biological Safefy Cabinet ClassⅡ；隔水式电热恒温培养箱：Heraeus B5060EKCO2；纯水机：HITECH water purification system；微量移液枪：0.5～10μl(FINNpipette)，20～200μl(Eppendorf Research)，1000μl(Eppendorf Research)；高压消毒锅：SANYO AutoCLAVE MLS-3020；Colibri：上海达迈生物科技公司；Loopamp LA-320C实时浊度仪：北京蓝谱生物科技有限公司；高速离心机：Eppendorf centrifuge 5810R，Eppendorf North America,Inc.；制冰机：Scotsman AF100；恒温水浴箱：上海精密仪器；PCR仪器：BIORAD C1000Touch，美国产；电泳仪：TAN ETS 300，国产；凝胶成像分析系统：FR-
980复日生物电泳图像分析系统。

[0036] 3 试剂及培养基

[0037] YPD培养基：1％Yeast Extract(酵母提取物)：OXOID，2％Peptone(蛋白胨)：OXOID，2％Dextrose(葡萄糖)：上海国药集团化学试剂有限公司。

[0038] 沙堡弱氏培养基(SDA)：1％Peptone(蛋白胨)：OXOID，4％Dextrose(葡萄糖)：上海国药集团化学试剂有限公司，1.5％琼脂粉：上海国药集团化学试剂有限公司。

[0039] 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：20％马铃薯，2％葡萄糖，2％琼脂，100ml水，将马铃薯洗净，去皮并切成小块，立即投入水中煮沸20分钟，纱布过滤，保留滤液并加入其它成分，加热使琼脂融化，补足水量，分装，121℃灭菌20分钟，冷却至60℃左右，每个无菌培养皿分装15～20ml，凝固后倒置，4℃冰箱保存。

[0040] 科玛嘉培养基：法国科玛嘉生物科技公司。

[0041] Loopamp DNA amplification kit：日本荣研化学株式会社。

[0042] Loopamp荧光目视检测试剂盒：日本荣研化学株式会社。

[0043] ITS片段(Genbank：KF443065)及M抗原基因(Genbank：AF026268)、引物：均由上海生工合成。

[0044] TIANGEN 2×pfu PCR MasterMix高保真酶：北京天根生物科技有限公司。

[0045] DNA Marker(DL2000)：上海宝生物工程有限公司(TAKARA)。

[0046] 分析纯氯化苄：生工上海生物科技有限公司。

[0047] 真菌DNA抽提液：1mL 1M Tris.Hcl，4mL 500mM EDTA，加ddH2O定容至10mL。

[0048] AR级3M NaAc，20％SDS溶液，异丙醇溶液，70％乙醇溶液。

[0049] 4 其它耗材

[0050] 12CM培养皿：上海卓康生物科技有限公司；微量移液器吸头：上海卓康生物科技有限公司；EP管(1.5ml、5ml)：上海卓康生物科技有限公司；PCR八连管：Bio-Rad公司。

[0051] 二、实验方法

[0052] (一)靶序列确定及引物设计

[0053] 1 靶序列ITS片段(Genbank：KF443065)及M抗原基因(Genbank：AF026268)[0054] 从美国NCBI核酸数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得已得到证实的组织胞浆菌荚膜变种对应序列。

[0055] 2 引物设计

[0056] 设计ITS以及M抗原对应的LAMP反应引物，根据下列引物筛选条件筛选适合的几套引物，根据软件设计出的引物需满足以下条件：

[0057] (1)Tm(引物溶解温度)：即与互补序列配对结合的引物达到50％时需要的温度，决定因素有序列中碱基G、C含量，引物本身的浓度，反应体系盐浓度。因此LAMP反应是在固定的反应条件下(引物浓度为0.1μM，阳离子浓度50mM)下进行，一套引物中不同的引物所对应的适宜Tm温度分别是：F1c和B1c在64-66℃，F2、B2、F3和B3的适宜Tm为59-61℃，环引物为64-66℃；

