水凝胶前药

摘要

本发明涉及水凝胶的制备方法和可通过所述方法得到的水凝胶。本发明进一步涉及制备水凝胶‑间隔剂共轭物的方法，可通过所述方法得到的水凝胶‑间隔剂共轭物，制备连接载体的前药的方法和可通过所述方法得到的连接载体的前药，特别是用于药物从载体中可控或持续释放的连接载体的前药。另外，本发明涉及水凝胶在制备连接载体的前药中的用途。

权利要求

1.制备连接载体的前药的方法，其包括步骤：(a)提供包含以下组分的混合物：(a-i)至少一种骨架试剂，其中该至少一种骨架试剂具有1-100kDa的分子量，且包含至少3个胺(-NH2和/或-NH-)；

(a-ii)至少一种交联剂试剂，其中该至少一种交联剂试剂具有6-40kDa的分子量，其中该至少一种交联剂试剂包含：(i)至少2个羰氧基(–(C＝O)–O–或–O–(C＝O)–)，以及另外(ii)至少2个选自如下的活性官能端基：活性酯基团、活性氨基甲酸酯基团、活性碳酸酯基团和活性硫代碳酸酯基团，且为包含至少70％PEG的基于PEG的；和(a-iii)第一溶剂和至少第二溶剂，所述第二溶剂在第一溶剂中不溶混，其中该至少一种骨架试剂与该至少一种交联剂试剂的重量比为1:99-99:1；

(b)将步骤(a)的混合物在悬浮聚合中聚合成水凝胶；

(c)任选将水凝胶后处理；

(d)任选地，使步骤(b)或(c)的水凝胶与式(VI)的间隔剂试剂在溶剂的存在下反应以得到水凝胶-间隔剂共轭物：Ax1-S0-Ax2   (VI)，其中：

S0选自C1-50烷基、C2-50链烯基和C2-50炔基，所述链段任选被一个或多个选自如下的基团间隔：-NH-、-N(C1-4烷基)-、-O-、-S、-C(O)-、-C(O)NH、-C(O)N(C1-4烷基)-、-O-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、4-7元杂环基、苯基和萘基；

Ax1为与水凝胶的胺基团反应的官能团；且Ax2为官能团；和

(e)使步骤(b)或(c)的水凝胶或步骤(d)的水凝胶-间隔剂共轭物与式(VII)的前药连接剂-生物活性结构部分试剂在溶剂的存在下反应以得到连接载体的前药：Ay1-L-D   (VII)，其中：

Ay1为用于与步骤(b)或(c)的水凝胶的胺反应或者用于与步骤(d)的水凝胶-间隔剂共轭物的官能团Ax2反应的官能团；

L为前药连接剂；

D为生物活性结构部分。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)的混合物进一步包含清净剂。

3.根据权利要求2的方法，其中清净剂为Cithrol DPHS、Hypermer 70A、Hypermer B246、Hypermer 1599A、Hypermer 2296或Hypermer 1083。

4.根据权利要求1的方法，其中步骤(b)中的聚合通过加入碱而引发。

5.根据权利要求4的方法，其中碱选自N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TMEDA)、1,4-二甲基哌嗪、4-甲基吗啉、4-乙基吗啉、1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷、1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺、1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷、三[2-(二甲基氨基)乙基]胺、三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)、三甲胺、N,N-二甲基乙胺、N,N,N′,N′-四甲基-1,6-己二胺、N,N,N′,N″,N″-五甲基二亚乙基三胺、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯、1,5-二氮杂二环[4.3.0]壬-5-烯和六亚甲基四胺。

6.根据权利要求1或2的方法，其中步骤(a)的混合物为乳液。

7.根据权利要求1的方法，其中该至少一种骨架试剂选自：式(I)的化合物：

B(–(A0)x1–(SP)x2–A1–P–A2–Hyp1)x (I)，其中：

B为支化核心，

SP为选自如下的间隔基结构部分：C1-6烷基、C2-6链烯基和C2-6炔基，P为包含至少80％PEG的聚合物链，Hyp1为包含胺(-NH2和/或-NH-)的结构部分或者包含至少2个胺(-NH2和/或-NH-)的多胺，x为3-16的整数，

x1、x2相互独立地为0或1，条件是如果x2为0，则x1为0，A0、A1、A2相互独立地选自：其中R1和R1a相互独立地选自H和C1-6烷基；

式(II)的化合物：

Hyp2–A3–P–A4–Hyp3(II)其中：

P如上文式(I)的化合物中所定义，Hyp2、Hyp3相互独立地为包含至少两个胺(-NH2和/或-NH-)的多胺，且A3和A4独立地选自：

其中R1和R1a相互独立地选自H和C1-6烷基；

式(III)的化合物：

P1–A5–Hyp4   (III)其中：

P1为包含至少80％PEG的聚合物链，4

Hyp为包含至少3个胺(-NH2和/或-NH)的多胺，且A5选自：

其中R1和R1a相互独立地选自H和C1-6烷基；

和

式(IV)的化合物：

T1–A6–Hyp5   (IV)其中：

Hyp5为包含至少3个胺(-NH2和/或-NH)的多胺，且A6选自：

其中R1和R1a相互独立地选自H和C1-6烷基；且T1选自C1-50烷基、C2-50链烯基或C2-50炔基，所述链段任选被一个或多个选自如下的基团间隔：-NH-、-N(C1-4烷基)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)N(C1-4烷基)-、-O-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、4-7元杂环基、苯基或萘基。

8.根据权利要求7的方法，其中Hyp1、Hyp2、Hyp3、Hyp4和Hyp5选自：式(e-i)的结构部分：

其中：

p1为1-5的整数，且

如果骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示连接在A2上，如果骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示连接在A3或A4上，式(e-ii)的结构部分：

其中：

p2、p3和p4为相同或不同的且各自相互独立地为1-5的整数，且如果骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示连接在A2上，如果骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示连接在A3或A4上，如果骨架试剂具有式(III)的结构，则虚线表示连接在A5上，如果骨架试剂具有式(IV)的结构，则虚线表示连接在A6上；

式(e-iii)的结构部分：

其中：

p5-p11为相同或不同的且各自相互独立地为1-5的整数，且如果骨架试剂具有式(I)，则虚线表示连接在A2上，如果骨架试剂具有式(II)，则虚线表示连接在A3或A4上，如果骨架试剂具有式(III)，则虚线表示连接在A5上，如果骨架试剂具有式(IV)，则虚线表示连接在A6上；

式(e-iv)的结构部分：

其中：

p12-p26为相同或不同的且各自相互独立地为1-5的整数，且2

如果骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示连接在A 上，如果骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示连接在A3或A4上，如果骨架试剂具有式(III)的结构，则虚线表示连接在A5上，如果骨架试剂具有式(IV)的结构，则虚线表示连接在A6上；

式(e-v)的结构部分：

其中：

p27和p28为相同或不同的，且各自相互独立地为1-5的整数，q为1-8的整数，且

如果骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示连接在A2上，如果骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示连接在A3或A4上，如果骨架试剂具有式(III)的结构，则虚线表示连接在A5上，如果骨架试剂具有式(IV)的结构，则虚线表示连接在A6上；

式(e-vi)的结构部分：

其中：

p29和p30为相同或不同的且各自相互独立地为2-5的整数，且如果骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示连接在A2上，如果骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示连接在A3或A4上，如果骨架试剂具有式(III)的结构，则虚线表示连接在A5上，如果骨架试剂具有式(IV)的结构，则虚线表示连接在A6上；

式(e-vii)的结构部分：

其中：

p31-p36为相同或不同的且各自相互独立地为2-5的整数，且2

如果骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示连接在A 上，如果骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示连接在A3或A4上，如果骨架试剂具有式(III)的结构，则虚线表示连接在A5上，如果骨架试剂具有式(IV)的结构，则虚线表示连接在A6上；

式(e-viii)的结构部分：

其中：

p37-p50为相同或不同的且各自相互独立地为2-5的整数，且如果骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示连接在A2上，如果骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示连接在A3或A4上，如果骨架试剂具有式(III)的结构，则虚线表示连接在A5上，如果骨架试剂具有式(IV)的结构，则虚线表示连接在A6上；和式(e-ix)的结构部分：

其中：

p51-p80为相同或不同的且各自相互独立地为2-5的整数，且如果骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示连接在A2上，如果骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示连接在A3或A4上，如果骨架试剂具有式(III)的结构，则虚线表示连接在A5上，如果骨架试剂具有式(IV)的结构，则虚线表示连接在A6上；和其中结构部分(e-i)至(e-v)在各自的手性中心可以为R-或S-构型。

9.根据权利要求7或8的方法，其中骨架试剂为式(I)的化合物。

10.根据权利要求7的方法，其中支化核心B选自以下结构：其中虚线表示连接在A0上，或者如果x1和x2都为0，则为连接在A1上，t为1或2，

v为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14。

11.根据权利要求10的方法，其中B具有式(a-xiv)。

12.根据权利要求7或8的方法，其中A0为：

13.根据权利要求7或8的方法，其中x1和x2为0。

14.根据权利要求7或8的方法，其中P具有式(c-i)的结构：其中n为6-900。

15.根据权利要求7或8的方法，其中结构部分–A2–Hyp1为下式的结构部分：其中：

虚线表示连接在P上；且

E1选自式(e-i)至(e-ix)。

16.根据权利要求1的方法，其中骨架试剂具有下式：其中：

n为10-40。

17.根据权利要求16的方法，其中n为20-30。

18.根据权利要求1或2的方法，其中骨架试剂以其酸性盐的形式存在。

19.根据权利要求1或2的方法，其中交联剂试剂为式(V-II)的化合物：其中：

D1、D2、D3和D4为相同或不同的且各自相互独立地选自O、NR5、S和CR5R5a；

R1、R1a、R2、R2、R3、R3a、R4、R4a、R5和R5a为相同或不同的且各自相互独立地选自H和C1-6烷基；任选，一个或多个对R1/R1a、R2/R2a、R3/R3a、R4/R4a、R1/R2、R3/R4、R1a/R2a和R3a/R4a形成化学键或者与它们连接的原子一起连接以形成C3-8环烷基或以形成环A或者与它们连接的原子一起连接以形成4-7元杂环基或8-11元杂二环基或金刚烷基；

A选自苯基、萘基、茚基、茚满基和四氢化萘基；

P2为：

m为120-920；

r1、r2、r7、r8独立地为0或1；

r3、r6独立地为0、1、2、3或4；

r4、r5独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

s1、s2独立地为1、2、3、4、5或6；

Y1、Y2为相同或不同的且各自相互独立地选自式(f-i)至(f-vi)：其中：

虚线表示连接在分子其余部分上，

b为1、2、3或4，

XH为Cl、Br、I或F。

20.根据权利要求1或2的方法，其中交联剂试剂具有式(V-1)至(V-54)：其中：

如果适用的话，各交联剂试剂可以为其外消旋混合物的形式；且m为120-920；

Y1、Y2为相同或不同的且各自相互独立地选自式(f-i)至(f-vi)：其中：

虚线表示连接在分子其余部分上，

b为1、2、3或4，

XH为Cl、Br、J或F。

21.根据权利要求1的方法，其中由聚合得到的水凝胶为成型制品。

22.根据权利要求21的方法，其中水凝胶为具有1-500μm的直径的微粒珠粒的形式。

23.根据权利要求1的方法，其中Ax1选自活性羧酸；Cl-(C＝O)-；NHS-(C＝O)-，其中NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；ClSO2-；R1(C＝O)-；I-；Br-；Cl-；SCN-；和CN-，其中：

R1选自H、C1-6烷基、链烯基、C2-6炔基、C3-8环烷基、4-7元杂环基、8-11元杂二环基、苯基、萘基、茚基、茚满基和四氢化萘基。

24.根据权利要求1或23的方法，其中Ax2选自-马来酰亚胺、-SH、-NH2、-SeH、-N3、-C≡CH、-CR1＝CR1aR1b、-OH、-(CH＝X0)–R1、-(C＝O)–S–R1、-(C＝O)-H、-NH-NH2、-O-NH2、-Ar–X0、-Ar–Sn(R1)(R1a)(R1b)、-Ar–B(OH)(OH)，具有任选保护基团；

其中：

X0为-OH、-NR1R1a、-SH和-SeH，Ar选自苯基、萘基、茚基、茚满基和四氢化萘基，且

1 1a 1b

R、R 、R 相互独立地选自H、C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、C3-8环烷基、4-7元杂环基、

8-11元杂二环基、苯基、萘基、茚基、茚满基和四氢化萘基。

25.根据权利要求1的方法，其中Ax2/Ay1选自以下：其中：

X0为-OH、-NR1R1a、-SH和–SeH；

R1、R1a、R1b相互独立地选自H、C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、C3-8环烷基、4-7元杂环基、

8-11元杂二环基、苯基、萘基、茚基、茚满基和四氢化萘基；且Ar选自苯基、萘基、茚基、茚满基和四氢化萘基。

26.根据权利要求1的方法，其中Ax2为硫羟基，且Ay1具有式(VIIa)：T–PG0–S-(VIIa)，

其中：

T为H或标记结构部分；

PG0为硫活化结构部分；且

S为硫。

27.根据权利要求1的方法，其中D具有2-500kDa的分子量。

28.连接载体的前药，其可通过根据权利要求1的连接载体的前药的制备方法得到。

29.药物组合物，其包含权利要求28的连接载体的前药或其药物盐以及药物可接受赋形剂。

30.根据权利要求28的连接载体的前药或根据权利要求29的药物组合物，其用作药物。

说明书

水凝胶前药

发明领域

[0001] 本发明涉及制备水凝胶的方法和可通过所述方法得到的水凝胶。本发明进一步涉及制备水凝胶-间隔剂共轭物的方法，可通过所述方法得到的水凝胶-间隔剂共轭物，制备
连接载体的前药的方法和可通过所述方法得到的连接载体的前药，特别是提供药物从载体
中受控和/或持续释放的连接载体的前药。另外，本发明涉及水凝胶在制备连接载体的前药中的用途。

