一种利用气相色谱-质谱快速定量白酒中尿素的方法转让专利
申请号 : CN201510206771.0
文献号 : CN104764850B
文献日 : 2016-03-23
发明人 : 范文来 , 徐岩 , 张顺荣 , 石亚林
申请人 : 江南大学
摘要 :
一种利用气相色谱-质谱快速定量白酒中尿素的方法，属于白酒分析检测技术领域。本发明步骤：（一）使用三氟乙酰胺（MTBSTFA）对尿素和内标C13-尿素标准品溶液进行衍生化处理；（二）使用气相色谱-质谱仪检测尿素和内标C13-尿素确定特征离子并建立选择性反应监测（GC–MS/MS–SRM）方法；（三）使用GC–MS/MS–SRM方法制作尿素标准曲线对不同香型白酒中尿素进行准确定量。本发明使用衍生化结合气相色谱-质谱（GC–MS/MS–SRM）方法分析检测不同香型白酒样品中的尿素。本方法是一种新的白酒尿素定量方法，操作简单，检测限低，结果直观可靠；可进一步利用该检测方法对不同年份不同类别白酒中的尿素进行检测，从而对白酒安全进行更好的控制。
权利要求 :
1.一种利用气相色谱-质谱GC–MS/MS–SRM快速定量白酒中尿素的方法，其特征在于白酒样品仅需进行MTBSTFA衍生反应后就可通过GC–MS/MS–SRM方法快速定量其中微量的尿素，步骤为：
13
（一）使用N-叔丁基二甲硅烷-N-甲基三氟乙酰胺MTBSTFA对尿素和内标 C-尿素标准品溶液进行衍生化处理-1 13
a、用超纯水配制100 mg·L 尿素及内标 C-尿素的标准品贮存液，用超纯水将其稀释-1 13至1 mg·L 的尿素及内标 C-尿素作为标准使用液，4℃冰箱保存；
-1 13
b、分别取100 µL浓度为1 mg·L 的尿素及内标 C-尿素标准使用液置于2 mL样品瓶、氮吹吹干、加50 µL二氯甲烷再次吹干、加50 µL MTBSTFA衍生剂和50 µL乙腈100℃反应60 min、待进样检测；
（二）使用赛默飞世尔TSQ 8000型三重四级杆气相色谱质谱联用仪Triplus RSH
13
GC1310 TSQ 8000检测尿素及内标 C-尿素确定特征离子并建立选择性反应监测GC–MS/MS–SRM方法；
-1
GC条件：进样口温度250℃，载气He，流速1 mL·min ，不分流进样，色谱柱为TG-5MS，
30 m × 0.25 mm × 0.25 µm，Thermo Scientific，升温程序为：-1
起始温度50.0℃、持续1.00 min，以20.0℃·min 升温至170.0℃、持续5.00 min，-1 -1再以4.0℃·min 升温至200.0℃、持续3.00 min，以4.0℃·min 升温至280.0℃、持续
10.00 min；
MS条件：EI电离源，电子能量70 eV，扫描范围40~300 amu，离子源温度300℃，离子传
13
输线温度280℃，得到尿素及内标 C-尿素检测结果；
13
根据衍生化处理后的尿素定性离子m/z 231、147、149和173，内标 C-尿素定性离子m/z 232、147、149和174；建立GC–MS/MS–SRM检测方法，选择特征离子对231-147和
13
232-147分别用于尿素及内标 C-尿素两种物质的定量；数据分析使用Nist 2011；
（三）使用GC–MS/MS–SRM方法制作尿素标准曲线对不同白酒中尿素进行准确定量-1（1）尿素标准曲线制作：将1 mg·L 尿素标准品储备液梯度稀释成一系列标准使用液，-1 13 13分别加入100 µL 浓度200 µg·L 的内标 C-尿素，以尿素/ C-尿素峰面积比为横坐标，
13
尿素/ C-尿素浓度比为纵坐标绘制尿素标准曲线；
13
（2）白酒样品预处理：取100 µL待测的酒样+100 µL内标 C-尿素于2 mL样品瓶、氮吹吹干、加50 µL二氯甲烷再次吹干、加50 µL MTBSTFA衍生剂和50 µL乙腈100℃反应60 min、待进样检测；
（3）白酒中尿素的定量分析
使用GC–MS/MS–SRM方法对白酒样品进行检测，通过尿素标准曲线进行定量。
说明书 :