[0058] (2)各引物末端序列的稳定性：各个引物的末端是DNA合成的起始端，因此必须具备一定的稳定性，尤其是F1c的5’与F1的3’末端结合成为延长反应的起始，因此FIP的F1c序列5’末端序列十分重要。需满足的条件是dG(吉布斯自由能)≤－4kcal/mol，dG值越小，越容易与靶序列结合；

[0059] (3)引物序列中碱基G、C含量：一般认为40％～60％比较合适；

[0060] (4)引物的二级结构：要尽量避免二级结构的发生，尤其在FIP和BIP中，避免与3’段序列互补而导致引物自身结合形成二聚体；

[0061] (5)引物之间的距离：F2外侧至B2外侧(扩增区域)间隔120-160bp，F2的5’段至F1c的3’端间隔40-60bp。

[0062] 通过上述条件筛选，共筛选出六套引物，序列如下所示：

[0063] 第一套引物：

[0064] HP1F3：ACCGGACCTGTTGCCTC(SEQ NO.1)

[0065] HP1B3：GCATTTCGCTGCGTTCTTCA(SEQ NO.2)

[0066] HP1FIP：CCGACGGTTCTTACGGTGTCCTGCCGGGGGAGCTTCT(SEQ NO.3)

[0067] HP1BIP：AACGATTGGCGTCTGAGCATGATCGATGTCGGAACCAAGAGA(SEQ NO.4)

[0068] 第二套引物：

[0069] HP2F3：AGCCTCTGACCGGGAACC(SEQ NO.5)

[0070] HP2B3：CAAGAGATCCGTTGTTGAAAGT(SEQ NO.6)

[0071] HP2LF：GGCAACAGGTCCGGTAGAC(SEQ NO.7)

[0072] HP2LB：GAACCGTCGGTGAACGATTG(SEQ NO.8)

[0073] HP2FIP：AAGCTCCCCCGGCAGCATCCTACCCGGCCACCCTT(SEQ NO.9)

[0074] HP2BIP：TCCGCCGGGGACACCGTAATCGCTCTCATGCTCAGACG(SEQ NO.10)

[0075] 第三套引物：

[0076] HP3F3：GGCGTCTGAGCATGAGAG(SEQ NO.11)

[0077] HP3B3：GCGCTTGAGGGTTGCA(SEQ NO.12)

[0078] HP3LB：GGTATTCCGGGGGGCAT(SEQ NO.13)

[0079] HP3FIP：TTACTTATCGCATTTCGCTGCGTCTTTCAACAACGGATCTCTTGG(SEQ NO.14)[0080] HP3BIP：TCGAATCTTTGAACGCACATTGCGATGACGCTCGGACAGGC(SEQ NO.15)

[0081] 第四套引物：

[0082] HP4F3：TGCGCCCCCTGGTAT(SEQ NO.16)

[0083] HP4B3：ATGGTGGGCAGGAGCC(SEQ NO.17)

[0084] HP4LF：GCTTGAGGGTTGCAATGACG(SEQ NO.18)

[0085] HP4LB：CAGTGGCGGTGTCGAGT(SEQ NO.19)

[0086] HP4FIP：ACGACGGCCCAACACACAAGGGCATGCCTGTCCGAG(SEQ NO.20)

[0087] HP4BIP：GCGGGACGTGCCCGAAATTGGCAAAGCCCCATACGC(SEQ NO.21)

[0088] 第五套引物：

[0089] 1F3-HPmsp：ACAGCGCCAACAACAAAGT(SEQ NO.22)

[0090] 1B3-HPmsp：GCTTCATTGCTACCGTCACC(SEQ NO.23)

[0091] 1LF-HPmsp：CGCGTTGGGGATCAAGC(SEQ NO.24)

[0092] 1LB-HPmsp：ATACCCAAGAGGTCGCCC(SEQ NO.25)