[0002] 发明背景

[0003] 常规水凝胶为能够吸收大量水的三维亲水或两亲聚合物网络。这些网络可包含各种聚合物且由于共价化学和/或物理交联，例如离子的、疏水的相互作用或缠结的存在而不溶。

[0004] 许多常规水凝胶在其应用方面严重受限。一些水凝胶用于药物应用，例如伤口缝合、组织工程或药物输送。用于组织密封的水凝胶例如公开于WO 2008/125655 A1中。

[0005] 另外，WO99/014259 A1公开了其中夹带药物分子的交联PEG水凝胶。

[0006] 夹带的药物分子从这类常规水凝胶中的释放取决于水凝胶的降解并可导致突然释放，暂时性导致太高的药物水平且难以预测药物释放。理想的是控制和/或维持药物从水凝胶中的释放。WO06/003014 A2和WO 2011/012715 A1描述了水凝胶作为连接载体的前药
中的载体，其中生物活性结构部分通过可逆前药连接剂共价连接在水凝胶上。这类连接水
凝胶的前药可控且以特定半衰期释放药物。

[0007] 然而，WO 2011/012715 A1中公开的水凝胶优选用于较小药物分子的受控且持续释放，且不能提供对较大药物分子如蛋白质药物的充分通路，因此导致这类水凝胶的低药
物负荷。

[0008] 发明详述

[0009] 水凝胶的制备方法和水凝胶

[0010] 因此，需要可用作适于较大药物分子可控且持续释放的连接载体的前药的载体的水凝胶。

[0011] 因此，本发明的目的是克服至少一些上述缺点并提供可用作适于较大药物分子受控和/或持续释放的连接载体的前药的载体。

[0012] 一方面，本发明涉及制备水凝胶的方法，所述方法包括步骤：

[0013] (a)提供包含以下组分的混合物：

[0014] (a-i)至少一种骨架试剂，其中至少一种骨架试剂具有1-100kDa的分子量，且包含至少3个胺(-NH2和/或-NH-)；

[0015] (a-ii)至少一种交联剂试剂，其中该至少一种交联剂试剂具有6-40kDa的分子量，其中至少一种交联剂试剂包含：

[0016] (i)至少2个羰氧基(–(C＝O)–O–或–O–(C＝O)–)，以及另外

[0017] (ii)至少2个选自如下的活性官能端基：活性酯基团、活性氨基甲酸酯基团、活性碳酸酯基团和活性硫代碳酸酯基团，

[0018] 且为包含至少70％PEG的基于PEG的；和

[0019] (a-iii)第一溶剂和至少第二溶剂，所述第二溶剂在第一溶剂中不溶混，

[0020] 其中该至少一种骨架试剂与该至少一种交联剂试剂的重量比为1:99-99:1；和

[0021] (b)将步骤(a)的混合物在悬浮聚合中聚合成水凝胶。

[0022] 一般而言，已知交联剂的设计影响水凝胶的孔径大小，但预期交联剂越长，它们越可能形成会阻碍通向水凝胶内部空间的通路的次级结构。该阻碍会防止较大的蛋白质药物进入水凝胶的内部空间且该药物分子的附着会主要限于表面和接近水凝胶表面的区域上。
现在惊讶地发现尽管这些预期的限制，大的药物，如蛋白质，能够以使这些水凝胶适用作前药载体的量进入本发明水凝胶中。

[0023] 在本发明内，术语以如下含义使用。

[0024] 如本文所用，术语“水凝胶”意指由由于共价化学交联的存在而不溶的均聚物或共聚物组成的亲水或两亲聚合物网络。交联提供网络结构和物理完整性。水凝胶显示出与水的热力学相容性，这容许它们在水性介质中溶胀。

[0025] 如本文所用术语“试剂”意指包含至少一个与其它试剂或结构部分的官能团反应的官能团的化合物。

[0026] 如本文所用术语“骨架试剂”意指适用作形成水凝胶的原料的试剂。如本文所用，骨架试剂优选不包含可生物降解键。骨架试剂可包含“支化芯”，其指多于一个其它结构部分连接在其上的原子或结构部分。

[0027] 如本文所用术语“交联剂试剂”意指适用作将骨架试剂交联的原料的线性或支化试剂。优选，交联剂试剂为线性化合物。交联剂试剂包含至少2个可生物降解键。

[0028] 如本文所用术语“结构部分”意指与相应试剂相比缺乏一个或多个原子的分子部分。如果例如式“H-X-H”的试剂与另一试剂反应且变成反应产物的一部分，则反应产物的相应结构部分具有结构“H–X–“或“–X–”，而各个“–”表示在另一结构部分上。因此，生物活性结构部分作为药物从前药中释放出来。

[0029] 因此，短语“以结合形式”用于指试剂的相应结构部分，即“以结合形式的赖氨酸”指缺乏赖氨酸试剂的一个或多个原子且为分子的一部分的赖氨酸结构部分。

[0030] 如本文所用术语“官能团”意指可与其它官能团反应的原子基团。官能团包括但不限于以下基团：羧酸(-(C＝O)OH)、伯或仲胺(-NH2、–NH–)、马来酰亚胺、硫羟(-SH)、磺酸(-(O＝S＝O)OH)、碳酸酯、氨基甲酸酯(-O(C＝O)N<)、羟基(-OH)、醛(-(C＝O)H)、酮(-(C＝O)–)、肼(>N-N<)、异氰酸酯、异硫氰酸酯、磷酸(-O(P＝O)OHOH)、膦酸(-O(P＝O)OHH)、卤代乙酰基、烷基卤、丙烯酰基、芳基氟、羟胺、二硫化物、乙烯基砜、乙烯基酮、重氮烷、氧杂环丙烷和氮杂环丙烷。

[0031] 如本文所用术语“活性官能团”意指与活化基团连接的官能团，即官能团与活化试剂反应。优选的活性官能团包括但不限于活性酯基团、活性氨基甲酸酯基团、活性碳酸酯基团和活性硫代碳酸酯基团。优选的活化基团选自式((f-i)至(f-vi)：

[0032]

[0033] 其中：

[0034] 虚线表示连接在分子其余部分上；

[0035] b为1、2、3或4；且

[0036] XH为Cl、Br、I或F。

[0037] 因此，优选的活性酯具有式：

[0038] -(C＝O)-XF

[0039] 其中：

[0040] XF选自式(f-i)、(f-ii)、(f-iii)、(f-iv)、(f-v)和(f-vi)。

[0041] 因此，优选的活性氨基甲酸酯具有式：

[0042] -N-(C＝O)-XF

[0043] 其中：

[0044] XF选自式(f-i)、(f-ii)、(f-iii)、(f-iv)、(f-v)和(f-vi)。

[0045] 因此，优选的活性碳酸酯具有式：

[0046] -O-(C＝O)-XF

[0047] 其中：

[0048] XF选自式(f-i)、(f-ii)、(f-iii)、(f-iv)、(f-v)和(f-vi)。

[0049] 因此，优选的活性硫酯具有式：

[0050] -S-(C＝O)-XF，

[0051] 其中：

[0052] XF选自式(f-i)、(f-ii)、(f-iii)、(f-iv)、(f-v)和(f-vi)。

[0053] 因此，“活性末端官能团”为位于结构部分或分子的末端的活性官能团，即为末端活性官能团。

[0054] 如本文所用术语“封端基团”意指不可逆，即永久地与官能团连接以使它不能与其它试剂或结构部分的官能团反应的结构部分。

[0055] 如本文所用术语“保护基团”意指可逆地与官能团连接以使它不能与例如另一官能团反应的结构部分。合适的醇(-OH)保护基团为例如乙酰基、苯甲酰基、苄基、β-甲氧基乙氧基甲醚、二甲氧基三苯甲基、甲氧基甲醚、甲氧基三苯甲基、对-甲氧基苄基醚、甲硫基甲醚、新戊酰基、四氢吡喃基、三苯甲基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、三-异丙基甲硅烷氧基甲基、三异丙基甲硅烷基醚、甲基醚和乙氧基乙醚。合适的胺保护基团为例如苯甲氧甲酰基、对-甲氧基苄基羰基、叔丁氧基羰基、9-芴基甲基氧基羰基、乙酰基、苯甲酰基、苄基、氨基甲酸酯、对-甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、对-甲氧基苯基和甲苯磺酰基。合适的羰基保护基团为例如缩醛和缩酮、缩羰酯(acylal)和二噻烷。合适的羧酸保护基团为例
如甲基酯、苄基酯、叔丁基酯、2,6-二甲基苯酚、2,6-二异丙基苯酚、2,6-二-叔丁基苯酚、甲硅烷基酯、原酸酯和 唑啉。合适的磷酸酯保护基团为例如2-氰基乙基和甲基。

[0056] 如本文所用术语“后处理”指将化学反应，特别是聚合的产物分离和提纯所需的一系列操作。

[0057] 如本文所用术语“聚合物”意指包含通过化学键以线性、环形、支化、交联或树枝状方式或其组合连接的重复结构单元(即单体)的分子，其可以为合成或生物来源或者二者的组合。应当理解聚合物可例如还包含官能团或封端结构部分。优选，聚合物具有至少0.5kDa的分子量，例如至少1kDa的分子量、至少2kDa的分子量、至少3kDa的分子量或至少5kDa的分子量。

[0058] 如本文所用术语“聚合的”意指包含一种或多种聚合物的试剂或结构部分。

[0059] 本领域技术人员应当理解由聚合反应得到的聚合产物不都具有相同的分子量，而是显示出分子量分布。因此，如本文所用聚合物中的分子量范围、分子量和单体数目范围和聚合物中的单体数目指数均分子量和单体的数量平均值。如本文所用术语“数均分子量”意指单独聚合物的分子量的普通算术平均值。

[0060] 如本文所用术语“聚合”意指使单体或大单体试剂在化学反应中反应以形成聚合物链或网络(包括但不限于水凝胶)的过程。

[0061] 如本文所用术语“大单体”意指由单体试剂聚合而得到的分子。

[0062] 如本文所用术语“缩聚”或“缩合反应”意指化学反应，其中两种试剂的官能团反应形成一个单一分子，即反应产物，并释放低分子量分子如水。

[0063] 如本文所用术语“悬浮聚合”意指非均相和/或双相聚合反应，其中单体试剂溶于第一溶剂中，形成分散相，将分散相在第二溶剂中乳化，形成连续相。在本发明中，单体试剂为至少一种骨架试剂和至少一种交联剂试剂。第一溶剂和单体试剂都不溶于第二溶剂中。
TM
该乳液通过搅拌、摇动、暴露于超声波或Microsieve 乳化下，更优选通过搅拌或
MicrosieveTM乳化，更优选通过搅拌而形成。该乳液通过合适的乳化剂稳定。聚合通过加入可溶于第一溶剂中的碱作为引发剂而引发。适用作引发剂的合适的通常已知的碱可以为叔
碱，例如四甲基乙二胺(TMEDA)。

[0064] 如本文所用术语“不溶混”其中两种物质不能结合形成均匀混合物的性能。

[0065] 如本文所用术语“多胺”意指包含多于一个胺(-NH-和/或-NH2)，例如2-64个胺、4-48个胺、6-32个胺、8-24个胺或10-16个胺的试剂或结构部分。特别优选的多胺包含2-32个胺。

[0066] 如本文所用，关于结构部分或试剂的术语“包含至少X％PEG的基于PEG的”意指所述结构部分或试剂包含至少X％(w/w)个乙二醇单元(-CH2CH2O–)，其中乙二醇单元可嵌段、交替排列或者可随机分布于结构部分或试剂内，优选所述结构部分或试剂的所有乙二醇单
元都以一个嵌段存在；基于PEG的结构部分或试剂的其余重量％为其它结构部分，尤其选自以下取代基和键的其它结构部分：

[0067] ●C1-50烷基、C2-50链烯基、C2-50炔基、C3-10环烷基、4-7元杂环基、8-11元杂二环基、苯基；萘基；茚基(indenyl)；茚满基(indanyl)；和四氢化萘基(tetralinyl)；

[0068] ●选自如下的键：

[0069]

[0070] 其中：

[0071] 虚线表示连接在结构部分或试剂的其余部分上，且

[0072] R1和R1a相互独立地选自H和C1-6烷基。

[0073] 如本文所用术语“C1-4烷基”单独或组合地意指具有1-4个碳原子的直链或支化烷基。如果存在于分子的末端，则直链和支化C1-4烷基的实例为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。当分子的两个结构部分通过C1-4烷基连接时，则这类C1-4烷基的实例为-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-、-C(CH3)2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-和-CH2-CH2-CH2(CH3)-。C1-4烷基的各个氢原子可被如下文所定义的取代基替代。

[0074] 如本文所用术语“C1-6烷基”单独或组合地意指具有1-6个碳原子的直链或支化烷基。如果存在于分子的末端，则直链和支化C1-6烷基的实例为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、
3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基和3,3-二甲基丙基。当分子的两个结构部分通过C1-6烷基连接时，则这类C1-6烷基的实例为-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-和-C(CH3)2-。C1-6烷基的各个氢原子可被如下文所定义的取代基替代。

