用于递送生物活性材料的支化聚胺

摘要

支化聚胺包含约45至约70个骨架叔胺基团，约90至约140个骨架仲胺基团，大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及大于0的正数q个通式(2)的骨架末端氨基甲酸酯基团：‑CH2‑CH2‑N‑(C＝O)‑O‑L'‑OH(2)，其中(n'+q)为等于约45至约70的数，通式(2)的星号键与支化聚胺的骨架氮连接，L'为包含3至30个碳的二价基团，以及q/(n'+q)×100％等于约9％至约47％。

权利要求

1.支化聚胺，其包含：

45至70个骨架叔胺基团，90至140个骨架仲胺基团，大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及大于0的正数q个通式(4)的骨架末端氨基甲酸酯基团：

其中：

(n'+q)为等于45至70的数，通式(4)的星号键与所述支化聚胺的骨架氮连接，R1为氢、甲基或乙基，

R2为氢或包含1至27个碳的单价基团，以及q/(n'+q)×100％等于9％至47％。

2.如权利要求1所述的支化聚胺，其中所述支化聚胺由n'个伯氮丙啶重复单元、90至

140个仲氮丙啶重复单元、45至70个叔氮丙啶重复单元以及q个通式(4)的氨基甲酸酯基团组成。

3.如权利要求1所述的支化聚胺，其中所述支化聚胺是数均分子量为8500至15000的氨基甲酸酯官能化的支化聚乙烯亚胺。

4.如权利要求1所述的支化聚胺，其中所述支化聚胺在N/P 10至N/P 50下为非细胞毒性的。

5.如权利要求1所述的支化聚胺，其中R2包含糖部分。

6.如权利要求5所述的支化聚胺，其中所述糖部分为甘露糖、半乳糖或葡萄糖部分。

7.如权利要求1所述的支化聚胺，其中q/(n'+q)×100％等于9％至25％。

8.如权利要求1所述的支化聚胺，其中q/(n'+q)×100％等于9％至12％。

9.如权利要求1所述的支化聚胺，其中所述支化聚胺不含季胺基团。

10.如权利要求1所述的支化聚胺，其中所述支化聚胺能够在基因转染过程中充当基因载体。

11.如权利要求1所述的支化聚胺，其中R2为酯*-C(＝O)OR3，其中R3包含1至26个碳。

12.合成通式(4)的支化聚胺的方法，其包括：用环状碳酸酯单体处理包含45至70个伯胺基团、多个仲胺基团和多个叔胺基团的支化第一聚合物而不使所述环状碳酸酯单体聚合，从而形成包含以下的支化聚胺：i)45至70个骨架叔胺基团，ii)90至140个骨架仲胺基团，iii)大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及iv)大于0的正数q个通式(4)的骨架末端氨基甲酸酯基团：

其中：

(n'+q)为等于45至70的数，通式(4)的星号键与所述支化聚胺的骨架氮连接，R1为氢、甲基或乙基，

R2为氢或包含1至27个碳的单价基团，以及q/(n'+q)×100％等于9％至47％。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述环状碳酸酯单体包含一种或多种保护基，并且所述方法进一步包括使所述支化聚胺脱保护。

14.如权利要求12所述的方法，其中所述环状碳酸酯为6元环的环状碳酸酯。

15.如权利要求12所述的方法，其中所述支化第一聚合物为由以下组成的枝化聚乙烯亚胺：

45至70个具有下述结构的伯氮丙啶重复单元

90至140个具有下述结构的仲氮丙啶重复单元以及

45至70个具有下述结构的叔氮丙啶重复单元

其中各星号键表示与所述骨架的另一重复单元的连接点。

16.如权利要求12所述的方法，其中所述环状碳酸酯单体选自：

及其组合。

17.复合物，其包含：

基因；以及

支化聚胺，其包含45至70个骨架叔胺基团，90至140个骨架仲胺基团，大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及大于0的正数q个通式(4)的骨架末端氨基甲酸酯基团：

其中：

(n'+q)为等于45至70的数，通式(4)的星号键与所述支化聚胺的骨架氮连接，R1为氢、甲基或乙基，

R2为氢或包含1至27个碳的单价基团，以及q/(n'+q)×100％等于9％至47％。

18.如权利要求17所述的复合物，其中所述基因为siRNA。

19.权利要求17所述的复合物制造用于处理细胞的药物中的用途。

20.如权利要求19所述的用途，其中所述细胞为人类肿瘤细胞。

21.如权利要求19所述的用途，其中所述细胞为肝癌细胞。

22.如权利要求19所述的用途，其中所述细胞为宫颈癌细胞。

23.如权利要求19所述的用途，其中所述细胞为卵巢癌细胞。

24.如权利要求19所述的用途，其中所述细胞为人类间充质干细胞。

25.合成通式(2)的支化聚胺的方法，其包括：用环状碳酸酯单体处理包含45至70个伯胺基团、多个仲胺基团和多个叔胺基团的支化第一聚合物而不使所述环状碳酸酯单体聚合，从而形成包含以下的支化聚胺：i)45至70个骨架叔胺基团，ii)90至140个骨架仲胺基团，iii)大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及iv)大于0的正数q个通式(2)的骨架末端氨基甲酸酯基团：

其中：

(n'+q)为等于45至70的数，通式(2)的星号键与所述支化聚胺的骨架氮连接，L'为包含3至30个碳的二价基团，以及q/(n'+q)×100％等于9％至47％。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述环状碳酸酯单体包含一种或多种保护基，并且所述方法进一步包括使所述支化聚胺脱保护。

27.如权利要求25所述的方法，其中所述环状碳酸酯为6元环的环状碳酸酯。

28.如权利要求25所述的方法，其中所述支化第一聚合物为由以下组成的枝化聚乙烯亚胺：

45至70个具有下述结构的伯氮丙啶重复单元

90至140个具有下述结构的仲氮丙啶重复单元以及

45至70个具有下述结构的叔氮丙啶重复单元

其中各星号键表示与所述骨架的另一重复单元的连接点。

29.如权利要求25所述的方法，其中所述环状碳酸酯单体选自：

及其组合。

30.复合物，其包含：

基因；以及

支化聚胺，其包含45至70个骨架叔胺基团，90至140个骨架仲胺基团，大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及大于0的正数q个通式(2)的骨架末端氨基甲酸酯基团：

其中：

(n'+q)为等于45至70的数，通式(2)的星号键与所述支化聚胺的骨架氮连接，L'为包含3至30个碳的二价连接基团，以及q/(n'+q)×100％等于9％至47％。

31.如权利要求30所述的复合物，其中所述基因为siRNA。

32.权利要求30所述的复合物制造用于处理细胞的药物中的用途。

33.如权利要求32所述的用途，其中所述细胞为人类肿瘤细胞。

34.如权利要求32所述的用途，其中所述细胞为肝癌细胞。

35.如权利要求32所述的用途，其中所述细胞为宫颈癌细胞。

36.如权利要求32所述的用途，其中所述细胞为卵巢癌细胞。

37.如权利要求32所述的用途，其中所述细胞为人类间充质干细胞。

38.支化聚胺，其具有通式(5)的结构：

其中j、k、m、n'和q表示大于0的摩尔数，j具有185至280的值，k具有45至70的值，m具有

90至140的值，(n'+q)具有45至70的值，以及q/(n'+q)×100％具有9％至47％的值，并且各个Z'为选自以下的独立部分及其组合。

说明书

用于递送生物活性材料的支化聚胺

[0001] 联合研发协议的各方

[0002] 本发明是在International Business Machines Corporation和the Agency For Science，Technology and Research的联合研发协议下做出的。

[0003] 背景

[0004] 本发明涉及用于递送生物活性材料的支化聚胺，更具体地，涉及氨基甲酸酯官能化的支化聚乙烯亚胺，其包含用于基因递送的疏水氨基甲酸酯端基。

[0005] 基于核酸的疗法在治疗人类疾病上大有前景。理论上，不仅错误和缺陷基因可以被功能基因修正和替换，而且多余的基因表达也可以通过使用RNA干预而被抑制到正常水平。通常，有两个主要类型的基因递送载体，即病毒载体和非病毒载体。尽管病毒载体具有优越的转导能力，但是病毒载体的致免疫和致癌的可能性限制了其临床应用。为了避免这个问题，已经报道了一些非病毒基因递送系统，其包括(1)核酸与包括脂类、聚合物和肽在内的多种阳离子分子的络合以及(2)核酸与诸如胆固醇和细胞穿透肽的天然配体的结合。非病毒基因递送载体正在受到更多的关注，这是由于其生物安全性、低生产成本、运输和储存方便、再生产性，以及用于靶向特定细胞类型的可调的官能性。

[0006] 在各种类型的非病毒载体中，支化聚乙烯亚胺(bPEI)，其含有伯、仲和叔胺基，提供了高的体外基因转染效率。具体地，具有25kDa的重均分子量(Mw)和约10kDa的数均分子量(Mn)的在本文中称为bPEI-25的bPEI被视为工业标准。bPEI-25在生理pH下具有高阳离子电荷密度，其中bPEI-25的约20％的胺基团(即伯胺)被质子化。这使得bPEI-25能够与带负电的核酸在宽泛的pH范围内静电相互作用并且使它们能够复合成纳米粒子。一旦bPEI-25/核酸纳米复合物被细胞吸收同化，那么仲胺和叔胺促进核酸从核内体通过“质子海绵效应”释放。对于脱氧核糖核酸(DNA)，所释放的核酸被摄入细胞核给予了高的基因转移效率。

[0007] 尽管有着高的基因转染效率，bPEI-25的净正电荷具有涉及以下的主要缺点，即，涉及毒性、聚集以及bPEI-25/核酸复合物与细胞组分和非细胞组分(尤其在体内)不期望的非特异性相互作用。副反应包括肝坏死、聚集的血小板的粘连以及更高剂量的全身注射之后的休克。

[0008] 考虑到bPEI-25所面临的细胞毒性问题，低分子量支化聚乙烯亚胺(Mw为约2.0kDa，Mn为约1.8kDa，在本文中称为bPEI-2)也已获得关注，这是由于其有利的细胞毒性谱。当用于体内治疗目的时，低分子量使得bPEI-2可以从肾脏排泄。然而，bPEI-2的主要缺点是其低效的转染能力，使其不足以用作基因转染载体。

[0009] 因此，对于开发更有效且细胞毒性更低的用于递送生物活性材料的聚乙烯亚胺衍生物，存在着持续的需求。

[0010] 概述

[0011] 因此，公开了支化聚胺，其包含：

[0012] 约45至约70个骨架叔胺基团，约90至约140个骨架仲胺基团，大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及大于0的正数q个通式(2)的骨架末端氨基甲酸酯基团：

[0013]

[0014] 其中：

[0015] (n'+q)为等于约45至约70的数，

[0016] 通式(2)的星号键与支化聚胺的骨架氮连接，

[0017] L'为包含3至30个碳的二价基团，以及

[0018] q/(n'+q)×100％等于约9％至约47％。

[0019] 还公开了支化聚胺，其包含：

[0020] 约45至约70个骨架叔胺基团，约90至约140个骨架仲胺基团，大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及大于0的正数q个通式(4)的骨架末端氨基甲酸酯基团：

[0021]

[0022] 其中

[0023] 通式(4)的星号键与支化聚胺的骨架氮连接，

[0024] R1为氢、甲基或乙基，

[0025] R2为氢或包含1至27个碳的单价基团，

[0026] (n'+q)为等于约45至约70的数，以及

[0027] q/(n'+q)×100％等于约9％至约47％。

[0028] 进一步公开了方法，其包括：

[0029] 用环状碳酸酯单体处理包含约45至约70个伯胺基团、多个仲胺基团和多个叔胺基团的支化第一聚合物而不使所述环状碳酸酯单体聚合，从而形成包含以下的支化聚胺：i)约45至约70个骨架叔胺基团，ii)约90至约140个骨架仲胺基团，iii)大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及iv)大于0的正数q个通式(2)的骨架末端氨基甲酸酯基团：

[0030]

[0031] 其中：

[0032] (n'+q)为等于约45至约70的数，

[0033] 通式(2)的星号键与支化聚胺的骨架氮连接，

[0034] L'为包含3至30个碳的二价基团，以及

[0035] q/(n'+q)×100％等于约9％至约47％。

[0036] 还公开了复合物，其包含：

[0037] 基因；以及

[0038] 支化聚胺，其包含约45至约70个骨架叔胺基团，约90至约140个骨架仲胺基团，大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及大于0的正数q个通式(2)的骨架末端氨基甲酸酯基团：

[0039]

[0040] 其中：

[0041] (n'+q)为等于约45至约70的数，

[0042] 通式(2)的星号键与支化聚胺的骨架氮连接，

[0043] L'为包含3至30个碳的二价连接基团，以及

[0044] q/(n'+q)×100％等于约9％至约47％。

[0045] 还公开了处理细胞的方法，其包括使细胞与上述复合物接触。

[0046] 进一步公开了具有通式(5)的结构的支化聚胺：

[0047]

[0048] 其中j、k、m、n'和q表示大于0的摩尔数，j具有约185至约280的值，k具有约45至约70的值，m具有约90至约140的值，(n'+q)具有约45至约70的值，以及q/(n'+q)×100％具有约9％至约47％的值，并且各个Z'为选自以下的独立的部分

[0049]

[0050]

[0051] 及其组合。

[0052] 从以下详述、附图以及所附的权利要求书，本领域技术人员会了解和理解本发明的上述及其它特征和优点。

[0053] 附图简述

[0054] 图1为示出用氨基甲酸酯官能化的支化聚乙烯亚胺聚合物A、B和C制备的绿色荧光蛋白(GFP)报告基因复合物的粒径的柱状图。A、B和C是由可商购的bPEI-25制备的。以5至30的N/P比制备基因复合物。“N/P”是指氨基甲酸酯官能化的bPEI-25聚合物的氮与基因的磷的摩尔比，并且指示氨基甲酸酯官能化的bPEI-25/基因复合物的净电荷。以10的N/P比制备bPEI-25的对照基因复合物(未示出)，其具有约84nm的平均粒径以及约22mV的ζ电势。