[0093] 1FIP-HPmsp：CATCGAAGATCGAGCCGTCGGTCGTCCTAGTGGGCTCATC(SEQ NO.26)[0094] 1BIP-HPmsp：CTGCTCACGAGCGCCTCAACCATACGCGTATGCATCCGTA(SEQ NO.27)[0095] 第六套引物：

[0096] 2F3-HPmsp：ACAGCGCCAACAACAAAGT(SEQ NO.28)

[0097] 2B3-HPmsp：TTCATTGCTACCGTCACCG(SEQ NO.29)

[0098] 2LF-HPmsp：CCGGAATAGGTCATGTTCACG(SEQ NO.30)

[0099] 2LB-HPmsp：AATACCCAAGAGGTCGCCC(SEQ NO.31)

[0100] 2FIP-HPmsp：CATCGAAGATCGAGCCGTCGGCTCATCGCTTGATCCCCAAC(SEQ NO.32)[0101] 2BIP-HPmsp：CTGCTCACGAGCGCCTCAACCATACGCGTATGCATCCGTA(SEQ NO.33)[0102] 其中第六套引物与靶序列结合并成环的结构位点图如图1所示。

[0103] 3 引物筛选

[0104] 将设计出的引物分别与模板DNA(组织胞浆菌)按照LAMP反应体系加样，置于Loopamp LA-320C实时浊度仪中反应，预设反应温度为65℃，反应时间为90min。

[0105] LAMP反应体系如下：总体积25μL，包括1μL FIP(40μmol/L)、1μL BIP(40μmol/L)、1μL F3(5μmol/L)、1μL B3(5μmol/L)、1μL Loop primer F(20μmol/L)、1μL Loop primer B(20μmol/L)、12.5μL Buffer 2×、3.5μL ddH2O、2μLDNA sample，1μL Bst DNA Polymerase。

[0106] 反应结束后观察每套引物反应扩增曲线，并对各套引物进行特异性和敏感性实验。

[0107] (二)待验证菌株全基因组DNA抽提

[0108] 1 菌株的复苏与培养

[0109] (1)菌株的复苏与培养：取出—20℃保藏的菌株，置于20℃下复苏24小时，使其恢复繁殖活力。在无菌条件下，分别将临床株转种到沙堡氏培养基(SDA)斜面培养基，30℃孵育培养48-72小时。菌株来自于CBS、ATCC及第二军医大学长征医院皮肤病真菌病研究所真菌库的临床与环境分离菌株，经过SDA培养基或PDA培养基培养。

[0110] 2 氯化苄法抽提各株组织胞浆菌全基因组DNA

[0111] ①EP管中加入500μL真菌DNA抽提液，从SDA培养基中挑取火柴头大小体积菌落，后剧烈震荡1min；

[0112] ②在EP管中加入50μL 20％SDS和300μL氯化苄溶液，剧烈震荡，至溶液呈乳状，将EP管置于50℃水浴1小时，每十分钟震荡混合一次；

[0113] ③水浴结束，加入300μL 3M NaAc(醋酸钠)冰水浴15分钟；

[0114] ④将冰水浴后的EP管置于高速离心机中，选择6000rpm转速，15min后，小心吸出上清并转移至干净EP管中；

[0115] ⑤在已转移出的上清中加入等体积预冷的异丙醇，室温下沉淀20min，再次离心，转速为10000rpm，15min；

[0116] ⑥取出EP管，小心弃上清，并在沉淀中加入等体积预冷的70％乙醇，再次10000rpm，10min离心；

[0117] ⑦离心结束后，弃上清，小心将沉淀置于室温下风干，并50μL TE溶解。

[0118] 将上述DNA置于－20℃冰箱冷藏保存。

[0119] 3 分光分度计检测各菌株基因组DNA及其浓度

[0120] 利用Eppendorf Biophotometer分光分度计，按操作手册操作检测基因组DNA的浓度。

[0121] (三)特异性实验

[0122] 1 将筛选出的各套引物分别与上述步骤已准备好的各菌株DNA按照LAMP体系，65℃，90min进行反应，观察分别的扩增反应情况。设立组织胞浆菌作为阳性对照，双蒸水组作为阴性对照。