[0075] 因此，如本文所用术语“C1-20烷基”单独或组合地意指具有1-20个碳原子的直链或支化烷基。术语“C8-18烷基”单独或组合地意指具有8-18个碳原子的直链或支化烷基。因此，如本文所用术语“C1-50烷基”单独或组合地意指具有1-50个碳原子的直链或支化烷基。C1-20烷基、C8-18烷基和C1-50烷基的各个氢原子可被取代基替代。在每种情况下，烷基可存在于分子的末端或者分子的两个结构部分可通过烷基连接。

[0076] 如本文所用术语“C2-6链烯基”单独或组合地意指包含至少一个碳-碳双键且具有2-6个碳原子的直链或支化烃结构部分。如果存在于分子的末端，则实例为-CH＝CH2、-CH＝CH-CH3、-CH2-CH＝CH2、-CH＝CHCH2-CH3和-CH＝CH-CH＝CH2。当分子的两个结构部分通过C2-6链烯基连接时，则这类C2-6链烯基的实例为-CH＝CH-。C2-6链烯基的各个氢原子可被如下文所定义的取代基替代。任选，可存在一个或多个三键。

[0077] 因此，如本文所用术语“C2-20链烯基”单独或组合地意指包含至少一个碳-碳双键且具有2-20个碳原子的直链或支化烃残基。术语“C2-50链烯基”单独或组合地意指包含至少一个碳-碳双键且具有2-50个碳原子的直链或支化烃残基。如果存在于分子的末端，则实例为-CH＝CH2、-CH＝CH-CH3、-CH2-CH＝CH2、-CH＝CHCH2-CH3和-CH＝CH-CH＝CH2。当分子的两个结构部分通过链烯基连接，则实例为例如-CH＝CH-。C2-20链烯基或C2-50链烯基的各个氢原子可被如下文所定义的取代基替代。任选，可存在一个或多个三键。

[0078] 如本文所用术语“C2-6炔基”单独或组合地意指包含至少一个碳-碳三键且具有2-6个碳原子的直链或支化烃残基。如果存在于分子的末端，则实例为-C≡CH、-CH2-C≡CH、CH2-CH2-C≡CH和CH2-C≡C-CH3。当分子的两个结构部分通过炔基连接，则实例为-C≡C-。C2-6炔基的各个氢原子可被如下文所定义的取代基替代。任选，可存在一个或多个双键。

[0079] 因此，如本文所用术语“C2-20炔基”单独或组合地意指包含至少一个碳-碳三键且具有2-20个碳原子的直链或支化烃残基，“C2-50炔基”单独或组合地意指包含至少一个碳-碳三键且具有2-50个碳原子的直链或支化烃残基。如果存在于分子的末端，则实例为-C≡CH、-CH2-C≡CH、CH2-CH2-C≡CH和CH2-C≡C-CH3。当分子的两个结构部分通过炔基连接，则实例为-C≡C-。C2-20炔基或C2-50炔基的各个氢原子可被如下文所定义的取代基替代。任选，可存在一个或多个双键。

[0080] 如本文所用术语“C3-8环烷基”或“C3-8环烷基环”意指具有3-8个碳原子的环烷基链，其可以为饱和或不饱和的，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、环庚基、环辛基。环烷基碳的各个氢原子可被如下文所定义的取代基替代。术语“C3-8环烷基”或“C3-8环烷基环”还包括桥联二环，如降冰片烷(norbonane)或降冰片烯(norbonene)。因此，“C3-5环烷基”意指具有3-5个碳原子的环烷基，“C3-10环烷基”意指具有3-10个碳原子的环烷基。

[0081] 因此，如本文所用术语“C3-10环烷基”意指具有3-10个碳原子的碳环体系，其可以为饱和或不饱和的，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基。术语“C3-10环烷基”还包括至少部分饱和的碳单环和二环。

[0082] 如本文所用术语“卤素”意指氟、氯、溴或碘。特别优选氟或氯。

[0083] 如本文所用术语“4-7元杂环基”或“4-7元杂环”意指具有4、5、6或7个环原子且可包含至多最大数目的双键的环(完全饱和、部分饱和或不饱和的芳族或非芳族环)，其中至少一个环原子至4个环原子被选自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-)、氧和氮(包括＝N(O)-)的杂原子替代，且其中环借助碳或氮原子连接在分子的其余部分上。4-7元杂环的实例包括但不限于氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、噻丁环、呋喃、噻吩、吡咯、吡咯啉、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、唑、 唑啉、异 唑、异 唑啉、噻唑、噻唑啉、异噻唑、异噻唑啉、噻二唑、噻二唑啉、
四氢呋喃、四氢噻吩、吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、 唑烷、异 唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、噻二唑烷、环丁砜、吡喃、二氢吡喃、四氢吡喃、咪唑烷、吡啶、哒嗪、吡嗪、嘧啶、哌嗪、哌啶、吗啉、四唑、三唑、三唑烷、四唑烷、二氮杂环庚烷(diazepane)、氮杂 (azepine)和高哌嗪
(homopiperazine)。4-7元杂环基或4-7元杂环基的各个氢原子可被如下文所定义的取代基
替代。

[0084] 如本文所用术语“8-11元杂二环基”或“8-11元杂二环”意指两个具有8-11个环原子的环的杂环体系，其中至少一个环原子被两个环分享且可包含至多最大数目的双键(完全饱和、部分饱和或不饱和的芳族或非芳族环)，其中至少一个环原子至多6个环原子被选
自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-)、氧和氮(包括＝N(O)-)的杂原子替代，且其中环借助碳或氮原子连接在分子的其余部分上。8-11元杂二环的实例为吲哚、吲哚啉(indoline)、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并 唑、苯并异 唑、苯并噻唑、苯并异噻唑、苯并咪唑、苯并咪唑啉、喹啉、喹唑啉、二氢喹唑啉、喹啉、二氢喹啉、四氢喹啉、十氢喹啉、异喹啉、十氢异喹啉、四氢异喹啉、二氢异喹啉、苯并氮杂 (benzazepine)、嘌呤和蝶啶。术语8-11元杂二环还包括两个环的螺环结构，如1,4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷或桥联杂环如8-氮杂-二环[3.2.1]辛烷。
8-11元杂二环基或8-11元杂二环碳的各个氢原子可被如下文所定义的取代基替代。

[0085] 术语“经取代的”意指分子或结构部分的一个或多个–H原子被称为“取代基”的不同原子或原子基团替代。合适的取代基选自卤素；CN；COOR9；OR9；C(O)R9；C(O)N(R9R9a)；S(O)2N(R9R9a)；S(O)N(R9R9a)；S(O)2R9；S(O)R9；N(R9)S(O)2N(R9aR9b)；SR9；N(R9R9a)；NO2；OC(O)R9；N(R9)C(O)R9a；N(R9)S(O)2R9a；N(R9)S(O)R9a；N(R9)C(O)OR9a；N(R9)C(O)N(R9aR9b)；OC(O)N9 9a
(RR )；T；C1-50烷基；C2-50链烯基；或C2-50炔基，其中T；C1-50烷基；C2-50链烯基；和C2-50炔基任选被一个或多个相同或不同的R10取代，且其中C1-50烷基；C2-50链烯基；和C2-50炔基任选被一个或多个选自如下的基团间隔：T、-C(O)O-；-O-；-C(O)-；-C(O)N(R11)-；-S(O)2N(R11)-；-S(O)N(R11)-；-S(O)2-；-S(O)-；-N(R11)S(O)2N(R11a)-；-S-；-N(R11)-；-OC(O)R11；-N(R11)C
11 11 11 11 11a
(O)-；-N(R )S(O)2-；-N(R )S(O)-；-N(R )C(O)O-；-N(R )C(O)N(R )-；和-OC(O)N
(R11R11a)；

[0086] 其中：

[0087] R9、R9a、R9b独立地选自H；T；和C1-50烷基；C2-50链烯基；或C2-50炔基，其中T；C1-50烷基；C2-50链烯基；和C2-50炔基任选被一个或多个相同或不同的R10取代，且其中C1-50烷基；C2-50链烯基；和C2-50炔基任选被一个或多个选自如下的基团间隔：T、-C(O)O-；-O-；-C(O)-；-C(O)N(R11)-；-S(O)2N(R11)-；-S(O)N(R11)-；-S(O)2-；-S(O)-；-N(R11)S(O)2N(R11a)-；-S-；-N(R11)-；-OC(O)R11；-N(R11)C(O)-；-N(R11)S(O)2-；-N(R11)S(O)-；-N(R11)C(O)O-；-N(R11)C(O)N(R11a)-；和-OC(O)N(R11R11a)；

[0088] T选自苯基；萘基；茚基；茚满基；四氢化萘基；C3-10环烷基；4-7元杂环基；或8-11元杂二环基，其中T任选被一个或多个相同或不同的R10取代；

[0089] R10为卤素；CN；氧(＝O)；COOR12；OR12；C(O)R12；C(O)N(R12R12a)；S(O)2N(R12R12a)；S(O)N(R12R12a)；S(O)2R12；S(O)R12；N(R12)S(O)2N(R12aR12b)；SR12；N(R12R12a)；NO2；OC(O)R12；N(R12)C(O)R12a；N(R12)S(O)2R12a；N(R12)S(O)R12a；N(R12)C(O)OR12a；N(R12)C(O)N(R12aR12b)；OC(O)N(R12R12a)；或C1-6烷基，其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；

[0090] R11、R11a、R12、R12a、R12b独立地选自H；或C1-6烷基，其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代。

[0091] 在一个实施方案中，R9、R9a、R9b可相互独立地为H。

[0092] 在一个实施方案中，R10为C1-6烷基。

[0093] 在一个实施方案中，T为苯基。

[0094] 优选，分子的最多6个–H原子独立地被取代基替代，例如5个–H原子独立地被取代基替代，4个–H原子独立地被取代基替代，3个–H原子独立地被取代基替代，2个–H原子独立地被取代基替代，或者1个–H原子被取代基替代。

[0095] 如本文所用术语“间隔”意指在两个碳原子之间或者在各碳原子与氢原子之间的碳链的末端插入一个或多个原子。

[0096] 如本文所用术语“前药”意指在显示出其药理效果以前经受生物转化的化合物。因此，前药可视为与专门无毒保护基团连接的生物活性结构部分，所述保护基团以短效方式使用以改变或消除母体分子中的不理想性能。这可包括增强药物中的理想性能和抑制不理
想性能。

[0097] 如本文所用术语“连接载体的前药”意指包含生物活性结构部分与短效载体基团的临时连接的前药，所述载体基团产生改进的物理化学或药物动力学性能并可在体内，通
常通过水解分裂而容易地除去。

[0098] 如本文所用术语“可逆的前药连接剂结构部分”意指在其一端通过可逆键连接在生物活性结构部分D上且在另一端通过永久性键连接的结构部分，在本发明中，其通过骨架x2 y1
结构部分的胺官能团或A 与A 反应而形成，由此将生物活性结构部分与本发明连接载体
的前药中的水凝胶载体连接。“可逆连接”为在生理条件(pH7.4的水性缓冲剂，37℃)下以1小时至12个月的半衰期可非酶催化水解降解，即可分裂的键。

[0099] 相反，“永久性连接”在生理条件(pH7.4的含水缓冲剂，37℃)下以多于12个月的半衰期可非酶催化水解降解。

[0100] “可生物降解键”为在生理条件(pH7.4的含水缓冲剂，37℃)下以1小时至12个月的半衰期可酶催化和/或非酶催化水解降解，即可分裂的键。优选，可生物降解键也可在生理条件下非酶催化水解降解。

[0101] 如本文所用术语“无痕前药连接剂”意指在分裂时释放自由形式的药物的可逆前药连接剂。如本文所用术语药物的“自由形式”意指未改性药理活性形式的药物。

[0102] 如本文所用术语“肽”意指通过肽键连接的氨基酸单体的短聚合物。术语“多肽”意指包含至多且包括50个氨基酸单体的肽。术语“蛋白质”意指具有多于50个氨基酸单体的肽。

[0103] 如本文所用术语“低聚核苷酸”意指具有至多100个碱的短核酸聚合物。

[0104] 如本文所用术语“药物组合物”意指一种或多种活性成分和一种或多种惰性成分以及直接或间接地由任何两种或更多种成分的组合、配合或聚集，或者由一种或多种成分
的离解，或者由一种或多种成分的其它类型的反应或相互作用产生的任何产物。因此，本发明药物组合物包括通过将本发明连接载体的前药和一种或多种药物可接受赋形剂混合而
制备的任何组合物。

[0105] 如本文所用术语“赋形剂”指借此给药治疗剂的稀释剂、辅助剂或媒介。这类药物赋形剂可以为无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，包括但不限于花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物口服给药时，水是优选的赋形剂。当药物组合物静脉内给药时，盐水和含水葡萄糖是优选的赋形剂。盐水溶液和含水葡萄糖和甘油溶液优选用作可注射液的液体赋形剂。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、海藻糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要的话，药物组合物还可包含次要量的润湿或乳化剂，pH缓冲剂，例如乙酸盐、琥珀酸盐、TRIS、碳酸盐、磷酸盐、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)、MES(2-(N-吗啉)乙烷磺酸)，或者可包含清净剂，如Tween、泊洛沙姆(poloxamers)、泊洛沙胺(poloxamines)、CHAPS、Igepal，或者氨基酸如甘氨酸、赖氨酸或组氨酸。这些药物组合物可采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放的配制剂等的形式。药物组合物可用传统的粘合剂和赋形剂如甘油三酯配制成栓剂。口服配制剂
可包含标准赋形剂，例如药物级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适药物赋形剂的实例由E.W.Martin描述于“Remington's Pharmaceutical 
Sciences”中。该组合物包含治疗有效量的药物或生物活性结构部分以及适量赋形剂以提
供用于正确给药于病人的形式。配制剂应适合给药模式。