[0055] 图2为示出以N/P 10至50制备的氨基甲酸酯官能化的bPEI-25聚合物S、T、F、G、L、M和N的荧光素酶报告基因复合物的粒径的柱状图。

[0056] 图3为示出以N/P 10至50制备的氨基甲酸酯官能化的bPEI-25聚合物U、R、I和H的荧光素酶报告基因复合物的粒径的柱状图。

[0057] 图4为示出以N/P 10至50制备的氨基甲酸酯官能化的bPEI-25聚合物V、P、K、J和O的荧光素酶报告基因复合物的粒径的柱状图。

[0058] 图5为示出图1的N/P 10至30的GFP报告基因复合物的相应的ζ电势的柱状图。以N/P 10制备对照bPEI-25/基因复合物(未示出)具有约84nm的粒径以及约22mV的ζ电势。

[0059] 图6-8分别为示出图2-4的N/P 10至50的氨基甲酸酯官能化的bPEI-25/基因复合物的相应ζ电势的柱状图。

[0060] 图9-27分别为从氨基甲酸酯官能化的bPEI-25聚合物A、B、C、F、G、S、T、L、M、N、U、R、I、H、V、P、K、J的O的荧光素酶报告基因复合物获得的DNA梯状电泳(DNA ladder)的照片。

[0061] 图28为从bPEI-25的荧光素酶报告基因复合物获得的DNA梯状电泳的照片。

[0062] 图29为从bPEI-2(Mw 2000，Mn 1800)的荧光素酶报告基因复合物获得的DNA梯状电泳的照片。

[0063] 图30-32为示出在HepG2细胞中GFP转染效率作为用GFP报告基因制备的多种氨基甲酸酯官能化的bPEI-25聚合物复合物的N/P比的函数的柱状图。还示出单独的基因(标记为单独的DNA)和用bPEI-25制备的对照复合物的转染效率。

[0064] 图33为示出在HepG2细胞中GFP转染效率作为用氨基甲酸酯官能化的bPEI-25聚合物O、K、P43和P44制备的GFP报告基因复合物的N/P的函数的柱状图。P43具有苄酯并且P44具有2-苯基脲乙酯基团。

[0065] 图34为示出在HeLa细胞中GFP转染效率作为用氨基甲酸酯官能化的bPEI-25聚合物A、B、C、F和G制备的GFP报告基因复合物的N/P的函数的柱状图。还示出单独的基因(标记为单独的DNA)和用bPEI-25制备的对照复合物的转染效率。

[0066] 图35为示出在SK-OV-3细胞中GFP转染效率作为氨基甲酸酯官能化的bPEI-25聚合物O、K、P44、P46、P48至P49的GFP报告基因复合物的N/P比的函数的柱状图。P44具有芳香脲基团。P46具有胆甾醇基。

[0067] 图36为示出在HepG2细胞中以不同N/P比由用氨基甲酸酯官能化的bPEI-25聚合物A、B和C制备的荧光素酶报告基因复合物所介导的体外荧光素酶表达水平。对照包括bPEI-25的荧光素酶基因复合物、单独的荧光素酶基因(标记为单独的DNA)以及单独的聚合物(标记为“0”)。结果表示为三次重复实验的平均值±标准偏差。

[0068] 图37-39为示出在与N/P比2至50的各种氨基甲酸酯功能化的bPEI-25聚合物的GFP报告基因复合物一起孵育之后HepG2细胞的细胞活力的柱状图。还示出bPEI-25的对照基因复合物。

[0069] 图40为示出在与N/P比2至50的各种氨基甲酸酯功能化的bPEI-25聚合物的GFP报告基因复合物一起孵育之后HeLa细胞的活力的柱状图。还示出由bPEI-25形成的对照基因复合物。

[0070] 图41为示出N/P比50的氨基甲酸酯官能化的bPEI-25聚合物A、B和C的siRNA复合物对HeLa细胞中Bcl-2mRNA的下调的柱状图。siRNA浓度为100nM。

[0071] 图42为示出在用多种N/P比的氨基甲酸酯官能化的bPEI-25聚合物/siRNA复合物处理之后HeLa细胞的活力的柱状图。

[0072] 图43为在人间充质干细胞中荧光素酶表达水平作为氨基甲酸酯官能化的bPEI-25聚合物T、S、G、M、K和O的荧光素酶报告基因复合物的N/P比的函数的图。

[0073] 图44为示出T、S、G、M、K和O的荧光素酶复合物对人类间充质干细胞(hMSC)的细胞毒性的图。

[0074] 图45为比较不同N/P比的氨基甲酸酯官能化的bPEI-25聚合物P45、P46(比较)和P47(比较)的GFP报告基因复合物在HepG2细胞中转染效率的柱状图。P45是由胆甾醇基取代的环状碳酸酯(Chol-MTC)制备的，P46是由胆甾醇氯甲酸酯制备的，并且P47是由氯甲酸丁酯制备的。

[0075] 图46为比较在不同N/P比的P45至P47的GFP报告基因复合物存在下HepG2细胞活力的柱状图。

[0076] 图47为比较在不同N/P比的氨基甲酸酯官能化的bPEI-25聚合物O、K、P44、P46、P48至P49的GFP报告基因复合物存在下SK-OV-3细胞活力的柱状图。

[0077] 详述

[0078] 所公开的是用于递送包括基因、蛋白质和/或药物在内的生物活性材料的支化聚胺。支化聚胺优选通过使一种或多种疏水环状碳酸酯化合物与包含约45至约70个伯胺基团、多个仲胺基团和多个叔胺基团的支化聚乙烯亚胺(bPEI)反应而制备。为了清楚起见，用于与环状碳酸酯单体进行氨基甲酸酯形成反应的支化聚乙烯亚胺起始材料在以下描述中被称为未修饰的支化聚乙烯亚胺(“未修饰的bPEI”)。反应产物是被称作修饰的支化聚乙烯亚胺(“修饰的bPEI”)的氨基甲酸酯官能化的bPEI聚合物。未修饰的bPEI可以具有约8000至约12000的数均分子量(Mn)和约8000至约30000的重均分子量(Mw)。更具体的支化聚胺是通过用环状碳酸酯化合物处理bPEI-25(称为“未修饰的bPEI-25”)形成的。所得的支化聚胺，其为氨基甲酸酯官能化的bPEI-25聚合物，被称作“修饰的bPEI-25”聚合物。应当理解除了支化聚乙烯亚胺之外的支化含胺聚合物可以潜在地用于氨基甲酸酯形成反应(例如，包含约45至约70个伯胺基团、多个仲胺基团和多个叔胺基团的树枝状胺聚合物)。

[0079] 在基因转染过程中，支化聚胺能够用作基因的载体。例如，在HepG2细胞(人类肝癌细胞系)、SK-OV-3细胞(人类卵巢癌细胞)和/或mHSC(人类间充质干细胞)中，与相应的未修饰的bPEI的基因复合物相比，修饰的bPEI聚合物可以是更有效的基因转染试剂。与在N/P20以上可以为高细胞毒性的相应的未修饰的bPEI的基因复合物相比，修饰的bPEI/基因复合物在N/P比20至50下也可以是更低细胞毒性的。另外，由用修饰的bPEI和荧光素酶报告基因制备的复合物转染的细胞可以以与相应的未修饰的bPEI的荧光素酶复合物可比或更高的水平表达荧光素酶基因。

[0080] 未修饰的bPEI包含多个二价亚乙基(*-CH2CH2-*)、多个骨架叔胺、多个骨架仲胺和多个骨架末端伯胺基团。更具体地，基于Mn的范围和分子量为43的平均氮丙啶重复单元，未修饰的bPEI具有约185至约280个亚乙基、约45至约70个骨架叔胺基团、约90至约140个骨架仲胺基团、约45至约70个骨架末端伯胺基团。未修饰的bPEI的骨架末端单元含有伯胺基团。

[0081] 因此，未修饰的bPEI具有基本由以下组成的结构：约45至约70个下述结构的伯氮丙啶重复单元

[0082]

[0083] 约90至约140个下述结构的仲氮丙啶重复单元：

[0084] 以及

[0085] 约45至约70个下述结构的叔氮丙啶重复单元：

[0086]

[0087] 不包括可能存在的上述重复单元的水合盐(hydrosalt)。在以上重复单元中各个星号键表示与未修饰的bPEI的另一重复单元的连接点。

[0088] 未修饰的bPEI在本文还表示为通式(1)：

[0089]

[0090] 其中j、k、m和n表示未修饰的bPEI结构的各独立官能团的摩尔数，j具有约185至约280的值，k具有约45至约70的值，m具有约90至约140的值，n具有约45至约70的值。基于通式(1)的标记应当理解，在方括号[]内开始并且在方括号外结束的每组圆括号，包括了未修饰的bPEI的独立官能团，而不是聚合物链。星号键表示与在括号相对侧的星号键的连接点。
因此在方括号右侧的每一个氮都与在方括号左侧的亚乙基的碳结合。

[0091] 作为一个实例，上述可商购的支化聚乙烯亚胺bPEI-25具有25000的重均分子量(Mw)、约10000的数均分子量(Mn)，并且平均包含58个骨架叔胺基团、116个骨架仲胺基团、58个骨架末端伯胺基团，以及233个亚乙基(基于Mn以及等于43的平均氮丙啶重复单元分子量)。在该实例中，j＝233，k＝58，m＝116以及n＝58。该材料在本文中还被称作“未修饰的bPEI-25”。

[0092] 作为另一个实例，上述可购得的支化聚乙烯亚胺bPEI-2具有2000的重均分子量(Mw)、约1800的数均分子量(Mn)，并且平均包含10个骨架叔胺基团、20个骨架仲胺基团、10个骨架末端伯胺基团，以及35个亚乙基(基于Mn以及等于43的平均氮丙啶重复单元分子量)。在该实例中，j＝35，k＝10，m＝20以及n＝10。该材料在本文中被称为bPEI-2或“未修饰的bPEI-2”。

[0093] 未修饰的bPEI的骨架末端伯胺基团经历与环状碳酸酯化合物的氨基甲酸酯形成开环反应，从而形成支化聚胺。开环反应的发生优选伴随着环状碳酸酯化合物的最小聚合或无聚合。

[0094] 支化聚胺包含约45至约70个骨架叔胺基团，约90至约140个骨架仲胺基团，大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及大于0的正数q个通式(2)的骨架末端氨基甲酸酯基团：

[0095]

[0096] 其中通式(2)的星号键与支化聚胺的骨架氮连接，q/(n'+q)×100％等于约9％至约47％，(n'+q)为等于约45至约70的数，以及L'为包含3至30个碳的二价连接基团。

[0097] 更具体的支化聚胺具有包括以下的结构：

[0098] i)大于0的正数n'个以下结构的骨架末端伯氮丙啶重复单元：

[0099]

[0100] ii)约90至约140个以下结构的骨架仲氮丙啶重复单元：

[0101]

[0102] iii)约45至约70个以下结构的骨架叔氮丙啶重复单元：

[0103] 以及

[0104] iv)大于0的正数q个通式(2)的骨架末端氨基甲酸酯端基：

[0105]

[0106] 其中在以上结构中的各个星号键表示与支化聚胺的另一重复单元的连接点，q/(n'+q)×100％等于约9％至约47％，(n'+q)为等于约45至约70的数，以及L'为包含3至30个碳的二价连接基团。通式(2)的星号键与支化聚胺的骨架氮连接。在实施方案中，支化聚胺基本由上述伯氮丙啶重复单元、仲氮丙啶重复单元、叔氮丙啶重复单元以及氨基甲酸酯端基组成。在另一个实施方案中，支化聚胺为氨基甲酸酯官能化的bPEI-25(即，修饰的bPEI-25聚合物)。在另一个实施方案中，L'为不带电的基团。在另一个实施方案中，支化聚胺不包含季胺基团。

[0107] 支化聚胺还可以表示为通式(3)：

[0108]

[0109] 其中j、k、m、n'和q表示在通式(3)的圆括号中包括的独立官能团的每一种的大于0的摩尔数，j具有约185至约280的值，k具有约45至约70的值，m具有约90至约140的值，(n'+q)具有约45至约70的值，以及q/(n'+q)×100％具有约9％至约47％的值。使用括号和圆括号的标记具有与上文对通式(1)所述的相同的意义。L'为包含3至30个碳的二价连接基团。

[0110] 在制备支化聚胺的方法，反应混合物包含环状碳酸酯化合物和未修饰的bPEI，并且基于未修饰的bPEI的伯胺基团的总摩尔数，环状碳酸酯化合物的存在量为50mol％以下。因此，未修饰的bPEI的至少50％的伯胺基团保留在支化聚胺中。在实施方案中，通式(3)的q/(n'+q)×100％等于约9％至约25％。在甚至更具体的实施方案中，通式(3)的q/(n'+q)×
100％等于约9％至约12％。

[0111] 支化聚胺的各个骨架叔胺基团、骨架仲胺基团和/或骨架末端伯胺基团可以以游离碱或水合盐形式存在(例如与诸如氢氧根离子、氯离子、乙酸根离子和/或硫酸根离子的带负电的抗衡离子缔合的带正电的质子化胺)。

[0112] 另一个更具体的支化聚胺包含约45至约70个骨架叔胺基团，约90至约140个骨架仲胺基团，大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及大于0的正数q个通式(4)的骨架末端氨基甲酸酯基团：

[0113]

[0114] 通式(4)的星号键与支化聚胺的骨架氮连接。R1为氢、甲基或乙基。R2为氢或包含1至27个碳的单价基团。(n'+q)的值为等于约45至约70的数，并且q/(n'+q)×100％等于约9％至约47％。

[0115] 另一个更具体的支化聚胺包含：

[0116] i)大于0的正数n'个以下结构的骨架末端伯氮丙啶重复单元：

[0117]

[0118] ii)约90至约140个以下结构的骨架仲氮丙啶重复单元：

[0119]