[0123] 反应体系如下总体积25μL包括1μL FIP(40μmol/L)、1μL BIP(40μmol/L)、1μL F3(5μmol/L)、1μL B3(5μmol/L)、1μL Loop primer F(20μmol/L)、1μL Loop primer B(20μmol/L)、12.5μL Buffer 2×、3.5μL ddH2O、2μL DNA sample，1μL Bst DNA Polymerase。

[0124] 2 LAMP凝胶电泳检查

[0125] ①用HE120电泳仪提供的灌胶模具灌制12×6厘米的1.4％琼脂糖凝胶：在烧杯中加入1.4g琼脂糖，1M TAE，定容至100mL后充分混匀，加热煮沸，立即将胶液加入灌胶板中，避免产生大量气泡，室温放置至凝胶凝固；

[0126] ②在装有1×TAE缓冲液(40mM Tris-Acetic acid，pH8.0，1mM EDTA)的电泳槽内，小心平放入琼脂凝胶，使其浸没；

[0127] ③每个PCR反应体系中抽取10μL，分别与5μL Ladder Buffer充分混合后上样于1.4％的琼脂凝胶；

[0128] ④120伏电压电泳30min；

[0129] ⑤将琼脂凝胶浸入EB溶液15min；

[0130] ⑥小心取出后浸入双蒸水中10min；

[0131] ⑦取出琼脂凝胶经FR-980复日生物电泳图像分析系统拍照。

[0132] 3 LAMP可见性实验

[0133] 重复上述特异性实验，在LAMP管中依次加入6段引物(FIP、BIP、F3、B3、Loop primer F及Loop primer B)及缓冲液，链置换DNA聚合酶等，依次加入组织胞浆菌标准株以及其他种属的标准株或临床标本中分离出的菌株，在配好各组LAMP反应体系后，在LAMP管中依次加入1μL钙黄绿素以指示实验结果。63℃，60min反应结束后，取出反应管观察各组颜色变化。

[0134] (四)敏感性实验

[0135] 1 扩增曲线

[0136] 将组织胞浆菌全基因组DNA浓度分别十倍梯级稀释数次，使DNA含量分别为53ng、5.3ng、530pg、53pg、5.3pg、530fg、53fg、0fg(ddH2O)。将上述不同浓度梯度的DNA分别按照LAMP体系，65℃，90min反应，结束后观察扩增情况。设立不含DNA组为阴性对照。

[0137] 2 LAMP可见性实验

[0138] 重复上述步骤，在配好各组LAMP反应体系后，在LAMP管中依次加入1μL钙黄绿素以指示实验结果。65℃，90min反应结束后，取出反应管观察各组颜色变化。

[0139] 3 比对传统PCR扩增的敏感性差异

[0140] 分别将上述浓度梯度的DNA用ITS引物(ITS4，SEQ  ID  NO .34：TCCTCCGCTTATTGATATGC；ITS5，SEQ ID NO.35：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)通过传统PCR方法扩增，比较两者敏感性差异。用ITS引物PCR扩增组织胞浆菌ITS基因的反应体系为：总体积
50μL，包含3μL DNA(20ng)、25μL 2×pfu PCR Master Mix、2μL ITS5(5μmol/L)、2μL ITS4(5μmol/L)、2μL MgCl2(25μmol/L)、16μL ddH2O；

[0141] PCR反应条件为：

[0142]

[0143] 4 LAMP产物和PCR产物分别凝胶电泳检查

[0144] ①用HE120电泳仪提供的灌胶模具灌制12×6厘米的1.4％琼脂糖凝胶：在烧杯中加入1.4g琼脂糖，1M TAE，定容至100mL后充分混匀，加热煮沸，立即将胶液加入灌胶板中，避免产生大量气泡，室温放置至凝胶凝固；