[0106] 一般而言，术语“包含”或“包括”还包括“由…组成”。

[0107] 可用作工艺步骤(a)中的原料的一些骨架和交联剂试剂是市售的。另外，骨架和交联剂试剂可根据实施例部分描述的方法制备。合适骨架试剂的合成方法描述于WO2011/
012715A1的实施例1中，通过引用将其并入本文中。WO2011/012715A1的实施例2进一步提供合成具有较低分子量的交联剂试剂的方法，所述方法可使用标准化学知识修改以得到适于
本发明的交联剂试剂。基于这些方法，本领域技术人员能够应用标准化学知识以得到用于
本发明中的骨架和交联剂试剂。

[0108] 步骤(a)的混合物包含第一溶剂和至少第二溶剂。所述第一溶剂优选选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺、乙腈、二甲亚砜、碳酸亚丙酯、N-甲基吡咯烷酮、甲醇、乙醇、异丙醇和水及其混合物。

[0109] 将至少一种骨架试剂和至少一种交联剂试剂溶于第一溶剂中，即悬浮聚合的分散相。在一个实施方案中，将骨架试剂和交联剂试剂分开地溶解，即在不同的容器中，使用相同或不同的溶剂，优选对于两种试剂使用相同的溶剂溶解。在另一实施方案中，将骨架试剂和交联剂试剂一起溶解，即在相同的容器中并使用相同的溶剂溶解。

[0110] 用于骨架试剂的合适溶剂为有机溶剂。优选，溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺、乙腈、二甲亚砜、碳酸亚丙酯、N-甲基吡咯烷酮、甲醇、乙醇、异丙醇和水及其混合物。更优选，将骨架试剂溶于选自乙腈、二甲亚砜、甲醇或其混合物的溶剂中。最优选，将骨架试剂溶于二甲亚砜中。

[0111] 在一个实施方案中，将骨架试剂以1-300mg/ml，更优选5-60mg/ml，最优选10-40mg/ml的浓度溶于溶剂中。

[0112] 用于交联剂试剂的合适溶剂为有机溶剂。优选，溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺、乙腈、二甲亚砜、碳酸亚丙酯、N-甲基吡咯烷酮、甲醇、乙醇、异丙醇、水或其混合物。更优选，将交联剂试剂溶于选自二甲基甲酰胺、乙腈、二甲亚砜、甲醇或其混合物的溶剂中。最优选将交联剂试剂溶于二甲亚砜中。

[0113] 在一个实施方案中，将交联剂试剂以5-500mg/ml，更优选25-300mg/ml，最优选50-200mg/ml的浓度溶于溶剂中。

[0114] 该至少一种骨架试剂和该至少一种交联剂试剂以1:99-99:1的重量比，例如2:98-90:10的比、3:97-88:12的重量比、3:96-85:15的重量比、2:98-90:10的重量比和5:95-80:
20的重量比，特别优选以5:95-80:20的重量比混合，其中第一个数字涉及骨架试剂，且第二个数字涉及交联剂试剂。

[0115] 优选地，选择该比使得步骤(a)的混合物包含与交联剂试剂的活性官能端基相比摩尔过量的来自骨架试剂的胺基团。因此，由本发明方法产生的水凝胶具有游离胺基团，所述游离胺基团可用于将其它结构部分结合在水凝胶上，例如间隔剂、亲和性配体、螯合剂
和/或可逆前药连接剂结构部分。

[0116] 该至少一种第二溶剂，即悬浮聚合的连续相，优选为有机溶剂，更优选选自如下的有机溶剂：线性、支化或环状C5-30烷烃；线性、支化或环状C5-30烯烃；线性、支化或环状C5-30炔烃；线性或环状聚(二甲基硅氧烷)；芳族C6-20烃；及其混合物。甚至更优选，该至少第二溶剂选自线性、支化或环状C5-16烷烃；甲苯；二甲苯；三甲苯；六甲基二硅氧烷；或其混合物。最优选，该至少第二溶剂选自线性C7-11烷烃，例如庚烷、辛烷、壬烷、癸烷和十一烷。

[0117] 优选，步骤(a)的混合物进一步包含清净剂。优选的清净剂为Cithrol DPHS、Hypermer 70A、Hypermer B246、Hypermer 1599A、Hypermer 2296或Hypermer 1083。最优选Cithrol DPHS。

[0118] 优选，清净剂具有0.1g-100g/1L总混合物(即分散相和连续相一起)的浓度。更优选，清净剂具有0.5g-10g/1L总混合物的浓度，最优选，清净剂具有0.5g-5g/1L总混合物的浓度。

[0119] 优选步骤(a)的混合物为乳液。

[0120] 步骤(b)的聚合通过加入碱而引发。优选碱为可溶于烷烃中的非亲核碱，更优选碱选自N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TMEDA)、1,4-二甲基哌嗪、4-甲基吗啉、4-乙基吗啉、1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷、1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺、1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮
杂环壬烷、三[2-(二甲基氨基)乙基]胺、三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)、三甲胺、N,N-二甲基乙胺、N,N,N′,N′-四甲基-1,6-己二胺、N,N,N′,N″,N″-五甲基二亚乙基三胺、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯、1,5-二氮杂二环[4.3.0]壬-5-烯和六亚甲基四胺。甚至更优选
碱选自TMEDA、1,4-二甲基哌嗪、4-甲基吗啉、4-乙基吗啉、1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷、1,
1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺、1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷、三[2-(二甲基氨基)乙基]胺、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯、1,5-二氮杂二环[4.3.0]壬-5-烯和六
亚甲基四胺。最优选碱为TMEDA。

[0121] 碱以混合物中的每活性官能端基1-500当量的量，优选5-50当量的量，更优选5-25当量的量，最优选10当量的量加入步骤(a)的混合物中。

[0122] 在工艺步骤(b)中，本发明水凝胶的聚合为缩合反应，其优选在将步骤(a)的混合物连续搅拌下进行。优选梢速(梢速＝π×搅拌器转速×搅拌器直径)为0.2-10米/秒(m/s)，
更优选0.5-4m/s，最优选1-2m/s。

[0123] 在步骤(b)的一个优选实施方案中，聚合反应在装配有档板的圆柱形容器中进行。容器的直径:高度比可以为4:1-1:2，更优选容器的直径:高度比为2:1-1:1。

[0124] 优选，反应容器装配有选自如下的轴流式搅拌器：斜桨式搅拌器(pitched blade stirrer)、船用螺旋桨(marine type propeller)或Lightnin A-310。更优选，搅拌器为斜桨式搅拌器。

[0125] 步骤(b)可在宽温度范围内进行，优选在-10℃至100℃的温度下，更优选在0℃至80℃的温度下，甚至更优选在10℃至50℃的温度下，最优选在环境温度下进行。“环境温度”指存在于典型实验室环境中的温度，优选意指17-25℃的温度。

[0126] 优选由聚合得到的水凝胶为成型制品，例如涂层、网、支架、纳米颗粒或微粒。更优选，水凝胶为具有1-500μm的直径，更优选具有10-300μm的直径，甚至更优选具有20-150μm的直径，最优选具有30-130μm的直径的微粒珠粒的形式。上述直径在水凝胶微粒完全在水中水化时测量。

[0127] 在一个实施方案中，制备本发明水凝胶的方法进一步包括步骤：

[0128] (c)将水凝胶后处理。

[0129] 步骤(c)包括以下步骤中的一个或多个：

[0130] (c1)从聚合反应中除去过量液体，

[0131] (c2)将水凝胶洗涤以除去聚合期间使用的溶剂，

[0132] (c3)将水凝胶转移至缓冲剂溶液中，

[0133] (c4)将水凝胶尺寸分级/筛分，

[0134] (c5)将水凝胶转移至容器中，

[0135] (c6)将水凝胶干燥，

[0136] (c7)将水凝胶转移至适于消毒的特殊溶剂中，和

[0137] (c8)将水凝胶消毒，优选通过γ射线消毒。

[0138] 优选，步骤(c)包括所有以下步骤：

[0139] (c1)从聚合反应中除去过量液体，

[0140] (c2)将水凝胶洗涤以除去聚合期间使用的溶剂，

[0141] (c3)将水凝胶转移至缓冲剂溶液中，

[0142] (c4)将水凝胶尺寸分级/筛分，

[0143] (c5)将水凝胶转移至容器中，

[0144] (c7)将水凝胶转移至适于消毒的特殊溶剂中，和

[0145] (c8)将水凝胶消毒，优选通过γ射线消毒。

[0146] 骨架试剂

[0147] 该至少一种骨架试剂具有1-100kDa，优选2-50kDa，更优选5-30kDa，甚至更优选5-25kDa，最优选5-15kDa的分子量。

[0148] 优选，骨架试剂为包含至少10％PEG，更优选包含至少20％PEG，甚至更优选包含至少30％PEG，最优选包含至少40％PEG的基于PEG-的。

[0149] 在一个实施方案中，骨架试剂以其酸性盐的形式，优选以酸加成盐的形式存在。合适的酸加成盐由形成无毒盐的酸形成。实例包括乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺氨酸盐(besylate)、碳酸氢盐、碳酸盐、硫酸氢盐、硫酸盐、硼酸盐、右旋樟脑磺酸盐(camsylate)、柠檬酸盐、乙二磺酸盐(edisylate)、乙磺酸盐(esylate)、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐(gluceptate)、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、六氟磷酸盐、海苯酸盐(hibenzate)、氢氯化物、氢溴化物、氢碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐(pamoate)、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、塞彻瑞特(sacharate)、硬脂酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐和甲苯磺酸盐。特别优选骨架试剂以其氢氯化物盐的形式存在。

[0150] 在一个实施方案中，至少一种骨架试剂选自：

[0151] 式(I)的化合物

[0152] B(–(A0)x1–(SP)x2–A1–P–A2–Hyp1)x      (I)，

[0153] 其中：

[0154] B为支化核心，

[0155] SP为选自如下的间隔基结构部分：C1-6烷基、C2-6链烯基和C2-6炔基，

[0156] P为包含至少80％PEG，优选至少85％PEG，更优选至少90％PEG，最优选至少95％PEG的基于PEG的聚合物链，

[0157] Hyp1为包含胺(-NH2和/或-NH-)的结构部分或包含至少两个胺(-NH2和/或-NH-)的多胺，

[0158] x为3-16的整数，

[0159] x1、x2相互独立地为0或1，条件是如果x2为0，则x1为0，

[0160] A0、A1、A2相互独立地选自：

[0161]

[0162] 其中R1和R1a相互独立地选自H和C1-6烷基；

[0163] 式(II)的化合物：

[0164] Hyp2–A3–P–A4–Hyp3   (II)，

[0165] 其中：

[0166] P如上文式(I)的化合物中所定义，

[0167] Hyp2、Hyp3相互独立地为包含至少两个胺(-NH2和/或-NH-)的多胺，且

[0168] A3和A4独立地选自：

[0169]

[0170]

[0171] 其中R1和R1a相互独立地选自H和C1-6烷基；

[0172] 式(III)的化合物：

[0173] P1–A5–Hyp4      (III)，

[0174] 其中：

[0175] P1为包含至少80％PEG，优选至少85％PEG，更优选至少90％PEG，最优选至少95％PEG的基于PEG的聚合物链，

[0176] Hyp4为包含至少3个胺(-NH2和/或-NH)的多胺，且

[0177] A5选自：

[0178]

[0179] 其中R1和R1a相互独立地选自H和C1-6烷基；

[0180] 和

[0181] 式(IV)的化合物：

[0182] T1–A6–Hyp5        (IV),

[0183] 其中：

[0184] Hyp5为包含至少3个胺(-NH2和/或-NH)的多胺，且

[0185] A6选自：

[0186]

[0187] 其中R1和R1a相互独立地选自H和C1-6烷基；且

[0188] T1选自C1-50烷基、C2-50链烯基或C2-50炔基，所述链段任选被一个或多个选自如下的基团间隔：-NH-、-N(C1-4烷基)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)N(C1-4烷基)-、-O-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、4-7元杂环基、苯基或萘基。

[0189] 在以下部分中，术语“Hypx”集合性地指Hyp1、Hyp2、Hyp3、Hyp4和Hyp5。

[0190] 优选，骨架试剂为式(I)、(II)或(III)的化合物，更优选骨架试剂为式(I)或(III)的化合物，最优选骨架试剂为式(I)的化合物。

[0191] 在一个优选实施方案中，在式(I)的化合物中，x为4、6或8。优选，在式(I)的化合物中，x为4或8，最优选，x为4。

[0192] 在一个优选实施方案中，在式(I)至(IV)的化合物中，A0、A1、A2、A3、A4、A5和A6选自：

[0193]

[0194] 优选，在式(I)的化合物中，A0为：

[0195]

[0196] 优选，在式(I)的化合物中，A1为：

[0197]

[0198] 优选，在式(I)的化合物中，A2为：

[0199]

[0200] 优选，在式(II)的化合物中，A3为：

[0201]

[0202] 且A4为：

[0203]

[0204] 优选，在式(III)的化合物中，A5为：

[0205]

[0206] 优选，在式(IV)的化合物，A6为：

[0207]

[0208] 优选，在式(IV)的化合物中，T1选自H和C1-6烷基。

[0209] 在一个实施方案中，在式(I)的化合物中，支化核心B选自以下结构：

[0210]

[0211]

[0212] 其中：

[0213] 虚线表示连接在A0上，或者如果x1和x2都为0，则为连接在A1上，

[0214] t为1或2；优选t为1，

[0215] v为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14；优选v为2、3、4、5、6；更优选v为2、4或6；最优选v为2。