[0120] iii)约45至约70个以下结构的骨架叔氮丙啶重复单元：

[0121] 以及

[0122] iv)大于0的正数q个通式(4)的骨架末端氨基甲酸酯端基：

[0123]

[0124] 其中，各星号键与另一个支化聚胺重复单元连接，R1为氢、甲基或乙基，以及R2为氢或包含1至27个碳的基团，(n'+q)具有约45至约70的值，并且q/(n'+q)×100％具有约9％至约47％的值。在实施方案中，支化聚胺基本由伯氮丙啶重复单元、仲氮丙啶重复单元、叔氮丙啶重复单元以及氨基甲酸酯端基组成。在另一个实施方案中，支化聚胺为氨基甲酸酯官能化的bPEI-25。

[0125] 在实施方案中，通式4的R2为酯*-C(＝O)OR3，其中R3包含1至26个碳。

[0126] R3可以包含糖部分。包含糖部分的示例性的R3基团包括甘露糖、半乳糖和/或葡萄糖的酯。

[0127] R3可以包括含有1至26个碳的单价烃基。示例性单价烃基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基。单价烃基可以为支链或直链。

[0128] 其他R3基团包括苄酯和带有脲基的酯。

[0129] 支化聚胺可以具有约8500至约15000的数均分子量(Mn)。支化聚胺可以具有约8500至约35000的重均分子量(Mw)。

[0130] 氨基甲酸酯基团可以任选地包含一种或多种保护基。在这些实例中，形成支化聚胺的方法可以还包括选择性地去除一种或多种保护基。

[0131] 示例性环状碳酸酯单体包括表1的化合物：

[0132] 表1

[0133]

[0134]

[0135] 环状碳酸酯单体的额外的实例包括表2的化合物。

[0136] 表2

[0137]

[0138]

[0139] 环状碳酸酯单体可以单独使用或组合使用。

[0140] 仍更具体的支化聚胺具有通式(5)的结构：

[0141]

[0142] 其中j、k、m、n'和q表示大于0的摩尔数，j具有约35至约60的值，k具有约8至约20的值，m具有约15至约40的值，(n'+q)具有约45至约70的值，以及(n'+q)/q×100％具有约9％至约47％的值，并且各个Z'为独立地选自以下的部分

[0143]

[0144] 及其组合。

[0145] 还公开了包括基因和上述支化聚胺的复合物。进一步公开了处理细胞的方法，其包括使细胞与所述复合物接触。

[0146] 以下实施例说明了向未修饰的bPEI-25(Mw 25kDa、Mn 10kDa)中引入多个甘露糖、半乳糖和/或葡萄糖分子以及诸如三亚甲基碳酸酯的疏水基团和带有脂肪族烃基、苄基、芳香脲基的酯以形成支化聚胺(修饰的bPEI-25聚合物)的简易方法。环状碳酸酯可以用或不用有机催化剂(1,8-二氮杂双环十一碳-7-烯，DBU)开环。不用DBU，可以形成具有伯醇的氨基甲酸酯。用DBU，当伯胺基团以高于环状碳酸酯的量存在时(例如，分别以25:1和8:1的摩尔比使用环状碳酸酯和未修饰的bPEI-25，因为在各个未修饰的bPEI-25分子中有约58个伯胺基团)，也可以形成具有伯醇的氨基甲酸酯。然而，在环状碳酸酯与未修饰的bPEI-25摩尔比75:1时，修饰的bPEI-25有可能包含与未修饰的bPEI-25的伯胺位点连接的聚碳酸酯链。

[0147] 描述了多种修饰的bPEI-25/基因复合物的DNA结合、粒径、ζ电势和基因表达性质。通过使用荧光素酶报告基因和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因，研究了在HepG2(人类肝癌细胞系)和SK-OV-3(人类卵巢癌细胞系)以及人类间充质干细胞中复合物的基因转染效率和细胞毒性，并且与未修饰的bPEI-25进行相比。为了进一步说明甘露糖修饰的bPEI-25聚合物递送siRNA的能力，使用靶向Bcl-2(假定在细胞凋亡发生之后阻碍细胞色素C释放且经常在癌细胞中过表达的蛋白)的siRNA，并递送到人类上皮癌HeLa细胞系中。在用甘露糖修饰的bPEI-25/Bcl-2siRNA处理后，使用实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)来测量在细胞中Bcl-2mRNA表达水平。在与siRNA复合物孵育之后，通过MTT试验分析了HeLa细胞的活力。
实施例

[0148] 在下面实施例中使用的材料在表3中列出。

[0149] 表3

[0150]

[0151] 在本文中，Mn为数均分子量，Mw为重均分子量，并且MW为一个分子的分子量。

[0152] 将1,8-二氮杂双环[5,4,0]十一碳-7-烯(DBU)在CaH2中搅拌并且真空蒸馏，随后转移至手套箱中。具有25kDa(bPEI-25)和1.8kDa(bPEI-2)的重均分子量的支化聚乙烯亚胺、用于细胞毒性试验的1-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-3,5-二苯基甲 (MTT)以及用于聚合物合成的其它试剂可从Aldrich购得，并且除非另有说明，不经过任何纯化而使用。靶向Bcl-2的siRNA双链(序列：有义：5'-GUA CAU CCA UUA UAA GCU G；反义：5'-CAG CUU AUA AUG GAU GUA C)、靶向β肌动蛋白的siRNA双链，以及杂乱siRNA(负对照)从Dharmacon(U.S.A)购得。荧光素酶底物和5×溶解缓冲液从Promega(Singapore)购得。GFP报告基因(编码由巨细胞病毒启动子驱动的野生型GFP的红移变体)和荧光素酶报告基因(编码由巨细胞病毒启动子驱动的6.4kb萤火虫荧光素酶基因)分别是从Clontech(U.S.A.)和Carl Wheeler，Vical(U.S.A.)获得的。BCA蛋白测定试剂盒来自Pierce。HepG2(肝脏)、SK-OV-3(卵巢)和HeLa(宫颈)人类癌细胞系是购自ATCC(U.S.A.)。

[0153] MTC-OH可以通过R.C.Pratt等人，Chemical Communications，2008，114-116中的方法制备。

[0154] MTC-C6H5(MW 326.2)的制备

[0155]

[0156] 向100mL圆底烧瓶填装随70mL四氢呋喃(THF)一起冲入的bis-MPA(7)(5.00g，37mmol，MW 134.1)、双-(五氟苯基)碳酸酯(PFC，31.00g，78mmol，MW 394.1)和CsF(2.5g，
16.4mmol)。反应最初为异相的，但是在一个小时之后形成澄清的均相溶液，使其搅拌20小时。在真空中去除溶剂并且将残留物再溶解在二氯甲烷中。使溶液静置约10分钟，在这段时间内五氟苯酚副产物沉淀并且可以定量回收。该五氟苯酚副产物在五氟苯酚19F NMR中显示出三个特征峰，并且在GCMS中显示出质量为184的单峰。将滤液用碳酸氢钠、水萃取并且用MgSO4干燥。将溶剂在真空中蒸发并且将产物重结晶(乙酸乙酯/己烷混合物)以得到白色晶状粉末形式的MTC-C6F5。GCMS具有在质量326g/mol的单峰。对C12H7F5O5计算得到的分子量与所指定的结构一致。1H-NMR(400MHz，在CDCl3中)：δ4.85(d，J＝10.8Hz，2H，CHaHb)，4.85(d，J＝10.8Hz，2H，CHaHb)，1.55(s，3H，CCH3)。

[0157] I.单体的合成

[0158] 实施例1. MTC-Cl(MW 178.6)的制备

[0159]

[0160] 将乙二酰氯(2.48mL，19.0mmol)在50mL干燥四氢呋喃(THF)中的溶液逐滴加入5-甲基-5-羧基-1,3-二氧基环己-2-酮(MTC-OH)(2.75g，17.2mmol，MW 160.1)在50mL干燥THF中的溶液中，随后在氮气氛下，历时30分钟加入催化量(3滴)的无水二甲基甲酰胺(DMF)。伴随着N2全程鼓泡将反应溶液搅拌1小时，从而去除挥发性物质。在反应之后，将溶剂在真空下蒸发，获得MTC-Cl，其未被进一步纯化。

[0161] 实施例2. MTC-C2(MW 188.2)的制备

[0162]

[0163] I)将bis-MPA(22.1g，0.165mol，MW 134.1)加入到具有Amberlyst-15(6.8g)的乙醇(150mL)中，并且回流过夜。随后将树脂过滤掉并且将滤液蒸发。将二氯甲烷(200mL)加入所得的粘稠液体中以过滤未反应的溶剂和副产物。在将溶液用MgSO4干燥并蒸馏之后，获得澄清且无色的液体形式的2,2-双(羟甲基)丙酸乙酯(MW 162.2)(24.3g，91％)。1H NMR(400MHz，CDCl3，22℃)：δ4.09(q，2H，-OCH2CH3)，3.74(d，2H，-CH2OH)，3.57(d，2H，-CH2OH)，1.18(t，3H，-OCH2CH3)，0.98(s，3H，-CH3)。

[0164] II)历时30分钟、在氮气氛下、使用干冰/丙酮于-75℃下，将三光气(11.7g，0.039mol)在二氯甲烷(150mL)中的溶液逐滴加入2,2-双(羟甲基)丙酸乙酯(12.6g，
0.078mol，MW 162.2)的二氯甲烷溶液(150mL)中。将反应混合物在冷却的条件下持续再搅拌2小时并且随后升温至环境温度。通过加入饱和NH4Cl(75mL)水溶液来淬灭反应，随后将有机层用1M的HCl水溶液(3×100mL)、饱和NaHCO3水溶液(1×100mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤和蒸发。将残留物用乙酸乙酯重结晶以得到白色晶体形式的MTC-C2(MW 188)(8.0g，
55％)。1H NMR(400MHz，CDCl3，22℃):δ4.67(d，2H，-CH2OCOO)，4.25(q，2H，-OCH2CH3)，4.19(d，2H，-CH2OCOO)，1.30(s，3H，-CH3)，1.27(t，3H，-OCH2CH3)。

[0165] 实施例3. MTC-C8(MW 272.3)的制备

[0166]

[0167] 向烧瓶填装MTC-C6F5(5.5g，16.9mmol，MW 326.2)、辛醇(2.0g，15.4mmol)、PROTON SPONGE(3.29g，15.4mmol)以及THF(8mL)。将反应混合物搅拌12小时，并加入过量乙酸铵。将反应混合物再搅拌3小时，随后直接加到硅胶柱上。用使用己烷/乙酸乙酯作为洗脱剂的柱层析法来分离产物以得到油。MTC-C8。1H NMR(400MHz，CDCl3，22℃):δ4.71(d，2H，-CH2OCOO)，4.23(d，2H，-CH2OCOO)，4.22(t，2H，-OCH2CH2)，1.68(t，2H，-OCH2CH2(CH2)5)，1.36(s，3H，-CH3)，1.31(t，10H，-CH2(CH2)5CH3)，0.90(t，3H，-(CH2)5CH3)。

[0168] 实施例4. 使用实施例3的一般程序，用十二醇来代替乙醇，从而合成MTC-C12(MW 328.4)。

[0169]

[0170] MTC-C12。1H NMR(400MHz，CDCl3，22℃):δ4.69(d，2H，-CH2OCOO)，4.23(d，2H，-CH2OCOO)，4.21(t，2H，-OCH2CH2)，1.68(t，2H，-OCH2CH2(CH2)5)，1.35(s，3H，-CH3)，1.28(t，10H，-CH2(CH2)5CH3)，0.90(t，3H，-(CH2)5CH3)。

[0171] 实施例5.MTC-Bn(MW 250.3)的合成

[0172]

[0173] 将2,2-双(羟甲基)丙酸(bis-MPA)(20g，149.1mmol，MW 134.1)和氢氧化钠(5.96g，149.1mmol)在100mL DMSO中合并，并且在80℃下搅拌过夜。逐滴加入苄基溴
(30.6g，178.9mmol)。使溶液变清澈并且用NMR监测反应。一旦反应完成，将溶液冷却至室温并且加入水(500mL)。用乙醚萃取溶液几次并且将乙醚溶液浓缩至250mL。用水、碳酸氢钠和盐水溶液洗涤，干燥，并且浓缩成固体。将固体用THF/己烷重结晶以获得MPA-Bn(10.0g，
30％)的白色晶体。随后将MPA-Bn(4.76g，21.2mmol，MW 224.3)和三乙胺(5.4g，53.1)溶解在干燥THF(210mL)中并且冷却至0℃。在氮气下，将氯甲酸乙酯(5.1g，46.7mmol)逐滴加入搅拌的溶液中。将溶液升温至室温并且反应18小时。随后将反应溶液浓缩成固体，并且将固体用乙醚重结晶两次以获得白色晶体形式的MTC-Bn(3.86g，72.6％)。1H NMR(400MHz，CDCl3，22℃):δ7.38(m，2H，C5H6)，5.24(s，2H，-OCH2C5H6)4.72(d，2H，-CH2OCOO)，4.21(d，
2H，-CH2OCOO)，4.21(t，2H，-OCH2C5H6)，1.36(s，3H，-CH3)。

[0174] 具有受保护的糖侧基的环状碳酸酯单体包括MTC-IPMAN、MTC-IPGAL和MTC-IPGLU。

[0175] 实施例6.MTC-IPMAN(MW 402.2)的制备

[0176]