一种利用气相色谱-质谱快速定量白酒中尿素的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种利用气相色谱-质谱（GC–MS/MS–SRM）快速定量白酒中尿素的方法，特别是涉及一种运用MTBSTFA试剂衍生反应结合GC–MS/MS–SRM方法来定量不同白酒中的尿素。此方法的特别之处在于仅需进行简单的衍生反应就可通过GC–MS/MS–SRM方法快速定量白酒中微量的尿素，属于白酒分析检测技术领域。
背景技术
[0002] 中国白酒采用固态多种微生物混合发酵，是一个复杂开放的体系，这增加了研究白酒中尿素的难度。尿素是中国白酒中不利物质的重要前体。白酒是世界八大蒸馏酒（白兰地Brandy、威士忌Whisky、伏特加Vodka、金酒Gin、朗姆酒Rum、龙舌兰酒Tequila、日本清酒Sake、中国白酒Spirit）之一，白酒根据其风味化合物特征分为多种香型，目前主要有浓香、酱香、清香、米香、凤香、药香、豉香、芝麻香、兼香、特型和老白干11种香型。
[0003] 随着人们对食品安全的重视度增加，各酒企也越来越关注白酒中的安全指标，所以对尿素定量显得尤为重要。
[0004] 目前，国内关于白酒中尿素的研究很少，对白酒尿素成分的检测方法，主要有：
[0005] 1、液相色谱（HPLC–FD）
[0006] 高效液相色谱适合分析难气化、不易挥发的物质，如酒中的有机酸、氨基酸、生物胺等物质。所以液相色谱多用于检测白酒中一些安全指标物质。
[0007] 2、紫外分光光度法
[0008] 比色法即用某种特殊试剂与尿素直接作用，产生显色反应，然后在特定的波长下用分光光度计测定其吸光度，再换算成尿素含量。较常用的直接比色法有二乙酰一肟法、邻苯二甲醛法、对二甲氨基苯甲醛法3种。
[0009] 本发明所用GC–MS/MS–SRM方法只需进行简单的衍生反应后就可通过GC–MS/MS–SRM方法快速定量白酒中微量的尿素。由于尿素很可能是形成蒸馏酒发酵过程中不利物质的重要前体，为了广大消费者的健康考虑，建立一套快速定量白酒中尿素的方法势在必行。
发明内容
[0010] 本发明所要解决的技术问题是提供一种利用气相色谱-质谱（GC–MS/MS–SRM）快速定量白酒中尿素的方法，本发明使用三氟乙酰胺（MTBSTFA）对白酒样品进行衍生化处理，使用 GC–MS/MS–SRM方法检测，通过标准曲线进行定量。本方法是一种新的白酒尿素定量方法，操作简单，检测限低，结果直观可靠。
[0011] 本发明的技术方案：一种利用气相色谱-质谱（GC–MS/MS–SRM）快速定量白酒中尿素的方法，白酒样品仅需进行MTBSTFA衍生反应后就可通过GC–MS/MS–SRM方法快速定量其中微量的尿素，该方法包括如下步骤：
[0012] （一）使用N-叔丁基二甲硅烷-N-甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA）对尿素和内标13C-尿素标准品溶液进行衍生化处理：
[0013] a、用超纯水配制100 mg·L-1尿素及内标 13C-尿素的标准品贮存液，用超纯水将其-1 13稀释至1 mg·L 的尿素及内标 C-尿素作为标准使用液，4℃冰箱保存。
[0014] b、分别取100 µL浓度为1 mg·L-1的尿素及内标13C-尿素标准使用液置于2 mL样品瓶、氮吹吹干、加50 µL二氯甲烷再次吹干、加50 µL MTBSTFA衍生剂和50 µL乙腈100℃反应60 min，待进样检测。
[0015] （二）使用赛默飞世尔TSQ 8000型三重四级杆气相色谱质谱联用仪（Triplus RSH13
GC1310 TSQ 8000）（上海赛默飞世尔科技公司）检测尿素及内标 C-尿素确定特征离子并建立选择性反应监测GC–MS/MS–SRM方法；
GC1310 TSQ 8000）（上海赛默飞世尔科技公司）检测尿素及内标 C-尿素确定特征离子并建立选择性反应监测GC–MS/MS–SRM方法；
[0016] GC条件：进样口温度250℃，载气He，流速1 mL·min-1，不分流进样，色谱柱为TG-5MS（30 m × 0.25 mm × 0.25 µm，Thermo Scientific），升温程序如表1：
[0017] 表1 尿素检测气相升温条件
[0018]速率（℃ min-1） 温度（℃） 持续时间（min）