[0216] 在一个优选实施方案中，B具有式(a-i)、(a-ii)、(a-iii)、(a-iv)、(a-v)、(a-vi)、(a-vii)、(a-viii)、(a-ix)、(a-x)、(a-xiv)、(a-xv)或(a-xvi)的结构。更优选，B具有式(a-iii)、(a-iv)、(a-v)、(a-vi)、(a-vii)、(a-viii)、(a-ix)、(a-x)或(a-iv)的结构。最优选，B具有式(a-xiv)的结构。

[0217] 一个优选的实施方案为B和A0的组合，或者如果x1和x2都为0的话，B和A1的优选组合，其选自以下结构：

[0218]

[0219]

[0220] 其中：

[0221] 虚线表示连接在SP上，或者如果x1和x2都为0，则为连接在P上。

[0222] 更优选，B和A0的组合，或者如果x1和x2都为0的话，则B和A1的组合，具有式(b-i)、(b-iv)、(b-vi)或(b-viii)的结构，最优选具有式(b-i)的结构。

[0223] 在一个实施方案中，式(I)的x1和x2为0。

[0224] 在一个实施方案中，基于PEG的聚合物链P具有0.3-40kDa；例如0.4-35kDa、0.6-38kDa、0.8-30kDa、1-25kDa、1-15kDa或1-10kDa的分子量。最优选，P具有1-10kDa的分子量。

[0225] 在一个实施方案中，基于PEG的聚合物链P1具有0.3-40kDa；例如0.4-35kDa、0.6-38kDA、0.8-30kDa、1-25kDa、1-15kDa或1-10kDa的分子量。最优选，P1具有1-10kDa的分子量。

[0226] 在一个实施方案中，在式(I)或(II)的化合物中，P具有式(c-i)的结构：

[0227]

[0228] 其中n为6-900，更优选n为20-700，最优选n为20-250。

[0229] 在一个实施方案中，在式(III)的化合物中，P1具有式(c-ii)的结构：

[0230]

[0231] 其中：

[0232] n为6-900，更优选n为20-700，最优选n为20-250；

[0233] T0选自C1-6烷基、C2-6链烯基和C2-6炔基，其任选被一个或多个选自如下的基团间隔：-NH-、-N(C1-4烷基)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)N(C1-4烷基)-、-O-C(O)-、-S(O)-或-S(O)2-。

[0234] 在一个实施方案中，在式(I)至(IV)的化合物中，结构部分Hypx为多胺，优选包含结合形式，如果适用的话，R-和/或S-构型的式(d-i)、(d-ii)、(d-iii)和/或(d-iv)结构部分：

[0235]

[0236] 其中：

[0237] z1、z2、z3、z4、z5、z6相互独立地为1、2、3、4、5、6、7或8。

[0238] 更优选，Hypx包含结合形式，以及R-和/或S-构型赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丙酸和/或二氨基丁酸。最优选，Hypx包含结合形式以及R-和/或S-构型赖氨酸。

[0239] Hypx具有40Da至30kDa，优选0.3kDa至25kDa，更优选0.5kDa至20kDa，甚至更优选1kDa至20kDa，最优选2kDa至15kDa的分子量。

[0240] Hypx优选选自：

[0241] 式(e-i)的结构部分：

[0242]

[0243] 其中：

[0244] p1为1-5的整数，优选p1为4，且

[0245] 如果骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示连接在A2上，如果骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示连接在A3或A4上；

[0246] 式(e-ii)的结构部分：

[0247]

[0248] 其中：

[0249] p2、p3和p4为相同或不同的且各自相互独立地为1-5的整数，优选p2、p3和p4为4，且

[0250] 如果骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示连接在A2上，如果骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示连接在A3或A4上，如果骨架试剂具有式(III)的结构，则虚线表示连接在A5上，如果骨架试剂具有式(IV)的结构，则虚线表示连接在A6上，

[0251] 式(e-iii)的结构部分：

[0252]

[0253] 其中：

[0254] p5-p11为相同或不同的且各自相互独立地为1-5的整数，优选p5-p11为4，且

[0255] 如果骨架试剂具有式(I)，则虚线表示连接在A2上，如果骨架试剂具有式(II)，则虚线表示连接在A3或A4上，如果骨架试剂具有式(III)，则虚线表示连接在A5上，如果骨架试剂具有式(IV)，则虚线表示连接在A6上，

[0256] 式(e-iv)的结构部分：

[0257]

[0258] 其中：

[0259] p12-p26为相同或不同的且各自相互独立地为1-5的整数，优选p12-p26为4，且

[0260] 如果骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示连接在A2上，如果骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示连接在A3或A4上，如果骨架试剂具有式(III)的结构，则虚线表示连
5 6
接在A上，如果骨架试剂具有式(IV)的结构，则虚线表示连接在A上；

[0261] 式(e-v)的结构：

[0262]

[0263] 其中：

[0264] p27和p28为相同或不同的且各自相互独立地为1-5的整数，优选p27和p28为4，

[0265] q为1-8的整数，优选q为2或6，最优选q为6，且

[0266] 如果骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示连接在A2上，如果骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示连接在A3或A4上，如果骨架试剂具有式(III)的结构，则虚线表示连接在A5上，如果骨架试剂具有式(IV)的结构，则虚线表示连接在A6上；

[0267] 式(e-vi)的结构部分：

[0268]

[0269] 其中：

[0270] p29和p30为相同或不同的且各自相互独立地为2-5的整数，优选p29和p30为3，且

[0271] 如果骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示连接在A2上，如果骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示连接在A3或A4上，如果骨架试剂具有式(III)的结构，则虚线表示连接在A5上，如果骨架试剂具有式(IV)的结构，则虚线表示连接在A6上；

[0272] 式(e-vii)的结构部分：

[0273]

[0274] 其中：

[0275] p31-p36为相同或不同的且各自相互独立地为2-5的整数，优选p31-p36为3，且

[0276] 如果骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示连接在A2上，如果骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示连接在A3或A4上，如果骨架试剂具有式(III)的结构，则虚线表示连接在A5上，如果骨架试剂具有式(IV)的结构，则虚线表示连接在A6上；

[0277] 式(e-viii)的结构部分：

[0278]

[0279] 其中：

[0280] p37-p50为相同或不同的且各自相互独立地为2-5的整数，优选p37-p50为3，且

[0281] 如果骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示连接在A2上，如果骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示连接在A3或A4上，如果骨架试剂具有式(III)的结构，则虚线表示连接在A5上，如果骨架试剂具有式(IV)的结构，则虚线表示连接在A6上；和

[0282] 式(e-ix)的结构部分：

[0283]

[0284] 其中：

[0285] p51-p80为相同或不同的且各自相互独立地为2-5的整数，优选p51-p80为3，且

[0286] 如果骨架试剂具有式(I)的结构，则虚线表示连接在A2上，如果骨架试剂具有式(II)的结构，则虚线表示连接在A3或A4上，如果骨架试剂具有式(III)的结构，则虚线表示连接在A5上，如果骨架试剂具有式(IV)的结构，则虚线表示连接在A6上；且

[0287] 其中结构部分(e-i)至(e-v)可在各手性中心为R-或S-构型，优选结构部分(e-i)至(e-v)的所有手性中心为相同构型。

[0288] 优选，Hypx具有式(e-i)、(e-ii)、(e-iii)、(e-iv)、(e-vi)、(e-vii)、(e-viii)或(e-ix)的结构。更优选，Hypx具有式(e-ii)、(e-iii)、(e-iv)、(e-vii)、(e-viii)或(e-ix)x x的结构，甚至更优选Hyp具有式(e-ii)、(e-iii)、(e-vii)或(e-viii)的结构，最优选Hyp具有式(e-iii)的结构。

[0289] 如果Hypx包含结合形式赖氨酸，则优选它包含D-赖氨酸，因为惊讶地发现包含含有D-赖氨酸的骨架结构部分的水凝胶—与包含L-赖氨酸的那些相反—在给药于病人时更
稳定。

[0290] 如果骨架试剂具有式(I)的结构，则优选的结构部分–A2–Hyp1为下式的结构部分：

[0291]

[0292] 其中：

[0293] 虚线表示连接在P上；且

[0294] E1选自式(e-i)至(e-ix)。

[0295] 如果骨架试剂具有式(II)的结构，则优选的结构部分Hyp2–A3–为下式的结构部分：

[0296]

[0297] 其中：

[0298] 虚线表示连接在P上；且

[0299] E1选自式(e-i)至(e-ix)；

[0300] 且优选的结构部分–A4–Hyp3为下式的结构部分：

[0301]

[0302] 其中：

[0303] 虚线表示连接在P上；且

[0304] E1选自式(e-i)至(e-ix)。

[0305] 如果骨架试剂具有式(III)的结构，则优选的结构部分–A5–Hyp4为下式的结构部分：

[0306]

[0307] 其中：

[0308] 虚线表示连接在P1上；且

[0309] E1选自式(e-i)至(e-ix)。

[0310] 更优选，骨架试剂具有式(I)的结构，且B具有式(a-xiv)的结构。

[0311] 甚至更优选，骨架试剂具有式(I)的结构，B具有式(a-xiv)的结构，x1和x2为0，且A1为–O–。

[0312] 甚至更优选，骨架试剂具有式(I)的结构，B具有式(a-xiv)的结构，A1为–O–，且P具有式(c-i)的结构。

[0313] 甚至更优选，骨架试剂具有式(I)，B具有式(a-xiv)，x1和x2为0，A1为-O-且P具有式(c-i)。

[0314] 甚至更优选，骨架试剂为式(I)，B具有式(a-xiv)，x1和x2为0，A1为–O-，P具有式2 1
(c-i)，A为–NH-(C＝O)-且Hyp具有式(e-iii)。

[0315] 最优选，骨架试剂具有下式：

[0316]

[0317] 其中：

[0318] n为10-40，优选10-30，更优选10-20。

[0319] 同样优选，n为20-30kDa，最优选n为28。

[0320] 式(I)的SP为选自C1-6烷基、C2-6链烯基和C2-6炔基的间隔基结构部分，优选SP为-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-、-C(CH3)2-、-CH＝CH-或-CH＝CH-，最优选SP为-CH2-、-CH2-CH2-或-CH＝CH-。

[0321] 交联剂试剂

[0322] 该至少一种交联剂试剂包含至少2个羰氧基(-(C＝O)-O-或–O-(C＝O)-)，其为可生物降解键。这些可生物降解键是使水凝胶可生物降解所必需的。另外，该至少一种交联剂试剂包含至少2个在步骤(b)的反应期间与至少一种骨架试剂的胺反应的活性官能端基。

[0323] 交联剂试剂具有6-40kDa，更优选6-30kDa，甚至更优选6-20kDa，甚至更优选6-15kDa，最优选6-10kDa的分子量。

[0324] 交联剂试剂包含至少2个选自如下的活性官能端基：活性酯基团、活性氨基甲酸酯基团、活性碳酸酯基团和活性硫代碳酸酯基团，所述基团在聚合期间与骨架试剂的胺基团
反应，形成酰胺键，即骨架结构部分和交联剂结构部分优选通过酰胺键连接。

[0325] 在一个优选实施方案中，交联剂试剂为式(V-I)的化合物：

[0326]

[0327] 其中：

[0328] 各个D1、D2、D3和D4为相同或不同的且各自相互独立地选自-O-、-NR5-、-S-和-CR6R6a-；

[0329] 各个R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、R4、R4a、R6和R6a为相同或不同的且各自相互独立地选自-7 7 7a 7 1 2 3 4 1a 2a 3a 4a
H、-OR、-NRR 、-SR和C1-6烷基；任选每对R/R、R/R、R /R 和R /R 可独立地形成化学键
和/或每对R1/R1a、R2/R2a、R3/R3a、R4/R4a、R6/R6a、R1/R2、R3/R4、R1a/R2a和R3a/R4a相互独立地与它们连接的原子一起连接形成C3-8环烷基或者形成环A或者与它们连接的原子一起连接以形
成4-7元杂环基或8-11元杂二环基或金刚烷基；

[0330] 各个R5独立地选自–H和C1-6烷基；任选，每对R1/R5、R2/R5、R3/R5、R4/R5和R5/R6可独立地形成化学键和/或与它们连接的原子一起连接形成4-7元杂环基或8-11元杂二环基；

[0331] 各个R7、R7a独立地选自H和C1-6烷基；

[0332] A选自茚基、茚满基和四氢化萘基；

[0333] P2为：

[0334]

[0335] m为120-920，优选120-460，更优选120-230；

[0336] r1、r2、r7、r8独立地为0或1；

[0337] r3、r6独立地为0、1、2、3或4；

[0338] r4、r5独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

[0339] s1、s2独立地为1、2、3、4、5或6；

[0340] Y1、Y2为相同或不同的且各自相互独立地选自式(f-i)至(f-vi):

[0341]

[0342] 其中：

[0343] 虚线表示连接在分子其余部分上，

[0344] b为1、2、3或4，

[0345] XH为Cl、Br、I或F。

[0346] 优选，交联剂试剂为式(V-II)的化合物：

[0347]

[0348] 其中：

[0349] D1、D2、D3和D4为相同或不同的且各自相互独立地选自-O-、-NR5-、-S-和-CR5R5a-；

[0350] R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、R4、R4a、R5和R5a为相同或不同的且各自相互独立地选自H和C1-6烷基；任选，一个或多个对R1/R1a、R2/R2a、R3/R3a、R4/R4a、R1/R2、R3/R4、R1a/R2a和R3a/R4a形成化学键或者与它们连接的原子一起连接以形成C3-8环烷基或形成环A或者与它们连接的原子一起连接以形成4-7元杂环基或8-11元杂二环基或金刚烷基；

[0351] A选自苯基、萘基、茚基、茚满基和四氢化萘基；

[0352] P2为：

[0353]