[0177] MTC-IPMAN的制备具有代表性。MTC-Cl是如上那样形成的，并且将其溶解在50mL干燥二氯甲烷(DCM)中。历时30分钟，在室温下将2,3:5,6-二-O-亚异丙基-D-呋喃甘露糖(IPMAN)(4.13g，15.8mmol，MW 260.3)和三乙胺(2.8mL，20.6mmol)在50mL干燥二氯甲烷中的混合物逐滴加入溶液中。随后，将反应混合物加热至40℃，持续48小时。在将混合物冷却至室温后，将溶液浓缩，并将100mLTHF加入以沉淀三乙胺盐。在过滤该盐并去除溶剂之后，通过使用乙酸乙酯和己烷(20/80至50/50)进行梯度洗脱使所得的粗产物经过硅胶柱以提供粘稠无色油形式的产物，其缓慢固化为白色固体(5.85g，85％)。1H-NMR(400MHz，CDCl3，22℃):δ6.17(s，1H，H-a)，5.79(dd，1H，H-b)，4.83(m，1H，H-d)，4.66(d，2H，H-c)，4.41(m，1H，H-g)，4.22(m，2H，H-c)，4.03(m，2H，H-e+H-f)，3.73(m，1H，H-e)，1.33-1.50(m，15H，H-h+H-i)。

[0178] 实施例7. MTC-IPGAL(MW 402.2)的制备

[0179]

[0180] MTC-IPGAL是使用实施例6的程序和1,2:3,4-二-O-异亚丙基-D-吡喃半乳糖(IPGAL，MW 260.3)制备的。产率81％。1H-NMR(400MHz，CDCl3，22℃):δ5.54(d，1H，H-a)，4.70(m，2H，H-c)，4.62(m，1H，H-b)，4.41(m，1H，H-f)，4.33(m，2H，H-d和H-e)，4.26(m，3H，H-c和H-g)，4.03(m，1H，H-g)，1.32-1.49(5s，15H，H-h+H-i)。

[0181] 实施例8. MTC-IPGLU(MW 402.2)的制备

[0182]

[0183] MTC-IPGLU是使用实施例6的程序和1,2:5,6-二-O-异亚丙基-D-呋喃葡萄糖(IPGLU，MW 260.3)制备的。产率75％。1H-NMR(400MHz，CDCl3，22℃):δ5.90(d，1H，H-a)，5.39(d，1H，H-b)，4.69(d，2H，H-c)，4.46(d，1H，H-g)，4.18(m，2H，H-c)，4.06(m，2H，H-e和H-f)，
4.00(m，1H，H-e)，1.30-1.52(5s，15H，H-h+H-i)。

[0184] 具有苯基脲侧基的环状碳酸酯是根据方案1制备的。

[0185] 方案1

[0186]

[0187] 实施例9. MTC-PUC2(MW 322.3)的合成

[0188] 1)将乙醇胺(5.0g，48.5mmol，1eq)置于干燥的装有搅拌棒的100mL圆底烧瓶中，并且加入干燥THF(30mL)。将所得的溶液通过冰浴冷却至0℃。将异氰酸苯酯(5.19g，4.74mL，43.6mmol，0.9当量)和30mL干燥THF通过滴液漏斗逐滴加入乙醇胺/THF混合物，历时30分钟。将所得的混合物放置以升温至环境温度并且使其在搅拌下放置额外的16小时。使用旋转蒸发来去除THF。将所得的粗产物用乙酸乙酯重结晶，然后剧烈搅拌额外4小时。将重结晶的固体通过过滤来分离并且进一步用乙酸乙酯洗涤，并且干燥直到达到恒重，得到产率
7.0g(～80％)的中间体苯基脲乙醇(方案1中n＝2)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6，22℃):δ8.55(s，1H，-NHPh)，7.36(d，2H，PhH)，7.20(t，2H，PhH)，6.88(t，1H，PhH)，6.18(t，1H，-CH2NHCO-)，4.76(t，1H，-OH)，3.43(q，2H，-CH2OH)，3.15(q，2H，-CH2NHCO-)。

[0189] 2)如上述那样，通过使用乙二酰氯将MTC-OH(4.3g，26.8mmol)转化为MTC-Cl。将MTC-Cl溶解在50mL干燥二氯甲烷中，并且装入加料漏斗中。在干燥的装备有搅拌棒的500mL圆底烧瓶中装入苯基脲乙醇(5.55g，25mmol)、吡啶(1.97g，2.02mL，25mmol)以及干燥二氯甲烷(150mL)。在氮气下连接加料漏斗并且用冰浴将烧杯冷却至0℃。在30分钟的时段内逐滴加入MTC-Cl溶液，并将所得的溶液再搅拌30分钟。移去冰浴并且使溶液升温至环境温度并且在搅拌下放置额外的16小时。将粗产物通过使用硅胶的柱层析法纯化。二氯甲烷初始用作洗脱剂，随后逐渐增加极性，结束时最终浓度为5vol％甲醇。收集产物级分并且将溶剂通过旋转蒸发来去除。将分离的产物在真空下干燥直至达到恒重，得到8.0g(约80％)的米色/黄色油，其在静置下结晶。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6，22℃):δ8.59(s，1H，-NHPh)，7.38(d，2H，PhH)，7.21(t，2H，PhH)，6.89(t，1H，PhH)，6.26(t，1H，-CH2NHCO-)，4.57(d，2H，-COOCH2CH2-)，4.35(d，2H，-CH2OCOO-)，4.16，(t，2H，-CH2OCOO-)，3.35(q，2H，-CH2NHCO-)，
1.20(s，3H，-CH3)。

[0190] 实施例10.使用实施例9的程序和8-氨基-1-辛醇来制备MTC-PUC8(MW 406.5)。产1
率，86％，H-NMR(400MHz，DMSO-d6，22℃):δ8.37(s，1H，-NHPh)，7.38(d，2H，PhH)，7.21(t，
2H，PhH)，6.86(t，1H，PhH)，6.10(t，1H，-CH2NHCO-)，4.57(d，2H，-COOCH2CH2-)，4.39(d，2H，-CH2OCOO-)，4.17，(t，2H，-CH2OCOO-)，3.06(q，2H，-CH2NHCO-)，1.26-1.40(2s，15H，-(CH2)6-和-CH3)。

[0191] 实施例11.使用实施例9的程序和12-氨基-1-十二醇来制备MTC-PUC12(MW 462.6)。产率，65％,1H-NMR(400MHz，DMSO-d6，22℃):δ8.37(s，1H，-NHPh)，7.34(d，2H，PhH)，
7.17(t，2H，PhH)，6.83(t，1H，PhH)，6.09(t，1H，-CH2NHCO-)，4.51(d，2H，-COOCH2CH2-)，4.33(d，2H，-CH2OCOO-)，4.09，(t，2H，-CH2OCOO-)，3.02(q，2H，-CH2NHCO-)，1.28-1.56(m，23H，-(CH2)10-和-CH3)。

[0192] II. bPEI-25修饰

[0193] MTC-IPGAL修饰的bPEI-25

[0194] 根据方案2形成甘露糖修饰的bPEI-25。

[0195] 方案2

[0196]

[0197]

[0198]

[0199] 在以上结构中，一组花括号包括了聚合物链，并且下标(例如x、x')表示链中重复单元的数量。量n'+q等于未修饰的bPEI-25的每个大分子中伯胺基团的平均总摩尔量。量m'+q等于未修饰的bPEI-25的每个大分子中仲胺基团的平均总摩尔量。

[0200] 实施例12. 聚合物A的合成，甘露糖修饰的bPEI-25。给出MTC-IPMAN与bPEI-25开环以形成聚合物A的程序作为代表性的实施例。在手套箱中，将MTC-IPMAN(0.25g，0.625mmol，MW＝402.15g)加入bPEI-25(0.25g，0.025mmol，基于1摩尔＝10,000g＝Mn)在
2mL DCM中的溶液中，随后加入1,8-二氮杂双环[5,4,0]十一碳-7-烯(DBU，4.7mL，
0.031mmol)。bPEI-25:MTC-IPMAN的加料质量比为1:1，摩尔比为1:25。将反应溶液搅拌1小时。加入10mL甲醇和10mL1M HCl(水溶液)。将所得的反应混合物回流加热2小时，随后冷却至室温。最后，上述混合物通过Vivaspin 20浓缩器(截留分子量(MWCO)＝5k，Sartorius AG，Goettingen，德国)中的超滤而纯化，用去离子(DI)水洗涤三次，并且冷冻干燥(0.36g，
80％)。1H-NMR(400MHz，D2O，22℃):δ4.08(s，40H，H-d和H-e)，2.70-3.65(br，m，992H，H-e，H-f，H-g和支化聚乙烯亚胺的H)，1.06(s，61H，H-i)。

[0201] 基于1摩尔＝10000g，bPEI-25每摩尔具有58个伯胺基团、116个仲胺基团、58个叔胺基团和233个亚乙基，因此0.025mmol的bPEI-25包含有可能能够与环状碳酸酯单体反应的1.45mmol伯胺和1.45mmol仲胺。然而，bPEI-25的伯胺位点更有反应性，并且相对于MTC-IPMAN是过量存在的。在以上反应条件下，仅bPE-25的伯胺基团与MTC-IPMAN反应，而没有观察到MTC-IPMAN的开环聚合(对聚合物A，在方案2的以上结构中，x＝0且x'＝0)。反应产生约43％的bPEI-25伯胺基团的修饰，每个具有MTC-IPMAN的单个开环亚单元。对聚合物A，在方案2的最终结构中，下标的理论值为x＝0，x'＝0，p＝0，m'＝116，q＝25，n'＝33，k＝58，并且j＝233。NMR得到的实际值为x＝0，x'＝0，p＝0，m'＝116，q＝20，n'＝38，k＝58，以及j＝
233。

[0202] 实施例13和实施例14.使用实施例12的程序，分别使用1:8和1:75的bPEI-25:MTC-IPMAN的摩尔加料比来合成聚合物B和C。对聚合物B的NMR所得到的bPEI-25:甘露糖的摩尔比为1:7。因此，对聚合物B，在方案2的最终结构中，x＝0，x'＝0，p＝0，m'＝116，q＝7，n'＝51，k＝58，并且j＝233。对于聚合物C，使用了相对于可用的伯胺位点过量的MTC-IPMAN。过量的MTC-IPMAN可以与仲胺位点反应或者经历由修饰的伯胺位点的含醇的第一开环亚单元引发的开环聚合。对聚合物C的NMR所得到的bPEI-25:甘露糖的摩尔比为1:67。因此，对于聚合物C，在方案2的最终结构中，x≥0，x≥0，p≥0，m'≤116，q＝58，n'＝0，k＝58，并且j＝
233。

[0203] 实施例15和实施例16.在不存在DBU的情况下，甘露糖修饰的bPEI-25的合成。使用实施例12的程序，在不使用DBU的情况下，使用1:25的bPEI-25:MTC-IPMAN的摩尔加料比分别历时18小时和1小时，随后酸化，从而合成聚合物F和G。对于每种情况，可用的伯胺位点多于可用的MTC-IPMAN。对聚合物F的NMR所得到的bPEI-25：甘露糖的摩尔比为1:23。对于聚合物F，在方案2的最终结构中，x＝0，x'＝0，p＝0，m'＝116，q＝23，n'＝35，k＝58，并且j＝233。对聚合物G的NMR所得到的bPEI-25:甘露糖的摩尔比为1:23。对于聚合物G，在方案2的最终结构中，x＝0，x'＝0，p＝0，m'＝116，q＝23，n'＝35，k＝58，并且j＝233。

[0204] 实施例17、实施例18和实施例19.使用实施例12的程序，在使用DBU的情况下，分别使用1:58、1:120和1:400的bPEI-25：MTC-IPMAN的摩尔加料比以及1:2.3、1:5和1:16的质量加料比历时1小时，随后酸化，从而制备聚合物L、M和N。对聚合物L的NMR所得到的bPEI-25:甘露糖的摩尔比为1:53。对于聚合物L，在方案2的最终结构中，x＝0，x'＝0，p＝0，m'＝116，q＝53，n'＝5，k＝58，并且j＝233。对于聚合物M，MTC-IPMAN多于可用的伯胺位点。过量的MTC-IPMAN可以与仲胺位点反应或者经历由修饰的伯胺位点的含醇的第一开环亚单元引发的开环聚合。对聚合物M的NMR所得的bPEI-25:甘露糖的摩尔比为1:120。对聚合物M，在方案
2的最终结构中，x≥0，x'≥0，p≥0，m'≤116，q＝58，n'＝0，k＝58，并且j＝233。对于聚合物N，MTC-IPMAN以多于可用的伯胺位点和可用的仲胺位点的形式存在。过量的MTC-IPMAN可以与仲胺位点反应或者经历由修饰的伯胺位点的含醇的第一开环亚单元引发的开环聚合。没有测定聚合物N的bPEI-25:甘露糖的摩尔比，这是由于聚合物在D2O中自组装的倾向。对于聚合物N，在方案2的最终结构中，下标值估算为x≥0，x'≥0，p≥0，m'≤116，q＝58，n'＝0，k＝58，并且j>1。

[0205] 实施例20和实施例21.在不存在DBU的情况下，甘露糖修饰的bPEI-25的合成。使用实施例12的程序，在不使用DBU的情况下，分别使用1:12.5和1:6的bPEI-25:MTC-IPMAN的摩尔加料比以及2:1和4:1的质量加料比历时1小时，随后酸化，从而合成聚合物S和T。对聚合物S的NMR所得到的BPEI-25:MTC-IPMAN的摩尔比为1:12.2。对于聚合物S，在方案2的最终结构中，x＝0，x'＝0，p＝0，m'＝116，q＝12.2，n'＝45.8，k＝58，并且j＝233。对聚合物T的NMR所得到的bPEI-25:甘露糖的摩尔比为1:5.5。对于聚合物T，在方案2的最终结构中，x＝0，x'＝0，p＝0，m'＝116，q＝5.5，n'＝52.5，k＝58，并且j＝233。

[0206] MTC-IPGAL修饰的bPEI-25

[0207] 根据方案3形成葡萄糖修饰的bPEI-25。

[0208] 方案3

[0209]

[0210]

[0211] 实施例22.聚合物H的制备。MTC-IPGLU(MW 402.15)与bPEI-25(1摩尔＝10000g)的反应遵循实施例12的一般程序，不使用DBU，使用1:25的bPEI-25:MTC-IPGLU的摩尔加料比以及1:1的质量加料比。反应时间为1小时，随后酸化并且超滤纯化以得到聚合物H。对聚合物H的NMR所得到的bPEI-25:葡萄糖的摩尔比为1:23。对于聚合物H，在方案3的最终结构中，x＝0，x'＝0，p＝0，m'＝116，q＝23，n'＝35，k＝58，并且j＝233。