初始条件 50.0 1.00
1 20.0 170.0 5.00
2 4.0 200.0 3.00
3 4.0 280.0 10.00
初始条件 50.0 1.00
1 20.0 170.0 5.00
2 4.0 200.0 3.00
3 4.0 280.0 10.00
[0019] MS条件：EI电离源，电子能量70 eV，扫描范围40~300 amu，离子源温度300℃，离13
子传输线温度280℃。尿素及内标 C-尿素检测结果如图1，2。
子传输线温度280℃。尿素及内标 C-尿素检测结果如图1，2。
[0020] 根据图1，2，衍生化处理后的尿素定性离子m/z 231、147、149和173，内标13C-尿素定性离子m/z 232、147、149和174。建立GC–MS/MS–SRM检测方法，选择特征离子对13
231-147及232-147分别用于尿素及内标 C-尿素两种物质的定量。数据分析使用Nist
2011。
231-147及232-147分别用于尿素及内标 C-尿素两种物质的定量。数据分析使用Nist
2011。
[0021] （三）使用GC–MS/MS–SRM方法制作尿素标准曲线对不同白酒中尿素进行准确定量。
[0022] （1）尿素标准曲线制作：将1 mg·L-1尿素标准品储备液梯度稀释成一系列标准使-1 13 13用液，分别加入100 µL 浓度200 µg·L 的内标 C-尿素，以（尿素/ C-尿素）峰面积比为
13
横坐标，（尿素/ C-尿素）浓度比为纵坐标绘制尿素标准曲线。
13
横坐标，（尿素/ C-尿素）浓度比为纵坐标绘制尿素标准曲线。
[0023] （2）白酒样品预处理：取100 µL待测的酒样+100 µL内标13C-尿素于2 mL样品瓶、氮吹吹干、加50 µL二氯甲烷再次吹干、加50 µL MTBSTFA衍生剂和50 µL乙腈100℃反应60 min、待进样检测。
[0024] （3）白酒中尿素的定量分析
[0025] 使用GC–MS/MS–SRM方法对白酒样品进行检测，通过尿素标准曲线进行定量。
[0026] 本发明的有益效果：本发明使用三氟乙酰胺（MTBSTFA）对白酒样品进行衍生化处理，使用 GC–MS/MS–SRM方法进行检测，通过制作尿素标曲，最终对不同香型白酒中微量尿素进行定量。本发明建立了一种新的白酒尿素定量方法，操作简单，检测限低，结果直观可靠。
附图说明
[0027] 图1尿素及内标13C-尿素气相色谱图，尿素及内标13C-尿素衍生物，两个物质一起13
出峰，分别选择特征离子对231-147及232-147用于尿素及内标 C-尿素两种物质的定量。
出峰，分别选择特征离子对231-147及232-147用于尿素及内标 C-尿素两种物质的定量。
[0028] 图2尿素及内标13C-尿素质谱图
[0029] 图3尿素标准曲线，以（尿素/13C-尿素）峰面积比为横坐标，（尿素/13C-尿素）浓度比为纵坐标作图。
具体实施方式
[0030] 实施例1：不同香型白酒中尿素定量
[0031] （一）使用N-叔丁基二甲硅烷-N-甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA）对尿素及内标13C-尿素标准品溶液进行衍生化处理
[0032] a、用超纯水配制100 mg·L-1尿素及内标 13C-尿素的标准品贮存液，用超纯水将其-1稀释至1 mg·L 作为标准使用液，4℃冰箱保存。
[0033] b、分别取100 µL 浓度为1 mg·L-1尿素及内标 13C-尿素标准使用液样品置于2 mL样品瓶、氮吹吹干、加50 µL二氯甲烷再次吹干、加50 µL MTBSTFA衍生剂和50 µL乙腈100℃反应60 min、待进样检测。
[0034] （二）使用赛默飞世尔TSQ 8000型三重四级杆气相色谱质谱联用仪（Triplus RSH13
GC1310 TSQ 8000）（上海赛默飞世尔科技公司）检测尿素及内标 C-尿素确定特征离子并建立选择性反应监测GC–MS/MS–SRM方法
GC1310 TSQ 8000）（上海赛默飞世尔科技公司）检测尿素及内标 C-尿素确定特征离子并建立选择性反应监测GC–MS/MS–SRM方法