[0354] m为120-920，优选120-460，更优选120-230；

[0355] r1、r2、r7、r8独立地为0或1；

[0356] r3、r6独立地为0、1、2、3或4；

[0357] r4、r5独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

[0358] s1、s2独立地为1、2、3、4、5或6；

[0359] Y1、Y2为相同或不同的且各自相互独立地选自式(f-i)至(f-vi):

[0360]

[0361] 其中：

[0362] 虚线表示连接在分子其余部分上，

[0363] b为1、2、3或4

[0364] XH为Cl、Br、I或F。

[0365] 应当理解结构部分：

[0366]

[0367] 表示至少2个活性官能端基。

[0368] 优选式(V-I)和(V-II)的Y1和Y2具有式(f-i)、(f-ii)或(f-v)的结构。更优选，Y1和2 1 2
Y具有式(f-i)或(f-ii)的结构，最优选，Y和Y具有式(f-i)的结构。

[0369] 优选，式(V-I)和(V-II)的结构部分Y1和Y2都具有相同的结构。更优选，结构部分Y1和Y2都具有式(f-i)的结构。

[0370] 优选，式(V-I)和(V-II)的r1为0。

[0371] 优选，式(V-I)和(V-II)的r1和s1都为0。

[0372] 优选，式(V-I)和(V-II)的一个或多个对R1/R1a、R2/R2a、R3/R3a、R4/R4a、R1/R2、R3/R4、R1a/R2a和R3a/R4a形成化学键或者与它们连接的原子一起连接以形成C3-8环烷基或形成环A。

[0373] 优选，式(V-I)和(V-II)的一个或多个对R1/R2、R1a/R2a、R3/R4、R3a/R4a与它们连接的原子一起连接形成4-7元杂环基或8-11元杂二环基。

[0374] 优选，式(V-I)和(V-II)的交联剂试剂为对称的，即结构部分：

[0375]

[0376] 具有与结构部分：

[0377]

[0378] 相同的结构。

[0379] 在一个优选实施方案中，式(V-I)和(V-II)的s1、s2、r1和r8为0。

[0380] 在另一优选实施方案中，式(V-I)和(V-II)的s1、s2、r1和r8为0，且式(V-I)和(V-II)的r4和r5为1。

[0381] 优选的交联剂试剂具有式(V-1)至(V-54)：

[0382]

[0383]

[0384]

[0385]

[0386]

[0387]

[0388]

[0389]

[0390] 其中：

[0391] 如果适用的话，各交联剂试剂可以为其外消旋混合物的形式；且

[0392] m、Y1和Y2如上文所定义。

[0393] 甚至更优选的交联剂试剂具有式(Va-1)至(Va-54)：

[0394]

[0395]

[0396]

[0397]

[0398]

[0399]

[0400]

[0401] 其中：

[0402] 如果适用的话，各交联剂试剂可以为其外消旋混合物的形式；且

[0403] m、Y1和Y2如上文所定义。

[0404] 惊讶地发现使用在羰氧基的α碳上具有支链(即不同于H的残基)的交联剂试剂导致形成对酶催化降解，例如通过酯酶降解更具抗性的水凝胶。

[0405] 类似地，惊讶地发现羰氧基的(C＝O)与相邻活性酯、活性氨基甲酸酯、活性碳酸酯或活性硫代氨基甲酸酯的(C＝O)之间存在越少的原子，所得水凝胶对降解越具有抗性，例如对通过酯酶降解越具有抗性。

[0406] 因此，交联剂试剂V-11至V-54、V-1、V-2、Va-11至Va-54、Va-1和Va-2是优选的交联剂试剂。交联剂试剂Va-11至Va-54、Va-1和Va-2是更优选的交联剂试剂。最优选交联剂试剂Va-14。

[0407] 在另一实施方案中，交联剂试剂V-1、V-2、V-5、V-6、V-7、V-8、V-9、V-10、V-11、V-12、V-13、V-14、V-15、V-16、V-17、V-18、V-19、V-20、V-21、V-22、V-23、V-24、V-25、V-26、V-
27、V-28、V-29、V-30、V-31、V-32、V-33、V-34、V-35、V-36、V-37、V-38、V-39、V-40、V-41、V-
42、V-43、V-44、V-45、V-46、V-47、V-48、V-49、V-50、V-51、V-52、V-53和V-54是优选的交联剂试剂。更优选，该至少一种交联剂试剂具有式V-5、V-6、V-7、V-8、V-9、V-10、V-14、V-22、V-
23、V-43、V-44、V-45或V-46，最优选，该至少一种交联剂试剂具有式V-5、V-6、V-9或V-14。

[0408] 在另一实施方案中，交联剂试剂Va-1、Va-2、Va-5、Va-6、Va-7、Va-8、Va-9、Va-10、Va-11、Va-12、Va-13、Va-14、Va-15、Va-16、Va-17、Va-18、Va-19、Va-20、Va-21、Va-22、Va-23、Va-24、Va-25、Va-26、Va-27、Va-28、Va-29、Va-30、Va-31、Va-32、Va-33、Va-34、Va-35、Va-36、Va-37、Va-38、Va-39、Va-40、Va-41、Va-42、Va-43、Va-44、Va-45、Va-46、Va-47、Va-
48、Va-49、Va-50、Va-51、Va-52、Va-53和Va-54是甚至更优选的交联剂试剂。更优选，该至少一种交联剂试剂具有式Va-5、Va-6、Va-7、Va-8、Va-9、Va-10、Va-14、Va-22、Va-23、Va-43、Va-44、Va-45或Va-46，最优选，该至少一种交联剂试剂具有式Va-5、Va-6、Va-9或Va-14。

[0409] 如上所述式(V-I)和(V-II)化合物的优选实施方案因此适用于优选的式(V-1)至(V-54)化合物，和更优选的式(Va-1)至(Va-54)化合物。

[0410] 在另一方面中，本发明涉及可通过如上文所定义的方法得到的水凝胶。

[0411] 水凝胶包含0.01-1毫摩尔/克伯胺基团(-NH2)，更优选，0.02-0.5毫摩尔/克伯胺基团，最优选0.05-0.3毫摩尔/克伯胺基团。术语“X毫摩尔/克伯胺基团”意指1克干水凝胶包含X毫摩尔伯胺基团。水凝胶的胺含量的测量根据Gude等人(Letters in Peptide 
Science，2002，9(4)：203-206，通过引用将其全部并入本文中)进行，并且还详细描述于实施例部分中。

[0412] 优选，如本文所用术语“干燥”意指具有最大10％，优选小于5％，更优选小于2％(根据Karl Fischer测定)的残余水含量。优选的干燥方法为冻干法。

[0413] 水凝胶-间隔剂共轭物的制备方法

[0414] 在另一方面中，本发明涉及制备水凝胶-间隔剂共轭物的方法，所述方法包括步骤：

[0415] (d)使来自步骤(b)或(c)的水凝胶与式(VI)的间隔剂试剂在溶剂的存在下反应以得到水凝胶-间隔剂共轭物：

[0416] Ax1-S0-Ax2    (VI)，

[0417] 其中：

[0418] S0选自C1-50烷基、C2-50链烯基和C2-50炔基，所述链段任选被一个或多个选自如下的基团间隔：-NH-、-N(C1-4烷基)-、-O-、-S、-C(O)-、-C(O)NH、-C(O)N(C1-4烷基)-、-O-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、4-7元杂环基、苯基和萘基；

[0419] Ax1为与水凝胶的胺基团反应的官能团；且

[0420] Ax2为官能团。

[0421] 优选，Ax1选自活性羧酸；Cl-(C＝O)-；NHS-(C＝O)-，其中NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；ClSO2-；R1(C＝O)-；I-；Br-；Cl-；SCN-；和CN-，其中R1选自H、C1-6烷基、链烯基、C2-6炔基、C3-8环烷基、4-7元杂环基、8-11元杂二环基、苯基、萘基、茚基、茚满基和四氢化萘基。

[0422] 最优选，Ax1为活性羧酸。

[0423] 得到活性羧酸的合适活化试剂为例如N,N'-二环己基-碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-碳二亚胺(EDC)、苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基 六氟磷酸盐(PyBOP)、溴三吡咯烷酮基
六氟磷酸盐(PyBrOP)、1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉基-
碳 六氟磷酸盐(COMU)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAT)、O-(6-
氯苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐(O-(6-chlorobenzotriazol-1-yl)-
N,N,N′,N′-tetramethyluroniumhexafluorophosphate，HCTU)、1-H-苯并三唑 (HBTU)、(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)和O-(苯并三唑-1-
基)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)。这些试剂是市售的且是技术人员熟知的。

[0424] 优选，Ax2选自-马来酰亚胺、-SH、-NH2、-SeH、-N3、-C≡CH、-CR1＝CR1aR1b、-OH、-(CH＝X0)–R1、-(C＝O)–S–R1、-(C＝O)-H、-NH-NH2、-O-NH2、-Ar–X0、-Ar–Sn(R1)(R1a)(R1b)、-Ar–B(OH)(OH)，

[0425]

[0426] 其具有任选保护基团；

[0427] 其中：

[0428] X0为-OH、-NR1R1a、-SH和-SeH，

[0429] Ar选自苯基、萘基、茚基、茚满基和四氢化萘基，且

[0430] R1、R1a、R1b相互独立地选自H、C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、C3-8环烷基、4-7元杂环基、8-11元杂二环基、苯基、萘基、茚基、茚满基和四氢化萘基。

[0431] 更优选，Ax2选自–NH2、马来酰亚胺和硫羟基，最优选Ax2为马来酰亚胺。同样优选硫羟基(-SH)。

[0432] 合适的反应条件描述于实施例部分中且是本领域技术人员已知的。

[0433] 工艺步骤(d)可在碱的存在下进行。合适的碱包括常规无机或有机碱。这些优选包括碱土金属或碱金属氰化物、氢氧化物、酰胺、醇盐、乙酸盐、碳酸盐或碳酸氢盐，例如氢化钠、酰胺钠、甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钾、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、乙酸钠、乙酸钾、乙酸钙、乙酸铵、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸氢钠或碳酸铵，和叔胺如三甲胺、三乙胺、三丁胺、N,N-二甲基苯胺、N,N-二甲基苄胺、吡啶、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、N,N-二甲基氨基吡啶、二氮杂二环辛烷(DABCO)、二氮杂二环壬烯(DBN)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、二氮杂二环十一碳烯(DBU)或可力丁(collidine)。

[0434] 工艺步骤(d)可在溶剂的存在下进行。用于进行本发明的工艺步骤(d)的合适溶剂包括有机溶剂。这些优选包括水和脂族、脂环族或芳族烃，例如石油醚、己烷、庚烷、环己烷、甲基环己烷、苯、甲苯、二甲苯或十氢化萘；卤化烃，例如氯苯、二氯苯、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷或三氯乙烷；醇，例如甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇或叔丁醇、乙二醇、丙-1,2-二醇、乙氧基乙醇、甲氧基乙醇、二甘醇单甲醚、二甲醚、二甘醇；
乙腈、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、N,N-二甲基乙酰胺、硝基甲烷、硝基苯、六甲基磷酰胺(HMPT)、1,3-二甲基-2-咪唑烷酮(DMI)、1,3-二甲基-
3,4,5,6-四氢-2(1H)-嘧啶烷酮(DMPU)、乙酸乙酯、丙酮、丁酮；醚，例如二乙醚、二异丙醚、甲基叔丁基醚、甲基叔戊基醚、二 烷、四氢呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、1,2-二乙氧基乙烷或茴香醚；或其混合物。优选，溶剂选自水、乙腈或N-甲基-2-吡咯烷酮。

[0435] 在另一方面中，本发明涉及可通过上述方法得到的水凝胶-间隔剂共轭物。

[0436] 制备连接载体的前药的方法

[0437] 在另一方面中，本发明涉及制备连接载体的前药的方法，所述方法包括步骤：

[0438] (e)使步骤(b)或(c)的水凝胶或者步骤(d)的水凝胶-间隔剂共轭物与式(VII)的前药连接剂-生物活性结构部分试剂在溶剂的存在下反应以得到连接载体的前药：

[0439] Ay1-L-D    (VII)，

[0440] 其中：

[0441] Ay1为用于与步骤(b)或(c)的水凝胶的胺反应或者用于与步骤(d)的水凝胶-间隔剂共轭物的官能团Ax2反应的官能团，

[0442] L为前药连接剂；

[0443] D为生物活性结构部分。

[0444] 工艺步骤(e)可在溶剂的存在下进行。用于进行本发明工艺步骤(e)的合适溶剂包括有机溶剂。这些优选包括水和脂族、脂环族或芳族烃，例如石油醚、己烷、庚烷、环己烷、甲基环己烷、苯、甲苯、二甲苯或十氢化萘；卤化烃，例如氯苯、二氯苯、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷或三氯乙烷；醇，例如甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇或叔丁醇、乙二醇、丙-1,2-二醇、乙氧基乙醇、甲氧基乙醇、二甘醇单甲醚、二甲醚、二甘醇；乙腈、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、N,N-二甲基乙酰胺、硝基甲烷、硝基苯、六甲基磷酰胺(HMPT)、1,3-二甲基-2-咪唑烷酮(DMI)、1,3-二甲基-3,4,
5,6-四氢-2(1H)-嘧啶烷酮(DMPU)、乙酸乙酯、丙酮、丁酮；醚，例如二乙醚、二异丙醚、甲基叔丁基醚、甲基叔戊基醚、二 烷、四氢呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、1,2-二乙氧基乙烷或茴香醚；或其混合物。优选，溶剂选自水、乙腈或N-甲基-2-吡咯烷酮。