[0212] MTC-IPGAL修饰的bPEI-25

[0213] 根据方案4形成半乳糖修饰的bPEI-25。

[0214] 方案4

[0215]

[0216]

[0217] 实施例23.聚合物I的制备。MTC-IPGLU(MW 402.15)与bPEI-25(1摩尔＝10000g)的反应遵循实施例12的一般程序，使用1:25的bPEI-25:MTC-IPGLU的摩尔加料比以及1:1的质量加料比，不用DBU。反应时间为1小时，随后酸化并且超滤纯化以得到聚合物I。对聚合物I的NMR所得到的bPEI-25:半乳糖的摩尔比为1:24。对于聚合物I，在方案4的最终结构中，x＝0，x'＝0，p＝0，m'＝116，q＝24，n'＝34，k＝58，并且j＝233。

[0218] 实施例24.根据实施例23，使用1:12.5的bPEI-25:MTC-IPGAL的摩尔加料比以及2:1的质量加料比，从而合成聚合物R。对聚合物R的NMR所得到的bPEI-25:半乳糖的摩尔比为
1:12。对于聚合物R，在方案4的最终结构中，x＝0，x'＝0，p＝0，m'＝116，q＝12，n'＝46，k＝
58，并且j＝233。

[0219] 实施例25.根据实施例23，使用1:6的bPEI-25:MTC-IPGAL的摩尔加料比以及4:1的质量加料比，从而合成聚合物U。对聚合物U的NMR所得到的bPEI-25:半乳糖的摩尔比为1:5.6。对于聚合物U，在方案4的最终结构中，x＝0，x'＝0，p＝0，m'＝116，q＝5.6，n'＝52.4，k＝58，并且j＝233。

[0220] TMC修饰的bPEI-25

[0221] 根据方案5制备TMC修饰的bPEI-25聚合物。

[0222] 方案5

[0223]

[0224] 实施例26.聚合物J的制备。TMC(MW 102.1)与bPEI-25(1摩尔＝10000g＝Mn)的反应遵循实施例12的一般程序，使用1:25的bPEI-25:MTC-IPGLU的摩尔加料比以及1:1的质量加料比，不用DBU。反应时间为1小时。对聚合物J的NMR所得到的bPEI-25:开环的TMC的摩尔比为1:109。对于聚合物J，在方案5的最终结构中，x≥0，x'≥0，p≥0，m'≤116，q＝58，n'＝0，k＝58，并且j＝233。

[0225] 实施例27.根据实施例26，使用1:25的bPEI-25:MTC-IPGAL的摩尔加料比以及4:1的质量加料比，从而合成聚合物U。对聚合物K的NMR所得到的bPEI-25:开环的TMC的摩尔比为1:27。对于聚合物K，在方案5的最终结构中，x＝0，x'＝0，p＝0，m'＝116，q＝25，n'＝33，k＝58，并且j＝233。

[0226] 实施例28.根据实施例26，使用1:8的bPEI-25:TMC的摩尔加料比以及12:1的摩尔加料比，从而合成聚合物P。对聚合物P的NMR所得到的bPEI-25；开环的TMC的摩尔比为1:7。对于聚合物P，在方案5的最终结构中，x＝0，x'＝0，p＝0，m'＝116，q＝8，n'＝50，k＝58，并且j＝233。

[0227] 实施例29.根据实施例26，使用1:1的bPEI-25:TMC的摩尔加料比以及100:1的摩尔加料比，从而合成聚合物V。对聚合物V的NMR所得到的bPEI-25:开环的TMC的摩尔比为1:1。对于聚合物V，在方案5的最终结构中，x＝0，x'＝0，p＝0，m'＝116，q＝1，n'＝57，k＝58，并且j＝233。

[0228] MTC-C2修饰的bPEI-25

[0229] 实施例30.根据方案6制备聚合物O(MTC-C2修饰的bPEI-25)。

[0230] 方案6

[0231]

[0232] 根据实施例12、使用疏水单体MTC-C2合成聚合物O。bPEI-2:MTC-C12的摩尔加料比为1:25，并且质量加料比为2:1。对产物聚合物O的NMR所得到的BPEI-25；开环的MTC-C2的摩尔比为1:27。对于聚合物O，在方案6中，x＝0，x'＝0，p＝0，m'＝116，q＝25，n'＝33，k＝58，并且j＝233。

[0233] MTC-Bn修饰的bPEI-25

[0234] 实施例31.根据方案7、使用实施例12的程序制备聚合物P43(MTC-Bn修饰的bPEI-25)。

[0235] 方案7

[0236]

[0237] bPEI-2:MTC-Bn的摩尔加料比为1:25，并且质量加料比为1.6:1。反应时间为1小时，随后在乙醚中沉淀来纯化。对聚合物P43的NMR所得到的BPEI-25:氨基甲酸酯的摩尔比为1:29。对于聚合物P43，在方案7中，m＝116，q＝29，n'＝29，k＝58，并且j＝233。

[0238] 实施例32(比较).根据实施例31、使用1:3的bPEI-25:TMC-Bn的摩尔加料比(基于1摩尔bPEI-25＝10000g，以及MTC-Bn MW 250.3)以及13.3:1的质量加料比，从而制备聚合物P48。反应时间为1小时，随后在乙醚中沉淀来纯化。对聚合物P48的NMR所得到的BPEI-25:氨基甲酸酯的摩尔比为1:3。对于聚合物P48，在方案7中，m＝116，q＝3，n'＝55，k＝58，并且j＝233。

[0239] MTC-PUC2修饰的bPEI-25

[0240] 实施例33.根据方案8制备聚合物P44(MTC-PUC2修饰的bPEI-25)。

[0241] 方案8

[0242]

[0243] 根据实施例12、使用疏水单体MTC-PUC2合成聚合物P44。bPEI-2:MTC-PUC2的摩尔加料比为1:25，并且质量加料比为1.2:1。反应时间为1小时，随后在乙醚中沉淀来纯化。对产物聚合物P44的NMR所得到的BPEI-25:氨基甲酸酯的摩尔比为1:27。对于聚合物P44，在方案8中，m＝116，q＝27，n'＝31，k＝58，并且j＝233。

[0244] 实施例34(比较).根据实施例33、使用1:3的bPEI-25:MTC-PUC2的摩尔加料比以及10.4:1的摩尔加料比，从而合成聚合物P49(MTC-PUC2修饰的bPEI-25)。反应时间为1小时，随后在乙醚中沉淀来纯化。对产物聚合物P49的NMR所得到的BPEI-25:氨基甲酸酯的摩尔比为1:3.4。对于聚合物P49，在方案8中，m＝116，q＝3.4，n'＝54.6，k＝58，并且j＝233。

[0245] 胆甾醇基修饰的bPEI-25

[0246] 根据方案9由市售的胆甾醇氯甲酸酯(Chol-Cl)合成带有胆甾醇基的环状碳酸酯单体Chol-MTC。

[0247] 方案9

[0248]

[0249] 该制备涉及三个步骤：1)使氯甲酸酯Chol-Cl与2-溴乙胺氢溴酸盐在二氯甲烷中和三乙胺(TEA)反应以形成氨基甲酸酯Chol-Br；2)Chol-Br与酸二醇bis-MPA在二甲基甲酰胺(DMF)/KOH中碱催化反应以形成二醇酯Chol-MPA，以及3)三光气介导Chol-MPa环化以形成环状碳酸酯单体Chol-MTC，总产率为约26％。三个步骤中每个步骤的详细程序在下文提供。1H NMR和13C NMR用于确定中间体和环状碳酸酯单体的结构。

[0250] Chol-Br的制备。在装备有磁力搅拌棒的500mL的圆底烧瓶中，将胆甾醇氯甲酸酯(25.0g，55.7mmol，1.0当量)和2-溴乙胺氢溴酸盐(12.9g，63.0mmol，1.1当量)在二氯甲烷(200mL)中悬浮，并且将悬浮液在冰浴中冷却。历时1小时向该悬浮液逐滴加入三乙胺(TEA)(18.0mL，13,06g，129.1mmol，2.3当量)在二氯甲烷(100mL)中的溶液。将反应混合物在该浴中再保持1小时并且使其升温至室温。随后使反应再进行14小时，随后在真空下去除二氯甲烷并且将所得的固体悬浮在乙酸乙酯和己烷的1:1混合物(300mL)中。将有机层用饱和盐水(100mL)和去离子水(50mL)的混合物洗涤两次，并且用饱和盐水洗涤一次(100mL)。将有机层用硫酸钠干燥并且在真空下去除溶剂以获得淡黄色固体(29.1g，97.4％)。当通过1H NMR1
测定粗产物已具有令人满意的纯度时，不再进行进一步的纯化。H NMR(400MHz，CDCl3,δ，ppm)：5.38(胆甾醇中CH＝C)，5.03(侧链的NHCOO)，4.50(胆甾醇的CH-OCONH)，3.58
(BrCH2CH2NH)，2.45–0.6(胆甾醇中的其余质子)。

[0251] Chol-MPA的合成。在具有磁力搅拌棒的500mL圆底烧瓶中，将KOH(85％，2.0g，30.3mmol，1.1当量)、bis-MPA(4.20g，31.3mmol，1.1当量)和二甲基甲酰胺(DMF)(200mL)的混合物加热至100℃，持续1.5小时。形成均匀溶液，并且将Chol-Br(15.0g，28.0mmol，1.0当量)加入该热溶液。连续搅拌且加热16小时，并且减压去除大部分DMF以获得油状半固体，其随后被溶解在2:1乙酸乙酯:己烷的混合物(300mL)中。将有机溶液用饱和盐水(100mL)和去离子水(100mL)的混合物洗涤。将所得的水层用乙酸乙酯(3×100mL)萃取以回收洗涤过程中损失的Chol-MPA。将合并的有机层用饱和盐水(80mL)和去离子水(20mL)的混合物洗涤。
将合并的有机层用Na2SO4干燥，并且真空去除溶液以获得苍白色蜡状固体形式的粗产物(16.5g)。将硅胶用作填充材料并将己烷至乙酸乙酯的梯度用作洗脱剂，通过快速柱层析法纯化粗产物，以获得蜡状白色固体形式的最终产物Chol-MPA(10.7g，64.8％)。1H NMR(400MHz，CDCl3,δ，ppm)：5.35(胆甾醇中CH＝C以及侧链的NHCOO)，4.47(胆甾醇的CH-OCONH)，4.26(CH2CH2NHCOO)，3.88和3.72(CH2OH)3.45(CH2CH2NHCOO)，3.34(OH)，2.50–0.60(来自胆甾醇的其余质子以及来自bis-MPA的CH3)。

[0252] Chol-MTC的制备。在具有磁力搅拌棒的500mL的圆底烧瓶中，将Chol-MPA(10.1g，17.1mmol，1.0当量)溶解在无水二氯甲烷(150mL)中。加入吡啶(8.2mL，8.0g，101.5mmol，
5.9当量)并且将溶液在干冰-丙酮浴(-78℃)中冷却。向该冷却的反应混合物加入三光气(2.69g，9.06mmol，1.9当量，基于三光气的官能性当量)溶液(溶解在50mL的二氯甲烷中)，历时1小时。在1小时后，使反应混合物从-78℃升温至室温，并且在2小时后，通过加入饱和氯化铵水溶液(50mL)将反应猝灭。将有机层用1.0N的HCl(20mL)和饱和盐水(80mL)的混合物、随后用饱和盐水(50mL)和饱和NaHCO3(50mL)的混合物洗涤两次，并用Na2SO4干燥。真空去除溶剂得到微黄色固体形式的粗产物。将硅胶用作填充材料并且将氯仿至氯仿:乙酸乙酯(4:1)混合物的梯度用作洗脱剂，通过快速柱层析法纯化粗产物，以获得蜡状白色固体形式的最终产物Chol-MTC(6.8g，65％)。1H NMR(400MHz，CDCl3,δ，ppm)：5.35(胆甾醇中CH＝C)，4.95(NHCOO)，4.86和4.27(CH2OCOOCH2)，4.47(胆甾醇的CH-OCONH)，4.27
(CH2CH2NHCOO)，3.45(CH2CH2NHCOO)，2.40–0.60(来自胆甾醇的其余质子以及环状碳酸酯单体中的CH3)。

[0253] 实施例35.聚合物P45的制备。根据方案10制备Chol-MTC修饰的bPEI-25聚合物。

[0254] 方案10

[0255]

[0256] 在该实施例中，目标q值为3，目标n'值为55，这是由于大于三个含胆甾醇基的侧基导致最终产物不溶。bPEI-25:Chol-MTC的摩尔加料比为1:3(基于1摩尔bPEI-25＝10000g和Chol-MTC MW 615.9)并且质量加料比为5.41:1。反应时间为1小时，随后通过在乙醚中沉淀来纯化。聚合物P45的NMR得到的bPEI-25:氨基甲酸酯的摩尔比为1:2.91。对于聚合物P45，m＝116，q＝2.9，n'＝55.1，k＝58，并且j＝233。

[0257] 实施例36(比较).聚合物P46的制备。根据方案11制备胆甾醇氯甲酸酯修饰的bPEI-25聚合物P46。

[0258] 方案11

[0259]

[0260] 在该实施例中，目标q值为3，目标n'值为55。反应是在bPEI-25：Chol-Cl的摩尔加料比为1:3.2(基于1摩尔bPEI-25＝10000g和Chol-MTC MW 449.11)且质量加料比为7:1下进行的。反应时间为2小时，随后在乙醚中沉淀来纯化。聚合物P46的NMR得到的bPEI-25:氨基甲酸酯的摩尔比为1:2.2。对于聚合物P46，m＝116，q＝2.2，n'＝55.8，k＝58，并且j＝233。