[0035] GC条件：进样口温度250℃，载气He，流速1 mL·min-1，不分流进样，色谱柱为TG-5MS（30 m × 0.25 mm × 0.25 µm，Thermo Scientific），升温程序如表1：
[0036] 表1尿素检测气相升温条件
[0037]速率（℃ min-1） 温度（℃） 持续时间（min）
初始条件 50.0 1.00
1 20.0 170.0 5.00
2 4.0 200.0 3.00
3 4.0 280.0 10.00
初始条件 50.0 1.00
1 20.0 170.0 5.00
2 4.0 200.0 3.00
3 4.0 280.0 10.00
[0038] MS条件：EI电离源，电子能量70 eV，扫描范围40~300 amu，离子源温度300℃，离13
子传输线温度280℃。尿素及内标 C-尿素检测结果如图1，2。
子传输线温度280℃。尿素及内标 C-尿素检测结果如图1，2。
[0039] 根据图1，2，衍生化处理后的尿素定性离子m/z 231、147、149和173。内标13C-尿素定性离子m/z 232、147、149和174。建立GC–MS/MS–SRM检测方法，选择特征离子对13
231-147及232-147分别用于尿素及内标 C-尿素两种物质的定量。数据分析使用Nist
2011。
231-147及232-147分别用于尿素及内标 C-尿素两种物质的定量。数据分析使用Nist
2011。
[0040] （三）使用GC–MS/MS–SRM方法制作尿素标准曲线对不同白酒中尿素进行准确定量。
[0041] （1）尿素标准曲线制作：将1 mg·L-1尿素标准品储备液梯度稀释成一系列标准使-1 13 13用液，分别加入100 µL 浓度200 µg·L 的内标 C-尿素，以尿素/ C-尿素峰面积比为横
13
坐标，尿素/ C-尿素浓度比为纵坐标绘制尿素标准曲线，尿素标准曲线如图3。
13
坐标，尿素/ C-尿素浓度比为纵坐标绘制尿素标准曲线，尿素标准曲线如图3。
[0042] （2）白酒样品预处理：供试样品的准备：共采集18个酒样，其中宋河白酒6个，习酒6个，汾酒 6个。各白酒的香型类别分别为，浓香型：宋河；酱香型：习酒；清香型：汾酒。
[0043] （3）白酒中尿素的定量分析
[0044] 取100 µL待测的酒样+100 µL内标13C-尿素于2 mL样品瓶、氮吹吹干、加50 µL二氯甲烷再次吹干、加50 µL MTBSTFA衍生剂和50 µL乙腈100℃反应60 min、使用GC–MS/MS–SRM对样品进行检测，通过尿素标准曲线进行定量，检测结果如表2。
[0045] 表2 三种香型白酒中的尿素含量（n=3）
[0046]白酒香型（n=6） 含量范围（µg·L-1） Ave±SD
浓香 93.10~636.21 127.23±153.42
清香 159.31~404.45 169.31±218.39
酱香 483.18~1108.37 562.29±390.16
浓香 93.10~636.21 127.23±153.42
清香 159.31~404.45 169.31±218.39
酱香 483.18~1108.37 562.29±390.16
[0047] （四）定量白酒中尿素方法的评价
[0048] 通过尿素标准曲线的分析图表可知，该方法对于定量尿素有很宽的线性范围，而且在线性范围内线性关系很好（R2>0.99），可见该方法的适用范围比较广。
[0049] 在白酒样品中添加相似浓度的尿素标准品，计算尿素定量方法的回收率；并通过重复性实验的相对标准偏差来考察该定量方法的精确性，见表3。该方法定量尿素的下限低于白酒中尿素的含量，可以采用此方法对白酒中尿素进行定量，且该方法表现出很好的准确性（相对标准偏差在2.46%~4.18%之间）和精确性（回收率在93%~98%之间），完全能够满足对白酒中尿素定量分析的要求。
[0050] 表3 白酒中尿素定量方法的回收率和精确性
[0051]白酒类型 浓香 清香 酱香
RSD（%） 4.18 2.46 3.25
回收率（%） 97 93 98
RSD（%） 4.18 2.46 3.25
回收率（%） 97 93 98