[0445] 如果式(VII)的前药连接剂-生物活性结构部分试剂与步骤(b)或(c)的水凝胶的胺反应，则Ay1为马来酰亚胺或OH-，优选马来酰亚胺。

[0446] 如果式(VII)的前药连接剂-生物活性结构部分试剂与步骤(d)的水凝胶-间隔剂共轭物的Ax2反应，则Ay1的结构取决于与Ay1反应的Ax2的结构。优选的Ax2/Ay1对选自以下：

[0447]

[0448]

[0449]

[0450] 其中：

[0451] X0为-OH、-NR1R1a、-SH和–SeH；

[0452] R1、R1a、R1b相互独立地选自H、C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、C3-8环烷基、4-7元杂环基、8-11元杂二环基、苯基、萘基、茚基、茚满基和四氢化萘基；且

[0453] Ar选自苯基、萘基、茚基、茚满基和四氢化萘基。

[0454] 更优选，Ay1选自–SH或–马来酰亚胺，最优选Ay1为–SH，因此，优选的Ax2为-马来酰亚胺或–SH，最优选的Ax2为-马来酰亚胺。

[0455] 在一个特别优选的实施方案中，Ax2为硫羟基且式(VII)的Ay1具有式(VIIa)：

[0456] T–PG0–S-      (VIIa)，

[0457] 其中：

[0458] T为H或标记结构部分；

[0459] PG0为硫活化结构部分；且

[0460] S为硫。

[0461] 在一个实施方案中，式(VIIa)的PG0选自：

[0462]

[0463] 其中：

[0464] 用星号标记的虚线表示连接在式(VIIa)的T上，未标记的线表示连接在式(VIIa)的硫上；

[0465] Ar为族结构部分，其任选进一步取代；

[0466] R01、R03、R04相互独立地为化学键，或者为C1-50烷基；C2-50链烯基；或C2-50炔基，其中C1-50烷基；C2-50链烯基；和C2-50炔基任选被一个或多个相同或不同的R3取代，且其中C1-50烷基；C2-50链烯基；和C2-50炔基任选被一个或多个选自如下的基团间隔：-Q-、-C(O)O-；-O-；-C(O)-；-C(O)N(R4)-；-S(O)2N(R4)-；-S(O)N(R4)-；-S(O)2-；-S(O)-；-N(R4)S(O)2N(R4a)-；-S-；-N(R4)-；-OC(O)R4；-N(R4)C(O)-；-N(R4)S(O)2-；-N(R4)S(O)-；-N(R4)C(O)O-；-N(R4)C(O)N(R4a)-；和-OC(O)N(R4R4a)；

[0467] R02为-H；C1-50烷基；C2-50链烯基；或C2-50炔基，其中C1-50烷基；C2-50链烯基；和C2-50炔基任选被一个或多个相同或不同的R3取代，且其中C1-50烷基；C2-50链烯基；和C2-50炔基任选被一个或多个选自如下的基团间隔：-Q-、-C(O)O-；-O-；-C(O)-；-C(O)N(R4)-；-S(O)2N4 4 4 4a 4 4 4
(R)-；-S(O)N(R)-；-S(O)2-；-S(O)-；-N(R)S(O)2N(R )-；-S-；-N(R)-；-OC(O)R ；-N(R)C(O)-；-N(R4)S(O)2-；-N(R4)S(O)-；-N(R4)C(O)O-；-N(R4)C(O)N(R4a)-；和-OC(O)N(R4R4a)；

[0468] Q选自苯基；萘基；茚基；茚满基；四氢化萘基；C3-10环烷基；4-7元杂环基；和8-11元杂二环基，其中T任选被一个或多个相同或不同的R3取代；

[0469] R3为卤素；-CN；氧(＝O)；-COOR5；-OR5；-C(O)R5；-C(O)N(R5R5a)；

[0470] -S(O)2N(R5R5a)；-S(O)N(R5R5a)；-S(O)2R5；-S(O)R5；-N(R5)S(O)2N(R5aR5b)；-SR5；-N(R5R5a)；-NO2；-OC(O)R5；-N(R5)C(O)R5a；-N(R5)S(O)2R5a；-N(R5)S(O)R5a；-N(R5)C(O)OR5a；-N(R5)C(O)N(R5aR5b)；-OC(O)N(R5R5a)；或C1-6烷基，其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；且

[0471] R4、R4a、R5、R5a、R5b独立地选自-H；或C1-6烷基，其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代。

[0472] 优选，R01为C1-6烷基。甚至更优选R01选自–CH2-、-CH2-CH2-和–CH2-CH2-CH2-。

[0473] 优选，R02选自H和C1-6烷基。

[0474] 优选，R03为C1-6烷基，

[0475] 优选，R04为C1-6烷基，

[0476] 优选，Ar选自：

[0477]

[0478] 其中：

[0479] 用星号标记的虚线表示连接在式(VIIa)的T上，未标记的虚线表示连接在式(VIIa)的PG0的其余部分上；

[0480] W相互独立地为O、S或N；

[0481] W’为N；且

[0482] 其中Ar任选被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自NO2、Cl和F。

[0483] 更优选，式(VIIa)的PG0选自：

[0484]

[0485] 其中：

[0486] 用星号标记的虚线表示连接在式(VIIa)的T上，未标记的线表示连接在式(VIIa)的硫上；且

[0487] Ar、R01、R02、R03和R04如上文所用。

[0488] 更优选，式(VIIa)的PG0为：

[0489]

[0490] 其中：

[0491] 用星号标记的虚线表示连接在式(VIIa)的T上，未标记的虚线表示连接在式(VIIa)的硫上。

[0492] 最优选，式(VIIa)的PG0为：

[0493]

[0494] 其中：

[0495] 用星号标记的虚线表示连接在式(VIIa)的T上，未标记的虚线表示连接在式(VIIa)的硫上。

[0496] 在一个优选实施方案中，式(VIIa)的T为H。

[0497] 在另一实施方案中，式(VIIa)的T包含聚合结构部分。优选，式(VIIa)的T包含选自如下的聚合物：2-甲基丙烯酰-氧基乙基磷酰胆碱、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸酯)、聚(丙烯酰胺)、聚(烷氧基)聚合物、聚(酰胺)、聚(酰胺胺)、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(天冬酰胺)、聚(丁酸)、聚(羟基乙酸)、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚(己内酯)、聚(碳酸酯)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(二甲基丙烯酰胺)、聚(酯)、聚(乙烯)、聚(亚烷基二醇)、聚(氧化乙烯)、聚(磷酸乙酯)、聚(乙基 唑啉)、聚(羟基乙酸)、聚(丙烯酸羟基乙酯)、聚(羟乙基- 唑啉)、聚(羟基甲基丙烯酸酯)、聚(羟基丙基甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸羟基丙酯)、聚(羟基丙基 唑
啉)、聚(亚氨基碳酸酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-co-羟基乙酸)、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(甲基 唑啉)、聚(有机磷腈)、聚(原酸酯)、聚( 唑啉)、聚(丙二醇)、聚(硅
氧烷)、聚(氨酯)、聚(乙烯基醇)、聚(乙烯基胺)、聚(乙烯基甲基醚)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、硅氧烷、纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、几丁质、脱乙酰壳多糖、右旋糖酐、糊精、明胶、透明质酸和衍生物、官能化透明质酸、甘露聚糖、胶质、鼠李半乳糖醛酸聚糖、淀粉、羟烷基淀粉、羟乙基淀粉和其它碳水化合物基聚合物、木聚糖及其共聚物。

[0498] 如果式(VIIa)的T为聚合结构部分，则优选T具有至少1kDa，优选至少3kDa，最优选至少5kDa的分子量。如果式(VIIa)的T为聚合结构部分，则优选它具有至多1000kDa，例如至多800kDa、至多500kDa、至多250kDa、至多200kDa或至多100kDa的分子量。

[0499] 在另一实施方案中，式(VIIa)的T包含亲和配体。优选式(VIIa)的T包含，更优选T为选自如下的亲和配体结构部分：4-氨基苄脒、3-(2′-氨基二苯甲氧基)托烷、ε-氨基己酰基-对-氯苄酰胺、1-氨基-4-[3-(4,6-二氯三嗪-2-基氨基)-4-磺基苯基氨基]蒽醌-2-磺
酸、2-(2′-氨基-4′-甲基苯硫基)-N,N-二甲基苄基胺二氢氯化物、血管生成素-1、阿普塔莫(aptamers)、芳维甲酸、阿维丁、生物素、调钙蛋白、古柯乙烯、西拓普隆B(cytosporone B)、N,N-二己基-2-(4-氟苯基)吲哚-3-乙酰胺、N,N-二丙基-2-(4-氯苯基)-6,8-二氯-咪唑[1,
2-a]吡啶-3-乙酰胺、5-氟-2′-脱氧尿苷5′-(对-氨基苯基)单磷酸盐、S-己基-L-谷胱甘肽、(S,S)-4-苯基-α-(4-苯基 唑烷-2-亚基)-2- 唑啉-2-乙腈、Pro-Leu-Gly氧肟酸盐、2-
(4-(2-(三氟甲基)苯基)哌啶-1-羧酰胺基)苯甲酸、三甲基(间-氨基苯基)氯化铵、尿皮素
III(urocortin III)、辅助因子如腺苷三磷酸、s-腺苷甲硫氨酸、抗坏血酸、钴胺素、辅酶A、辅酶B、辅酶M，辅酶Q、辅酶F420、胞苷三磷酸、黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、谷胱甘肽、亚铁血红素、硫辛酰胺、甲基萘醌、甲烷呋喃、甲基钴胺、钼喋呤、NAD+、NADP+、核苷酸糖、
3’-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸、吡哆醛磷酸盐、聚组氨酸、吡咯并喹啉醌、核黄素、链霉抗生物素、四氢生物蝶呤、四氢甲烷喋呤、四氢叶酸、生物素羧基载体蛋白(BCCP)、几丁质结合蛋白、FK506结合蛋白、FLAG标记物、绿色荧光蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、血凝素、麦芽糖结合蛋白、myc标记物、NusA、C蛋白表位、S-标记物、strep-标记物、硫氧还蛋白、三嗪和抗体片段。

[0500] 如果式(VIIa)的T饱和亲和配体，则优选亲和配体为聚组氨酸。

[0501] 在另一实施方案中，式(VIIa)的T包含带电结构部分。优选，式(VIIa)的T包含至少一个正和/或负电荷。应当理解T的正和负电荷数目是不相等的以确保T是带电分子。

[0502] 优选，式(VIIa)的T包含至少一个正或负电荷，例如至少2个正或负电荷、至少3个正或负电荷、至少4个正或负电荷、至少5个正或负电荷、至少6个正或负电荷、至少7个正或负电荷、至少8个正或负电荷、至少9个正或负电荷、至少10个正或负电荷、至少11个正或负电荷、至少12个正或负电荷、至少13个正或负电荷、至少14个正或负电荷或至少15个正或负电荷。

[0503] 更优选，式(VIIa)的T包含至少一个正电荷，例如1个正电荷、2个正电荷、3个正电荷、4个正电荷、5个正电荷、6个正电荷、7个正电荷、8个正电荷、9个正电荷、10个正电荷、11个正电荷、12个正电荷、13个正电荷、14个正电荷或15个正电荷。更优选式(VIIa)的T包含1个正电荷、2个正电荷、3个正电荷、4个正电荷、5个正电荷、6个正电荷、7个正电荷或8个正电荷。更优选，式(VIIa)的T包含2个正电荷、3个正电荷、4个正电荷、5个正电荷或6个正电荷。

[0504] 优选，式(VIIa)的T的至少一个正电荷由铵或 提供。

[0505] 优选，式(VIIa)的T包含含有至少一个季铵残基和/或至少一个质子化铵残基的聚酰胺，任选包含其它官能团。优选，这类任选其它官能团为胺官能团。优选，式(VIIa)的T包含至少一个季铵残基和/或至少一个质子化铵残基，甚至更优选，式(VIIa)的T包含4个季铵残基和/或4个质子化铵残基。

[0506] 优选，式(VIIa)的T包含结合形式的多胺。更优选，式(VIIa)的T包含选自如下的结合形式的多胺：乙二胺、1,3-二氨基丙烷、六亚甲基二胺、尸胺、腐胺、精胺、亚精胺、去甲精脒(norspermidine)和四乙基亚甲基二胺。

[0507] 甚至更优选，式(VIIa)的T包含式(a)的结构部分：

[0508]

[0509] 其中：

[0510] 虚线表示连接在PG0上；

[0511] R1、R1a、R1b、R2、R2a、R2b、R3、R3a、R3b、R4、R4a、R4b相互独立地为H或甲基；

[0512] 各个m相互独立地为1、2、3、4、5、6、7或8；

[0513] 各个n相互独立地为1、2、3、4、5、6、7或8；

[0514] 各个x相互独立地为1、2、3、4、5、6、7或8；

[0515] 各个y相互独立地为0、1、2、3、4、5、6、7或8；且

[0516] SP为间隔基结构部分。

[0517] 优选，式(a)的结构部分是对称的，即结构部分：

[0518]

[0519] 与结构部分：

[0520]