[0261] 氯甲酸丁酯修饰的bPEI-25

[0262] 实施例37(比较).聚合物P47的制备。根据方案12制备氯甲酸丁酯(BuOCOCl)修饰的bPEI-25聚合物P47。

[0263] 方案12

[0264]

[0265] 在该实施例中，目标q值为25，目标n'值为33。bPEI-25:BuOCOCl的摩尔加料比为1:25.2(基于1摩尔bPEI-25＝10000g和BuOCOCl的MW 136.57)且质量加料比为2.9:1。反应时间为2小时，随后在乙醚中沉淀来纯化。聚合物P47的NMR得到的bPEI-25:氨基甲酸酯的摩尔比为1:24.4。对于聚合物P47，m＝116，q＝24.4，n'＝33.6，k＝58，并且j＝233。

[0266] 表4总结了聚合物的制备。

[0267] 表4

[0268]

[0269]

[0270]

[0271] a环状单体摩尔数/伯胺基团摩尔数×100％。

[0272] 表5总结了修饰的bPEI-25聚合物的NMR分析。

[0273] 表5

[0274]

[0275]

[0276] a基于1摩尔bPEI-25＝10000g，每摩尔含有58个伯胺基团。

[0277] b大于100％的值表示在所有活性伯胺位点反应，以及仲胺基团反应和/或环状碳酸酯单体开环聚合。

[0278] b大于58的数值表示在所有活性伯胺位点反应，以及仲胺基团反应和/或环状碳酸酯单体开环聚合。

[0279] III.与生物活性材料复合

[0280] 细胞培养

[0281] 将HepG2、HeLa和SK-OV-3细胞在伊格尔最低必需培养基(Minimum Essential Medium Eagle，MEM，Invitrogen，新加坡，用于HepG2)以及RPMI 1640培养基(Invitrogen，新加坡，用于HeLa和SK-OV-3)中培养。两种培养基用10％胎牛血清(FBS，Invitrogen，新加坡)、100微克/mL链霉素、100U/mL青霉素青霉素、2mM L-谷氨酰胺以及1mM丙酮酸钠(Sigma-Aldrich，新加坡)补充。将MEM进一步用1mM非必需氨基酸(Sigma-Aldrich，新加坡)补充。将细胞在37℃于5％CO2和95％潮湿空气的气氛下培养。当达到90％融合时，将所有细胞系用胰蛋白酶/EDTA培养基分裂。

[0282] 聚合物/siRNA和聚合物/DNA复合物的形成

[0283] 将bPEI-25和bPEI-2分别溶于不含脱氧核糖核酸酶/核糖核酸酶的水和HPLC水中以制得聚合物水溶液。为了形成复合物，在温和地涡旋中，在约10秒内钟将siRNA或DNA的等体积溶液滴入聚合物溶液中，以获得预期的N/P比(聚合物中的氮含量与核酸的磷含量的摩尔比)。在用于后续研究之前，将混合物在环境温度下平衡30分钟以允许完成聚合物与siRNA或DNA分子之间的静电相互作用。

[0284] 聚合物/DNA和聚合物/siRNA复合物的粒径和ζ电势分析

[0285] 通过使用658nm的He-Ne激光束和90°散射角的动态光散射(Brookhaven Instrument Corp.，Holtsville，纽约，美国)以及Zetasizer(Malvern Instrument Ltd.，伍斯特郡，英国)分别测量平衡后的聚合物/DNA复合物的粒径和ζ电势。对每个样品重复3次粒径和ζ电势测量并且将3组读数报告为平均值±标准偏差。

[0286] 表6列出两种N/P比的一些修饰的bPEI-25聚合物/GFP报告基因复合物的动态半径。

[0287] 表6

[0288]

[0289]

[0290] b大于100的百分数表示所有活性伯胺位点反应，以及仲胺基团反应和/或环状碳酸酯单体开环聚合。

[0291] 尺寸范围通常为20nm至200nm的聚合物纳米颗粒大到足以避免经由肾脏中肾小球过滤的过早排出，但是小到足以进入血管以及利用增强的渗透和滞留(EPR)效应而在目标肿瘤组织中被动累积。如从图1至图4可以看出，使用GFP报告基因(图1)和荧光素酶报告基因(图2至图4)的DNA复合物的尺寸一般随着N/P比的增加而减小，表明了聚合物和DNA之间的更强的静电相互作用使阳离子聚合物与阴离子DNA之间能够形成更致密的复合物。该效应在聚合物A、B、F、U、R、P和J中尤为突出。聚合物A和B的GFP基因复合物从N/P 5时的超过400nm和1000nm分别降至N/P 30时的119nm和103nm。聚合物F、U、R、P和J的荧光素酶基因复合物从N/P 10时的超过250nm、280nm、370nm、270nm和260nm分别降至N/P 50时的91nm、
96nm、99nm、113nm和131nm。聚合物G/荧光素酶基因复合物的粒径从N/P 10时的269nm降低至N/P 50时的202nm，这在所期望的纳米尺寸范围内。对于由环状碳酸酯单体修饰的伯胺基团百分数最低的聚合物S、T、U和V，观察到与图2至图4中其它聚合物相比更致密的荧光素酶基因复合物。聚合物V产生最小的荧光素酶基因复合物(87nm)。聚合物C和L并非与其他聚合物一样有效地形成基因聚合物，甚至在高N/P比时产生大的颗粒(图1和图2)。A、B、S、T、F、G、L、U、R、I、H、V、P、J、K和O的基因复合物得到窄的粒径分布，其多分散度分别为0.178、0.200、
0.168、0.104、0.129、0.078、0.150、0.130、0.120、0.207、0.209、0.149、0.075、0.104、0.097和0.123。M和N的基因复合物的多分散度大，分别大于0.4和0.7。为了比较，N/P 10的未修饰的bPEI-25的荧光素酶报告基因复合物具有84nm的粒径(未示出)。

[0292] 基因复合物的净正电荷影响复合物与细胞膜的带负电的磷脂表面的相互作用，因此还影响基因转染效率。图5示出A、B和C的GFP报告基因复合物的ζ电势。图6示出S、T、F、G、L、M和N的GFP报告基因复合物的ζ电势。A、B、S、T、F和G的GFP基因复合物在N/P 10至N/P 50下具有与未修饰的bPEI-25的GFP基因复合物的数值相当的阳离子表面电荷密度。S、T、F和G的荧光素酶基因复合物具有与未修饰的bPEI-25/荧光素酶基因复合物相比数值相当或略低的阳离子表面电荷密度。因此，A、B、S、T、F和G的基因络合物的ζ电势在15mV至26mV的范围内，而在N/P 10下制备的bPEI-25的相应基因复合物具有约22mV(bPEI-25/GFP)或26mV(bPEI-25/荧光素酶)的ζ电势(未示出)。

[0293] 在相同N/P比下C(GFP)、L(荧光素酶)、M(荧光素酶)和N(荧光素酶)的基因复合物具有显著更低的在表面上的阳离子电荷密度。对于C、L、M、N的复合物，ζ电势分别为5mV至13mV、-11mV至2mV、-14mV至-8mV和-25mV至-14mV。不受理论限制，聚合物C、L、M和N的基因复合物被认为是不怎么有效的转染试剂，这是由于其粒径大且ζ电势低。

[0294] 在所有N/P下I、R、U(半乳糖修饰的bPEI-25)和H(葡萄糖修饰的bPEI-25)的荧光素酶报告基因复合物的ζ电势为7mV至20mV(图7)。这些值与N/P比为10的未修饰的bPEI-25的荧光素酶复合物所得的值(未示出)相比略低。相似地，V、P、K、J和O的荧光素酶报告基因复合物的ζ电势为7mV至20mV(图8)。

[0295] 凝胶阻滞试验

[0296] 聚合物/DNA复合物的多种制剂如上那样并以1至30的N/P比制备。平衡之后，将DNA复合物电穿孔在1％琼脂糖凝胶上。将琼脂糖凝胶用每50mL琼脂糖溶液5微升10mg/mL溴化乙锭染色。将凝胶在0.5×TBE缓冲液中在80V下运行50分钟，随后在UV照射器(Chemi Genius，Evolve，新加坡)下分析以显示复合DNA与裸DNA质粒的相对位置。

[0297] 图9至图27为以下多种修饰的聚合物的荧光素酶报告基因复合物的DNA梯状电泳的照片：A(图9)、B(图10)、F(图12)、G(图13)、S(图14)、T(图15)、U(图19)、R(图20)、I(图21)、H(图22)、V(图23)、P(图24)、K(图25)、J(图26)和O(图27)能有效地与DNA结合并压缩该DNA，在N/P 3以下的复合物中完全减缓DNA迁移率。通过比较，C(图11)、L(图16)、M(图17)和N(图18)的DNA结合能力差，并且仅N/P 15的C观察到了完整的DNA结合。甚至在N/P 30下，聚合物L、M和N都不能与DNA结合并且有效地压缩该DNA(由于碳酸酯-甘露糖连接而消耗了更多的胺基团)。

[0298] 图28为未修饰的bPEI-25/荧光素酶复合物的DNA梯状电泳的照片。图29为未修饰的bPEI-2/荧光素酶复合物的DNA梯状电泳的照片。图28和图29示出在N/P比为3时每个复合物都实现完整的DNA结合。

[0299] 体外基因表达

[0300] 使用HepG2、HeLa和SK-OV-3细胞系研究修饰的bPEI-25聚合物的GFP报告基因和荧5
光素酶基因复合物的体外基因转染效率。将HepG2细胞和HeLa细胞以2×10个细胞/1000微升/孔的密度接种在12孔板上以用于GFP基因递送。将HepG2细胞以1×105个细胞/500微升/孔的密度接种在24孔板上以用于荧光素酶基因递送。将SK-OV-3细胞以8×104个细胞/500微升/孔的密度接种在24孔板上以用于荧光素酶基因递送。24小时之后，将平板培养基用新鲜的培养基替换，随后逐滴加入多种N/P比的100微升的复合物溶液(含3.5微克GFP质粒DNA)或多种N/P比的50微升的复合物溶液(含2.5微克荧光素酶质粒DNA)。在4小时孵育之后，将游离复合物通过替换各孔中的培养基而去除。在另外68小时孵育之后，将在各孔中的细胞培养基去除，并且将细胞用0.5mL磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)冲洗一次。

[0301] 对于GFP蛋白表达分析，加入0.3mL胰蛋白酶以分离各个孔中的细胞。随后加入新鲜的生长培养基(0.3mL)，并且将细胞悬浮液在1500rpm离心5分钟。在FACS缓冲液(用2％牛血清白蛋白补充的PBS)中将再悬浮和离心的细胞-洗涤循环再进行两次。随后使用流式细胞分析仪(FACSCalibur，BD Biosciences，USA)，从10000个事件中测定表达GFP的细胞的百分数，并且报告为三次重复试验的均值值±标准偏差。

[0302] 对于荧光素酶表达试验，将0.2mL报告溶解缓冲液加入各孔中。在冷冻(-80℃，30分钟)和融化的两个循环后收集的细胞溶解产物通过14000rpm离心5分钟而变得澄清，之后将20微升上清液与100微升荧光素酶底物混合，以使用照度计(Lumat LB9507，Berthold，德国)来测定相对发光单位(RLU)。针对使用BCA蛋白试验测定的上清液的蛋白浓度来归一化RLU读数以得到总体荧光素酶表达效率。在所有体外基因表达实验中，裸DNA用作负对照。未修饰的bPEI-25/基因复合物和在一些实例中的未修饰的bPEI-2/基因复合物用作正对照。这些对照是在最佳N/P比(即对于bPEI-25而言N/P为10，对于bPEI-2而言N/P为40)下制备的，其诱导高基因表达效率且提供接近或高于50％的细胞活力。数据表示为四次重复实验的平均值±标准偏差。

[0303] 将以下程序用于siRNA转染和实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析。使用HeLa细胞系研究聚合物的体外siRNA递送性质。将细胞以1×105个细胞/1000微升/孔的密度接种在12孔板上。24小时之后，将平板培养基用新鲜的生长培养基替换，随后逐滴加入N/P比为50的100微升的复合物溶液(包含与多种聚合物复合的100nM bcl-2siRNA或负对照siRNA)。在4小时孵育之后，将游离复合物通过替换各孔中的培养基而去除。在另外68小时孵育之后，将在各孔中的细胞培养基去除，并且对细胞进行RNA提取。

[0304] 每个条件进行两次重复试验以保证结果的可再现性，并且每个样品是从12孔板的单个孔中取出的。根据 迷你手册使用 迷你试剂盒(Qiagen，新加坡)提取来自未处理的HeLa细胞或者用聚合物/bcl-2siRNA或负对照siRNA转染的细胞的总RNA。
随后使用寡聚(dT)18引物、根据制造商的说明、通过SuperScriptTM III逆转录酶
(Invitrogen，新加坡)将总RNA逆转录。使所得的cDNA经历使用 Green PCR 
master mix(2x)(Stategene，新加坡)进行且使用Rotorgene 6000(Corbett Research)检测的实时PCR反应。购买用于Bcl-2(靶基因)和β-肌动蛋白(内对照)的定制引物，序列如下：
Bcl-2：有义5’-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3’，反义5’-CCGCATG CTGGGGCCGTACAGTTCC-3’；β-肌动蛋白，有义5’-GCTCGTCGTCG ACAACGGCTC-3’，反义5’-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3’。β-肌动蛋白引物序列基于由Superscript III逆转录试剂盒提供的Invitrogen引物，并且得到353-bp产物。定制Bcl-2引物基于文献(Huang等人，Acta Pharmacologica 
Sinica，2006Feb；27(2):242–248)。25微升反应混合物含有12.5微升 Green I 
PCR master mix(2×)、10微摩尔的每种引物、9.5微升DEPC处理的水以及2微升cDNA样品。
反应条件设置如下：(1)在95℃下孵育10分钟；(2)扩增45个循环(每个循环在95℃下45秒、在55℃下45秒、在72℃下90秒)；(3)对最终延伸进行72℃下7分钟的1次循环；(4)从72℃至
95℃逐步升温，每步变化1度，两步之间间隔5秒。使用2-ΔΔCT方法(Livak等人，Methods，25，
402–408(2001))针对管家基因β-肌动蛋白归一化经过各种处理的Bcl-2基因表达水平的平均倍数变化。