[0145] ②在装有1×TAE缓冲液(40mM Tris-Acetic acid，pH8.0，1mM EDTA)的电泳槽内，小心平放入琼脂凝胶，使其浸没；

[0146] ③每个PCR反应体系中抽取5μL，分别与1μL Ladder Buffer充分混合后上样于1.4％的琼脂凝胶；

[0147] ④120伏电压电泳30min；

[0148] ⑤将琼脂凝胶浸入EB溶液15min；

[0149] ⑥小心取出后浸入双蒸水中10min；

[0150] ⑦取出琼脂凝胶经FR-980复日生物电泳图像分析系统拍照，比较两种扩增方法对不同浓度DNA扩增效率差异。

[0151] 三、实验结果

[0152] (一)引物验证及筛选

[0153] 六套引物和阳性对照、阴性对照样本扩增曲线如图2所示。结果表明：(1)据ITS与M抗原序列设计出的六套引物中一、三、五自身均不会引起扩增反应。(2)据ITS与M抗原序列设计出的六套引物中二、四出现交叉反应。在本实验中其他与组织胞浆菌相近种属如副粗球孢子菌等出现与组织胞浆菌相同的阳性反应，故为假阳性，特异性不高。故特异性筛选只有第六套引物通过。

[0154] (二)特异性实验

[0155] 1 将筛选出的第六套引物分别与各菌株DNA按照LAMP体系进行反应，观察分别的扩增反应情况。具体如表1所示。

[0156] 表1 特异性实验结果

[0157]

[0158]

[0159]

[0160] 注：*Y表示阳性反应，N表示阴性反应。

[0161] 2 针对第六套引物，菌株凝胶电泳结果如图3所示。由此可知：基于组织胞浆菌M抗原序列设计的引物在LAMP反应体系具有良好的特异性，除了组织胞浆菌菌株均出现阳性结果外，其他菌株包括粗球孢子菌、申克孢子丝菌、马尔尼菲青霉菌、荚膜青霉菌、曲霉菌属、鳞质霉属、孢子菌属、金孢子菌属、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、裸子囊菌属、犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、犬小孢子菌、毛霉菌属、嗜热毁丝霉属、毛孢子菌属、念珠菌属、新型隐球菌、格特隐球菌等均未出现扩增反应。初步验证了基于M抗原序列设计的LAMP引物具有较好的特异性。

[0162] 3 可见性实验

[0163] 针对第六套引物，LAMP反应后各管浊度表现结果见图4。根据扩增反应结束后LAMP管浊度的变化可以初步判断是否发生了扩增，如发生扩增，则表示该反应管内含有目的基因，反之，如反应管清亮则表示无监测的目的基因，未发生扩增反应。

[0164] (三)敏感性实验

[0165] 1 扩增曲线

[0166] 针对第六套引物，不同浓度梯度的DNA与引物反应后扩增曲线如图5所示。由图5的扩增曲线可以看出，基于组织胞浆菌核糖体内基因间隔区M抗原序列的LAMP敏感程度可以达到5.3pg(即10-3ng)。

[0167] 2 可见性实验

[0168] 针对第六套引物，不同浓度梯度的组织胞浆菌DNA可见性实验反应结果如图6所示。

[0169] 3 与传统PCR扩增效率差异

[0170] 使用第三套引物进行LAMP反应的LAMP产物和PCR产物分别凝胶电泳检查，比较两种扩增方法对不同浓度DNA扩增效率差异，不同浓度DNALAMP扩增后电泳图如图7所示，进行对比的结果显示LAMP产物亮度明显超出常规PCR产物的亮度。使用第六套引物进行LAMP反应的LAMP产物和PCR产物分别凝胶电泳的结果同样显示LAMP产物亮度明显超出常规PCR产物的亮度。表明使用本发明的引物检测组织胞浆菌相比于常规PCR方法敏感程度显著提高。

[0171] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。