[0305] 在HepG2细胞中的GFP转染效率

[0306] 图30至图33为比较在HepG2细胞中不同N/P比的多种修饰的bPEI-25聚合物介导的体外GFP基因转染效率的柱状图。图34为描述在HeLa细胞中不同N/P比的多种修饰的bPEI-25聚合物介导的体外GFP基因转染效率的柱状图。结果表示为三次重复实验的平均值±标准偏差。按照所规定的N/P比排列的聚合物浓度(mg/L)如下：未修饰的bPEI-25-0、0.8、1.6、
2.4、3.2、4.0、6.0、8.0、12.0、16.0和20.0mg/L；A、F、G、H、I、J-0、3.3、4.9、6.6、8.2、12.3、
16.4、24.6、32.8和41.0mg/L；B-0、2.2、3.3、4.4、5.5、8.2、11.0、16.4、21.9和27.4mg/L；C-
0、6.6、9.9、13.1、16.4、24.6、32.8、49.3、65.7和82.1mg/L。K-0、2.1、3.1、4.1、5.2、7.7、
10.3、15.5、20.6和25.8mg/L；L-0、4.4、6.7、8.9、11.1、16.7、22.2、33.3、44.4和55.5mg/L；
M-0、9.5、14.3、19.1、23.9、35.8、47.7、71.6、95.5和119.3mg/L；N-0、28.1、42.2、56.3、
70.3、105.5、140.7、211.0、281.3和351.7mg/L；T、U-0、2.0、3.1、4.1、5.1、7.7、10.2、15.3、
20.4、25.5mg/L；R、S-0、2.5、3.7、4.9、6.2、9.2、12.3、18.5、24.6和30.8mg/L；V-0、1.7、2.5、
3.3、4.2、6.2、8.3、12.5、16.6和20.8mg/L；P-0、1.8、2.7、3.6、4.5、6.7、8.9、13.4、17.8和
22.3mg/L；O-0、2.4、3.6、4.8、6.0、9.1、12.1、18.1、24.2和30.2mg/L。P43–0、2.7、4.0、5.3、
6.7、10.0、13.4、20.0、26.7和33.4mg/L；P44–0、3.0、4.5、5.9、7.4、11.1、14.8、22.3、29.7和
37.1mg/L。

[0307] 如图30的柱状图所示，一些甘露糖修饰的bPEI-25聚合物(A、B、S、T和G)的GFP复合物在HepG2细胞中实现高GFP转染效率(约20％至约50％)。通常，增加N/P比导致更高的转染效率。未修饰的bPEI-25的对照GFP报告基因复合物在N/P为15时具有4.8％效率，并且在N/P为40和50时达到约25％效率的平台。在低于30的N/P比下，A和B(在MTC-IPMAN连接之后具有更多的未反应的胺基团)具有与未修饰的bPEI-25相当的GFP转染效率。在30-50的N/P下，聚合物A和B的GFP转染效率高于未修饰的bPEI-25。C、L、M和N的GFP复合物与未修饰的bPEI-25相比具有低得多的转染效率，这是因为其粒径大、粒径分布大并且表面上的阳离子电荷密度低。在所有甘露糖修饰的聚合物中，S、T和G表现出最高的GFP转染效率(在N/P为50下分别为37％、36％和47％)，其高于在所测试的所有N/P比下未修饰的bPEI-25(图30)。

[0308] 在葡萄糖和半乳糖修饰的bPEI-25聚合物中，聚合物R(bPEI-25:半乳糖＝1:12.5)在N/P 50下实现最高的GFP转染效率。聚合物U(bPEI-25:半乳糖＝1:6)、I(bPEI-25:半乳糖＝1:25)、H(bPEI-25:葡萄糖＝1:25)具有与未修饰的bPEI-25相当的GFP转染效率(图31)。

[0309] 如图32所示，与未修饰的bPEI-25相比，用疏水环状羰基单体(TMC和MTC-C2)制备的修饰的bPEI-25聚合物P、K和O在HepG2细胞中具有大幅提高的GFP转染效率，尤其是聚合物K(bPEI-25:TMC＝1:25)，其转染效率在N/P 50下达到64％，是目前所有聚合物中所实现的最高值。聚合物P(bPEI-25:TMC＝1:8)和O(bPEI-25:MTC-C2＝1:25)在N/P 50下分别具有35％和48％的GFP转染效率。聚合物J(bPEI-25:TMC＝1:100)和V(bPEI-25:TMC＝1:1)在N/P 
50下具有与未修饰的bPEI-25相当的GFP转染效率(22-26％)。

[0310] 与未修饰的bPEI-25相比，在氨基甲酸酯基中包含苄酯或含苯基脲的酯的修饰的bPEI-25聚合物在HepG2细胞系中具有更低的GFP转染效率(图33)。因此，聚合物P43(苄酯，46％的伯胺基团被修饰)和聚合物P43(苯基脲酯，46％的伯胺基团被修饰)在N/P 50下分别具有约12％和约15％的GFP转染效率。

[0311] 在HeLa细胞中的GFP转染效率

[0312] 在HeLa细胞中，未修饰的bPEI-25的GFP报告基因复合物与修饰的bPEI-25聚合物A、B、C、F和G的复合物相比具有更高的GFP转染效率(图34)。在HeLa细胞中，聚合物F在N/P 50下具有6.9％的最高GFP转染效率。然而，在N/P 50下，未修饰的bPEI-25与N/P 20至50的聚合物F相比是高细胞毒性的(图40)。当在相当的细胞活力下比较GFP转染效率时，未修饰的bPEI-25具有低得多的转染效率(<2％在N/P 20下)(图34)。

[0313] 在SK-OV-3细胞中的GFP转染效率

[0314] 图35比较在SK-OV-3细胞系中修饰的bPEI-25聚合物O、K和P44、P46、P48和P49的GFP转染效率。在N/P 10下，O、K、P48和P49的效率(60％至68％)高于未修饰的bPEI-25(45％)。在N/P 15下，聚合物O和K与未修饰的bPEI-25(约70％)相比具有略高的GFP转染效率(分别为约72％和约78％)。当高于N/P 15时，修饰的bPEI-25聚合物的效率相对于未修饰的bPEI-25降低。在N/P 20下，未修饰的bPEI-25具有约80％的最大效率。胆甾醇基修饰的bPEI-25聚合物P46在N/P 10至20下效率最低(约5％至20％)，并且在N/P 20至30下具有约25％的最大效率。

[0315] 在HepG2细胞中的荧光素酶表达

[0316] 尽管GFP转染效率反映了用于GFP表达的由GFP质粒成功转染的细胞的百分数，荧光素酶试验则检测了在被转染的细胞中平均蛋白表达水平。如在图36中可见的，聚合物A、B和未修饰的bPEI-25的荧光素酶表达谱是相似的，并且荧光素酶表达水平随着N/P增加，直至约N/P 15，并且对于N/P比15至40，在约1×109RLU/mg蛋白处趋于平缓。由C诱导的荧光素酶表达水平比由未修饰的bPEI-25介导的荧光素酶表达水平低两个数量级。由C/DNA介导的低基因转染效率与C的大小和ζ电势数据相关(图1至图5)。在图36中按照所规定的N/P比排列的聚合物浓度如下：未修饰的bPEI-25-0、1.1、2.3、3.4、4.6、5.7、8.6、11.5、17.2和22.9mg/L；A-0、2.3、4.7、7.0、9.4、11.7、17.6、23.4、35.1和46.8mg/L；B-0、1.6、3.1、4.7、
6.3、7.8、11.7、15.6、23.5和31.3mg/L；C-0、4.7、9.4、14.1、18.8、23.5、35.2、46.9、70.4和
93.8mg/L。

[0317] 细胞毒性测试程序

[0318] 对HepG2、HeLa和SK-OV-3细胞，使用标准MTT试验方案来研究修饰的bPEI-25/基因复合物和修饰的bPEI-25/siRNA复合物的细胞毒性。GFP质粒用于复合物形成以及HepG2和HeLa细胞的处理，而荧光素酶质粒用于复合物形成以及SK-OV-3细胞的处理。

[0319] 将HepG2、HeLa和SK-OV-3细胞以每孔10000个细胞、5000个和16000个细胞的密度分别接种在96孔板上，并且在处理之前使其生长至60％至70％的融合。不同N/P比的聚合物/基因或聚合物/siRNA复合物是如上述那样在水中制备的。各孔中的细胞随后与生长培养基在37℃下一起孵育4小时，该生长培养基包括10微升聚合物/核酸复合物和100微升新鲜的培养基。孵育之后，用新鲜的生长培养基替换该培养基并且再孵育68小时。随后，将100微升生长培养基和20微升MTT溶液(5mg/mL，在PBS中)加入各孔中，并且将细胞在37℃下孵育4小时。当去除生长培养基时，将各孔中形成的甲躜晶体用150微升DMSO溶解。随后将来自各孔的100微升的等份转移至新的96孔板，以使用微板分光光度计测定在550nm和690nm波长下的吸光度。相对细胞活力表示为[(A550-A690)样品/(A550-A690)对照]×100％。数据表示为每个N/P比下至少八次重复实验的平均值±标准偏差。

[0320] 在HepG2和Hela细胞系中的细胞毒性

[0321] 图37至图39为示出与多种N/P比的修饰的bPEI-25聚合物A、B、C、S、T、F、G、L、M、N、U、R、I、H、V、P、K、J、O以及未修饰的bPEI-25的GFP报告基因复合物一起孵育之后HepG2细胞的活力的柱状图。图40为示出与多种N/P比的修饰的bPEI-25聚合物A、B、C、F和G以及未修饰的bPEI-25的GFP报告基因复合物一起孵育之后HeLa细胞的活力的柱状图。在两种细胞系中，在N/P 20至50下修饰的bPEI-25聚合物的所有基因复合物与未修饰的bPEI-25的基因复合物相比细胞毒性低得多。结果表示为至少8次重复实验的平均值±标准偏差。按照所规定的N/P比排列的聚合物浓度如下：未修饰的bPEI-25-0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0、6.0、8.0、12.0、16.0和20.0mg/L；A、F、G、H、I、J-0、1.6、3.3、4.9、6.6、8.2、12.3、16.4、24.6、32.8和
41.0mg/L；B-0、1.1、2.2、3.3、4.4、5.5、8.2、11.0、16.4、21.9和27.4mg/L；C-0、3.3、6.6、
9.9、13.1、16.4、24.6、32.8、49.3、65.7和82.1mg/L；K-0、1.0、2.1、3.1、4.1、5.2、7.7、10.3、
15.5、20.6和25.8mg/L；L-0、2.2、4.4、6.7、8.9、11.1、16.7、22.2、33.3、44.4和55.5mg/L；M-
0、4.8、9.5、14.3、19.1、23.9、35.8、47.7、71.6、95.5和119.3mg/L；N-0、14.1、28.1、42.2、
56.3、70.3、105.5、140.7、211.0、281.3和351.7mg/L；T、U-0、1.0、2.0、3.1、4.1、5.1、7.7、
10.2、15.3、20.4、25.5mg/L；R、S-0、1.2、2.5、3.7、4.9、6.2、9.2、12.3、18.5、24.6和30.8mg/L；V-0、0.8、1.7、2.5、3.3、4.2、6.2、8.3、12.5、16.6和20.8mg/L；P-0、0.9、1.8、2.7、3.6、
4.5、6.7、8.9、13.4、17.8和22.3mg/L；O-0、1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、9.1、12.1、18.1、24.2和
30.2mg/L。

[0322] 如图37至图40所示，用未修饰的bPEI-25/基因复合物处理的HepG2和HeLa细胞的活力在N/P比大于15时陡然降低(增加未修饰的bPEI-25的浓度)。当N/P为20以上时，HepG2细胞活力小于60％。当N/P为30以上时，HeLa细胞活力小于46％(图40)。具体地，当用未修饰的bPEI-25/DNA复合物处理时，在N/P 50下，HepG2的细胞活力为仅约20％，并且HeLa的细胞活力仅为4.6％。然而，用N/P 50的A、B、C、S、T、F、G、L、M、N、U、R、I、H、V、P、K、J和O的DNA复合物处理的HepG2细胞的活力分别为57％、57％、82％、84％、87％、63％、73％、95％、94％、94％、87％、81％、87％、82％、75％、91％、87％、89％、99％(图37至图39)。用N/P 50的A、B、C、F、G的DNA复合物处理的HeLa细胞的活力在每种情况下为100％(图40)。

[0323] 尽管未修饰的bPEI-25展示出在HepG2细胞系中约25％的峰值转染效率(N/P 40)并且在N/P 50下在Hela细胞系中约9％的峰值转染效率，但是其在高于N/P 15时的高毒性阻碍了其在体内应用方面的可能性，体内应用通常需要高的聚合物浓度以实现明显的治疗效果。在本研究中，通过用甘露糖官能化的环状碳酸酯和其它官能化的环状碳酸酯的修饰来显著增强细胞活力。甘露糖是常见的代谢产物并且研究已经表明甘露糖直接应用于哺乳动物糖蛋白生物合成。因此，其不会对细胞带来任何毒性作用。与未修饰的bPEI-25(在HepG2细胞中高于N/P 15时以及在Hela细胞中高于N/P 20时的细胞活力<60％)相比，使用N/P 30至50的甘露糖修饰的bPEI-25，百分比高得多的HepG2细胞保持活力，并且甚至在N/P 50下，几乎所有HeLa细胞都有活力。重要地，在N/P 30至50下，由修饰的bPEI-25聚合物提供的基因转染效率显著高于在N/P 15下由未修饰的bPEI-25所给予的基因转染效率(图30至图34)。用半乳糖、葡萄糖和疏水基团修饰的bPEI-25与未修饰的bPEI-25相比也表现出降低的细胞毒性。

[0324] 在SK-OV-3细胞系中的细胞毒性

[0325] 在N/P 15至40下，在O/GFP基因复合物存在下的SK-OV-3细胞活力小于具有未修饰的bPEI-25的对照复合物存在下的细胞活力(图47)。然而，在N/P 10和15下，聚合物K(用TMC制备，46％胺修饰)的效率(约75％)和细胞活力(90％以上)都优于未修饰的bPEI-25。

[0326] 在HeLa细胞中siRNA介导的Bcl-2敲减

[0327] 如图41的柱状图所示，使用聚合物A和聚合物B成功地将siRNA递送至HeLa细胞内，并且显示出在mRNA水平下的Bcl-2下调。在图41中，所使用的相应的聚合物浓度为：未修饰的bPEI-25-8.4mg/L；A-17.1mg/L；B-11.4mg/L；C-34.3mg/L。对于由聚合物A/siRNA和聚合物B/siRNA复合物介导的Bcl-2敲减，mRNA表达水平分别降低至未处理的HeLa细胞的25％和29％，这与由未修饰的bPEI-25/siRNA复合物诱导的敲减水平相当(26％)。在使用负对照siRNA(即杂乱siRNA)的对照试验中，没有观察到mRNA下降。然而，通过聚合物C的siRNA递送没有成功，因为Bcl-2mRNA的量仍为未处理的细胞的85％。

[0328] 在用聚合物/siRNA复合物处理之后的HeLa细胞的活力

[0329] 图42为示出在用多种N/P比的修饰的bPEI-25/siRNA复合物处理之后HeLa细胞的活力的柱状图。siRNA浓度被固定为100nM。对应于所用的不同N/P比的聚合物浓度：未修饰的bPEI-25-0.7、1.0、1.3、1.7、2.5、3.4、5.0、6.7、8.4和10.1mg/L；A-1.4、2.1、2.7、3.4、5.1、6.9、10.3、13.7、17.1和20.6mg/L；B-0.9、1.4、1.8、2.3、3.4、4.6、6.9、9.2、11.4和
13.7mg/L；和C-2.7、4.1、5.5、6.9、10.3、13.7、20.6、27.4、34.3和41.2mg/L。

[0330] 在本研究中测试的siRNA和聚合物的浓度下，HeLa细胞似乎对Bcl-2siRNA诱导的细胞死亡有抗性。如在图42可见的，当在多个N/P比下将Bcl-2siRNA或杂乱的siRNA(负对照)递送到Hela细胞中时，在细胞毒性之间没有区别。因此，在细胞活力上的任何区别均归因于所用的聚合物的性质。在使用N/P比60的未修饰的bPEI-25/Bcl-2siRNA复合物处理之后，82％的细胞仍然是活的。对于A、B和C/Bcl-2siRNA复合物，在N/P 60下，几乎100％的HeLa细胞有活力。与mRNA敲减数据一起，聚合物A和B在与带负电的siRNA复合以及介导siRNA被HeLa细胞摄入方面是有效的，在与未修饰的bPEI-25相当的水平下产生成功的Bcl-2mRNA下调，同时保持优异的细胞活力。尽管在Bcl-2mRNA敲减之后HeLa细胞对死亡有抗性，但是报道了该mRNA敲减使癌细胞对抗癌药物敏感。

[0331] 表7比较了当细胞活力为80％以上时，所选的修饰的bPEI-25聚合物和未修饰的bPEI-25在HepG2、Hela和SK-OV-3细胞系中得到的最大GFP转染效率。在表7中还列出了细胞活力为80％以上时的最大N/P比。

[0332] 表7

[0333]

[0334]

[0335] 在HepG2细胞系(表7)中，对于80％以上的细胞活力，未修饰的bPEI-25具有15的最大N/P比和5％的最大GFP转染效率。通常，对于80％以上的细胞活力，环状碳酸酯修饰的bPEI-25聚合物具有更高的最大N/P比(N/P 20至50)和更高的最大GFP转染效率(8％至64％)。除了聚合物J和V，使用约1:6至约1:25的bPEI-25:环状碳酸酯的摩尔加料比(约10％至约45％的伯胺基团被修饰)，GFP转染效率高于10％。不溶性将胆甾醇基修饰的BPEI-25聚合物P45和P46(比较)限制为约5％的伯胺基团的修饰。对于该修饰水平，P45和P46具有与未修饰的bPEI-25相似的最大N/P比和最大GFP转染效率。BuOCOCl修饰的bPEI-25(P47，43％的伯胺基团被修饰)还具有与未修饰的bPEI-25相当的最大N/P比和最大GFP转染效率。结果表示通过用环状碳酸酯修饰伯胺基团有利于最大N/P比和最大GFP转染效率，在约45％的修饰水平(1:25摩尔加料比)下TMC是尤其有利的(聚合物K)。

[0336] 对于所选的聚合物，在总体GFP转染效率更低时，在Hela细胞系中观察到相同的趋势(表7)。

[0337] 在SK-OV-3细胞系中看到修饰的bPEI-25聚合物和未修饰的bPEI-25之间的差别更小(表7)。在该实例中，未修饰的bPEI-25具有15的最大N/P比和70％的最大效率。聚合物K具有20的最大N/P比和75％的最大效率。聚合物O具有15的最大N/P比和78％的最大效率。

[0338] 结果表明与未修饰的bPEI-25相比，对于多种癌细胞系，聚合物K是更有效的并且是更低毒性的转染试剂。

[0339] 在人类间充质干细胞(hMSC)中的体外荧光素酶表达

[0340] PoieticsTM人类间充质干细胞(hMSC)购自Lonza，新加坡，并且在间充质干细胞基础培养基(MSCBM)(Lonza，新加坡)中培养，该基础培养基补充有间充质细胞生长添加剂(MCGS)、L-谷氨酰胺和GA-1000(MSCGMTMSingleQuotsTM，Lonza，新加坡)。将细胞在37℃下在5％CO2和95％潮湿空气的气氛下培养。当达到90％的融合时，用胰蛋白酶/EDTA培养基使其分裂。

[0341] 为了评估修饰的PEI-25聚合物/DNA的复合物在mHSC中的体外基因转染效率，将细胞以1×105个细胞/500微升/孔的密度接种在24孔板上。24小时之后，将平板培养基用新鲜的生长培养基替换，随后逐滴加入50微升的多种N/P比的复合物溶液(含1.75微克GFP质粒DNA或2.5微克荧光素酶质粒DNA)。在4小时孵育之后，将游离复合物通过替换各孔中的培养基而去除。在另外68小时孵育之后，将在各孔中的细胞培养基去除，并且将细胞用0.5mL磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)冲洗一次。将0.2mL报告溶解缓冲液加入各孔中。使在冷冻(-80℃，30分钟)和融化的两个循环后收集的细胞溶解产物通过14,000rpm离心5分钟而变得澄清，之后将20微升上清液与100微升荧光素酶底物混合，以使用照度计(Lumat LB9507，Berthold，德国)来测定相对发光单位(RLU)。针对使用BCA蛋白试验测定的上清液的蛋白浓度来归一化RLU读数以得到总体荧光素酶表达效率。在所有的体外基因表达实验中，未处理的细胞作为负对照，并且用未修饰的bPEI-25/DNA复合物处理的细胞作为正对照。数据表示为三次重复实验的平均值±标准偏差。

[0342] 图43为示出荧光素酶表达水平作为在人类间充质干细胞(hMSC)中的修饰的bPEI-25聚合物T、S、G、M、K和O的荧光素酶报告基因复合物的N/P比的函数的图。聚合物G(甘露糖修饰的bPEI-25)与聚合物K(TMC修饰的bPEI-25)和O(MTC-C2修饰的bPEI-25)相比在人类间介质干细胞中具有更大的荧光素酶表达水平，这是因为细胞过表达甘露糖受体。与其它组成相比，G在介导基因转染方面是最好的。

[0343] 使用标准MTT试验方案来研究聚合物/DNA复合物的细胞毒性。在转染前一天，将hMSC以10000个细胞/孔的密度接种在96孔板上。多种N/P比的聚合物/DNA是在水中制备的。各孔中的细胞随后与生长培养基在37℃下一起孵育4小时，该生长培养基包括10微升聚合物/DNA复合物和100微升新鲜的培养基。孵育之后，用新鲜的生长培养基替换该培养基并且再孵育68小时。随后，将100微升生长培养基和20微升MTT溶液(5mg/mL，在PBS中)加入各孔中，并且将细胞在37℃下孵育4小时。当移除生长培养基时，将各孔中形成的甲躜晶体用150微升DMSO溶解。使用微板分光光度计测量在550nm和690nm波长下的吸光度。相对细胞活力表示为[(A550-A690)样品/(A550-A690)对照]×100％。数据表示为每个N/P比至少八次重复实验的平均值±标准偏差。

[0344] 图44为示出T、S、G、M、K和O的荧光素酶复合物对人间充质干细胞(hMSC)的细胞毒性的图。G/DNA复合物对细胞没有显著的毒性。在N/P 40下，细胞活力高于75％。

[0345] 使用P45至P47的GFP转染效率和HepG2细胞活力

[0346] 根据上述一般程序以不同N/P比制备P45至P47的GFP报告基因复合物。图45为比较不同N/P比下这些复合物在HepG2细胞中的GFP转染效率的柱状图。氯甲酸丁酯修饰的bPEI-25具有最低的效率，约5％。在三种修饰的bPEI-25聚合物中胆甾醇氯甲酸酯修饰的bPEI-25具有最高的效率，约25％。Chol-MTC修饰的bPEI-25具有约15％的转染效率。以上结果显示在HepG2细胞中P45至P47与G(图30，约50％的效率)和K(图32，约65％的效率)相比具有低得多的GFP转染效率。

[0347] 图46为比较使用P45至P47的GFP复合物的HepG2细胞活力的柱状图。对于P45至P47，在N/P 30至N/P 50下，约70％的转染的HepG2细胞有活力。

[0348] 修饰的bPEI-25聚合物的抗微生物活性

[0349] 根据制造商的说明用Mueller Hinton肉汤II(MHB)粉末和酵母霉菌肉汤(YMB)粉末制备肉汤。金黄色葡萄球菌(S.aureus)(ATCC号6538)和大肠杆菌(E.coli)(ATCC号25922)获自ATCC(美国)，并根据所建议的方案重新培养。3-[4,5-二甲基噻唑基-2]-2,5-二苯基四唑溴盐(MTT)原样使用(used as received)。所有其它化学品为分析级，并且原样使用。

[0350] 用肉汤微稀释法测量修饰的bPEI-25聚合物的最小抑制浓度(MIC)。将修饰的bPEI-25聚合物溶解在DI水中，浓度为5000mg/L。用MHB或YMB将样品进一步稀释至7.8125、
15.625、31.25、62.5、125、250.0、500.0和1000.0mg/L。通过添加MHB或YMB将细菌溶液的光学密度调节至OD600nm＝0.07至0.08。进一步将该细菌溶液稀释1000倍。将阳离子化合物溶液(100微升)转移至96孔板(NUNC)的各孔中，随后加入100微升细菌溶液。MHB或YMB用作对照。
通过在预定时间测量OD600nm来监测细菌溶液的光学密度读数。对各个样品以重复六次的方式进行试验，并且将实验至少重复三次。表8列出所选的修饰的bPEI-25聚合物针对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC。

[0351] 表8

[0352]

[0353] 结果表明，修饰的bPEI-25聚合物G、S、T和K针对革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的抗微生物活性与未修饰bPEI-25相当。

[0354] 总结

[0355] 用碳酸酯-甘露糖/半乳糖/葡萄糖/疏水基团以不同加料摩尔比成功地修饰了未修饰的bPEI-25。由聚合物A、B、F、G、S、T、H、I、R、U、K和P所代表的使用环状碳酸酯单体的bPEI-25的伯胺基团的约9％至约47％的修饰有利于在HepG2细胞中修饰的bPEI-25聚合物的基因复合物的转染效率。具有大于47％的修饰的伯胺基团的聚合物C、L、M和N产生表面上具有低正电荷的大颗粒，并且具有较差的基因转染效率。在HepG2和HeLa细胞中修饰的bPEI-25聚合物的基因复合物的细胞毒性显著低于相应的未修饰的bPEI-25的复合物，并且在HepG2细胞中基因转染效率增加了高达两倍(50％对未修饰的bPEI-25的25％)。另外，甘露糖修饰的聚合物将Bcl-2siRNA有效地递送至HeLa细胞中，并且将Bcl-2mRNA下调至正常水平的四分之一而没有明显的细胞毒性。具有多种官能性的这类修饰的bPEI-25聚合物具有作为靶向治疗基因递送的载体(例如甘露糖针对角化细胞、巨噬细胞和树突状细胞；半乳糖靶向肝脏细胞)的很大潜力。

[0356] 值得注意的是，仅使用不带电的氨基甲酸酯修饰基团就改进了转染效率和细胞活力。另外，修饰的bPEI聚合物都不含季胺。

[0357] 修饰的支化聚乙烯亚胺聚合物还可以用作蛋白质和/或药物的递送载体。

[0358] 本文中所使用的术语是仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明。如本文所使用的，单数形式旨在同时包括复数形式，除非在内容中清楚地另外指示出来。应该理解，术语“包括(comprises)”和/或“包括(comprising)”，当在本说明书中使用时，规定所述特征、整数、步骤、操作、要素，和/或组分的存在，但是不排除一个或多个其它特征、整数、步骤、操作、元素组分，和/或其组合的存在或添加。当范围用于使用两个数值界限X和Y表示可能值(例如X ppm至Y ppm的浓度)时，除非另有说明，则该值可以为X、Y或X与Y之间的任何值。

[0359] 本发明的描述用于示例和描述的目的，但是不旨在以所公开的形式排除或限制本发明。在不背离本发明的范围情况下，许多修改和变体对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。选择和描述实施方案是为了最好地解释本发明的原理及其实际应用，以及为了使本领域其他普通技术人员能够理解本发明。