[0521] 是相同的。

[0522] 在一个实施方案中，式(a)的R1、R1a、R1b都为甲基。

[0523] 在另一实施方案中，式(a)的R1为H，且式(a)的R1a和R1b都为甲基。

[0524] 在一个实施方案中，式(a)的R2、R2a、R2b都为甲基。

[0525] 在另一实施方案中，式(a)的R2为H且式(a)的R2a和R2b都为甲基。

[0526] 在一个实施方案中，式(a)的R3、R3a、R3b都为甲基。

[0527] 在另一实施方案中，式(a)的R3为H，且式(a)的R3a和R3b都为甲基。

[0528] 在一个实施方案中，式(a)的R4、R4a、R4b都为甲基。

[0529] 在另一实施方案中，式(a)的R4为H，且式(a)的R4a和R4b都为甲基。

[0530] 优选，式(a)的m为1、2、3、4、5或6。更优选，式(a)的m为2、3、4或5，甚至更优选，式(a)的m为3、4或5，最优选，式(a)的m为4。

[0531] 优选，式(a)的n为1、2、3、4、5或6。更优选，式(a)的n为2、3、4或5，甚至更优选，式(a)的n为2、3或4，最优选，式(a)的n为3。

[0532] 优选，式(a)的x为1、2、3、4、5或6。更优选，式(a)的n为1、2、3或4，甚至更优选，式(a)的x为1、2或3，最优选，式(a)的x为1。

[0533] 优选，式(a)的y为1、2、3、4、5或6。更优选，式(a)的y为1、2、3或4，甚至更优选，式(a)的y为1、2或3，最优选，式(a)的y为1。

[0534] 在一个优选实施方案中，R1、R1a、R1b、R2、R2a、R2b、R3、R3a、R3b、R4、R4a、R4b为甲基；m为4；n为3；y为1且x为1。

[0535] 在另一优选实施方案中，R1、R2、R3、R4为H；R1a、R1b、R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b为甲基，m为4；n为3；y为1且x为1。

[0536] 用于式(I)的T的优选抗衡离子为Cl-、TFA-和SO4-。

[0537] 如果Ay1具有式(VIIa)且T为标记结构部分，则T可用于从其中各个D与x个结构部分Ay1-L连接且其中x为正整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的式(VII)的前药连接剂-生物活性结构部分试剂的混合物中净化每结构部分D具有指定数目的结构部分Ay1-L的式(VII)的
前药连接剂-生物活性结构部分试剂。T因此可用于分离式(VII)的前药连接剂-生物活性结
构部分试剂的单共轭物。

[0538] 分离前药连接剂-生物活性物质的单共轭物的方法取决于式(VIIa)的标记结构部分T。

[0539] 如果式(VIIa)的T为分子量为式(VII)的D的至少10％(w/w)的聚合结构部分，则分离步骤优选为粒度排阻色谱法。

[0540] 如果式(VIIa)的T包含亲和配体，则分离步骤优选为亲和色谱法。

[0541] 如果式(VIIa)的T包含带电结构部分，则分离步骤优选为离子交换色谱法。

[0542] 在一个优选实施方案中，式(VIIa)的T为带电结构部分，且分离步骤优选为离子交换色谱法。

[0543] 优选，工艺步骤(e)包括步骤：使步骤(d)的水凝胶-间隔剂共轭物与式(VII)的前药-生物活性结构部分试剂反应。

[0544] 合适的反应条件描述于实施例部分中且是本领域技术人员已知的。

[0545] 因此，制备连接载体的前药的方法优选包括步骤：

[0546] (d)使来自步骤(b)或(c)的水凝胶与式(VI)的间隔剂试剂在溶剂的存在下反应以得到水凝胶-间隔剂共轭物：

[0547] Ax1-S0-Ax2     (VI)，

[0548] 其中：

[0549] S0选自C1-50烷基、C2-50链烯基和C2-50炔基，所述链段任选被一个或多个选自如下的基团间隔：-NH-、-N(C1-4烷基)-、-O-、-S、-C(O)-、-C(O)NH、-C(O)N(C1-4烷基)-、-O-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、4-7元杂环基、苯基和萘基；

[0550] Ax1为与水凝胶的胺基团反应的官能团；且

[0551] Ax2为官能团；和

[0552] (e)使步骤(d)的水凝胶-间隔剂共轭物与式(VII)的前药连接剂-生物活性结构部分试剂在溶剂的存在下反应以得到连接载体的前药：

[0553] Ay1-L-D    (VII)，

[0554] 其中：

[0555] Ay1为用于与步骤(d)的水凝胶-间隔剂共轭物的官能团Ax2反应的官能团；

[0556] L为前药连接剂；

[0557] D为生物活性结构部分。

[0558] 优选的Ax2和Ay1的组合如上所述。

[0559] 作为前药连接剂-生物活性结构部分试剂的一部分的前药连接剂试剂或前药连接剂结构部分可具有本领域中已知的任何前药连接剂结构部分的结构。

[0560] 优选，作为前药连接剂-生物活性结构部分试剂的一部分的前药连接剂试剂或前药连接剂结构部分为无痕前药连接剂试剂或结构部分。

[0561] 优选的前药连接剂是公开的，并可如WO 2005/099768 A2所述得到。因此，优选的前药连接剂-生物活性结构部分试剂Ay1-L-D具有式(h-i)或(h-ii)的结构：

[0562]

[0563] 其中：

[0564] Ay1为如步骤(e)中所定义的官能团，

[0565] D为借助相应药物的胺基团与L连接的生物活性结构部分；

[0566] X为间隔基结构部分如R5-Y6，

[0567] Y1、Y2独立地为O、S或NR6，

[0568] Y3、Y5独立地为O或S，

[0569] Y4为O、NR6或C(R7)(R8)-，

[0570] Y6为O、S、NR6、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、不饱和碳-碳键或包含自由电子对的任何杂原子，或者不存在，

[0571] R2、R3相互独立地选自：水凝胶、取代或非取代线性、支化或环状烷基或杂烷基、芳基、取代芳基、取代或非取代杂芳基、氰基、硝基、卤素、羧基、羧基烷基、烷基羰基或羧酰胺烷基；

[0572] R4选自氢、取代或非取代线性、支化或环状烷基或杂烷基、芳基、取代芳基、取代或非取代杂芳基、取代或非取代线性、支化或环状烷氧基、取代或非取代线性、支化或环状杂烷氧基、芳氧基或杂芳氧基、氰基、卤素，

[0573] R5选自取代或非取代线性、支化或环状烷基或杂烷基、芳基、取代芳基、取代或非取代杂芳基，

[0574] R6选自水凝胶、取代或非取代线性、支化或环状烷基或杂烷基、芳基、取代或非取代杂芳基，

[0575] R7、R8独立地选自氢、取代或非取代线性、支化或环状烷基或杂烷基、芳基、取代芳基、取代或非取代杂芳基、羧基烷基、烷基羰基、羧酰胺烷基、氰基或卤素，

[0576] W选自取代或非取代线性、支化或环状烷基、芳基、取代芳基、取代或非取代线性、支化或环状杂烷基、取代或非取代杂芳基，

[0577] Nu为亲核体，

[0578] n为零或正整数，且

[0579] Ar为多取代芳族烃或多取代芳族杂环。

[0580] 应当理解在式(h-i)和(h-ii)中，L相当于连接Ay1和D的结构部分。

[0581] 优选，式(h-i)和(h-ii)的R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8独立地选自H、C1-6烷基、C2-6链烯基和C2-6炔基。

[0582] 优选，式(h-i)和(h-ii)的Y6为C1-20烷基、C2-20链烯基或C2-20炔基。

[0583] 优选，式(h-i)和(h-ii)的Nu选自如下亲核体：伯、仲和叔氨基、硫羟基、羧酸、羟胺、肼和含氮杂芳基。

[0584] 优选，式(h-i)和(h-ii)的W为–(CR9R10)b–，其中R9和R10独立地选自H、C1-6烷基、C2-6链烯基和C2-6炔基，且其中b为1、2、3、4或5。

[0585] 优选，式(h-i)和(h-ii)的n为0、1或2，更优选，n为0或1，最优选n为0。

[0586] 优选，式(h-i)和(h-ii)的Ar选自：

[0587]

[0588] 其它优选的前药连接剂是公开的，并可如WO 2006/136586 A2所述得到。因此，优选的前药连接剂-生物活性结构部分试剂Ay1-L-D具有式(h-iii)、(h-iv)或(h-v)的结构：

[0589]

[0590]

[0591] 其中：

[0592] Ay1为如步骤(e)中所定义的官能团；

[0593] D为借助形成酰胺键的相应药物的胺基团与L连接的生物活性结构部分；

[0594] X为间隔基结构部分如R13-Y1；

[0595] Y1为O、S、NR6、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、不饱和碳-碳键或包含自由电子对的任何杂原子，或者不存在，

[0596] R13选自取代或非取代线性、支化或环状烷基或杂烷基、芳基、取代芳基、取代或非取代杂芳基；

[0597] R2和R3独立地选自氢、酰基或用于羟基的保护基团；

[0598] R4-R12独立地选自氢、取代或非取代线性、支化或环状烷基或杂烷基、芳基、取代芳基、取代或非取代杂芳基、氰基、硝基、卤素、羧基、羧酰胺。

[0599] 应当理解在式(h-iii)、(h-iv)和(h-v)中，L相当于连接Ay1和D的结构部分。

[0600] 优选，式(h-iii)、(h-iv)和(h-v)的R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自H、C1-6烷基、C2-6链烯基和C2-6炔基。

[0601] 优选，在式(h-iii)、(h-iv)和(h-v)中，Y1为C1-20烷基、C2-20链烯基或C2-20炔基。

[0602] 另一优选的前药连接剂是公开的并可如WO 2009/095479 A2所述得到。因此，优选y1
的前药连接剂-生物活性结构部分试剂A -L-D具有式(h-vi)的结构：

[0603]

[0604] 其中：

[0605] Ay1为如步骤(e)中所定义的官能团；

[0606] D为通过形成酰胺键而借助相应药物的芳族胺与分子的其余部分连接的生物活性结构部分；

[0607] X为C(R4R4a)；N(R4)；O；C(R4R4a)-C(R5R5a)；C(R5R5a)-C(R4R4a)；C(R4R4a)-N(R6)；N(R6)-C(R4R4a)；C(R4R4a)-O；或O-C(R4R4a)；

[0608] X1为C；或S(O)；

[0609] X2为C(R7,R7a)；或C(R7,R7a)-C(R8,R8a)；

[0610] R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、R4、R4a、R5、R5a、R6、R7、R7a、R8、R8a独立地选自H；和C1-4烷基；

[0611] 任选，一个或多个对R1a/R4a、R1a/R5a、R4a/R5a、R4a/R5a、R7a/R8a形成化学键；

[0612] 任选，一个或多个对R1/R1a、R2/R2a、R4/R4a、R5/R5a、R7/R7a、R8/R8a与它们连接的原子一起连接形成C3-8环烷基；或4-7元杂环基；

[0613] 任选，一个或多个对R1/R4、R1/R5、R1/R6、R4/R5、R7/R8、R2/R3与它们连接的原子一起连接形成环A；

[0614] 任选，R3/R3a与它们连接的氮原子一起连接形成4-7元杂环；

[0615] A选自苯基；萘基；茚基；茚满基；四氢化萘基；C3-10环烷基；4-7元杂环基；和8-11元杂二环基；

[0616] 条件是R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、R4、R4a、R5、R5a、R6、R7、R7a、R8或R8a中的一个氢由Ay1替代。

[0617] 应当理解在式(h-vi)中，L相当于连接Ay1和D的结构部分。

[0618] 另一优选的前药连接剂是公开的并可如WO 2011/012721 A1和WO 2011/012722 A1所述得到。因此，优选的前药连接剂-生物活性结构部分试剂Ay1-L-D具有式(h-vii)的结构：

[0619]

[0620] 其中：

[0621] D为通过形成酰胺键而借助相应药物的芳族胺与分子的其余部分连接的生物活性结构部分；

[0622] Ay1为如步骤(e)中所定义的官能团；

[0623] X1为C(R1R1a)或选自如下的环状片段：C3-8环烷基、4-7元杂环基、苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢化萘基或8-11元杂二环基，

[0624] 其中：

[0625] 如果X1为环状片段，则所述环状片段借助2个相邻环原子并入L1中，且与酰胺键的碳原子相邻的X1的环原子也是碳原子；

[0626] X2为化学键或者选自C(R3R3a),、N(R3)、O、C(R3R3a)-C(R4R4a)、C(R3R3a)-N(R4)、N(R3)-C(R4R4a)、C(R3R3a)-O或O-C(R3R3a)，

[0627] 其中：

[0628] 如果X1为环状片段，则X2为化学键、C(R3R3a)、N(R3)或O；

[0629] 任选，如果X1为环状片段且X2为C(R3R3a)，则L1内的X1片段和X2片段的顺序可改变，且环状片段借助2个相邻环原子并入L1中；

[0630] R1、R3和R4独立地选自H、C1-4烷基和–N(R5R5a)；

[0631] R1a、R2、R3a、R4a和R5a独立地选自H和C1-4烷基；

[0632] R5为C(O)R6；

[0633] R6为C1-4烷基；

[0634] 任选，一对R1a/R4a、R3a/R4a或R1a/R3a形成化学键；

[0635] 条件是R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、R4、R4a、R5、R5a或R6的一个氢被Ay1替代。

[0636] 应当理解在式(h-vii)中，L相当于连接Ay1和D的结构部分。

[0637] 另一优选的前药连接剂是公开的并可如WO 2011/089214 A1所述得到。因此，优选的前药连接剂-生物活性结构部分试剂Ay1-L-D具有式(h-viii)的结构：

[0638]

[0639] 其中：

[0640] Ay1为如步骤(e)中所定义的官能团；

[0641] D为通过形成氨基甲酸酯键而借助相应药物的芳族羟基(-OH)与分子的其余部分连接的生物活性结构部分；

[0642] R1选自C1-4烷基；杂烷基；C3-8环烷基；且

[0643]

[0644] R2、R2a、R3和R3a独立地选自氢、取代或非取代线性、支化或环状C1-4烷基或杂烷基；

[0645] 各个d独立地为2、3或4；

[0646] 条件是R1、R2、R2a、R3或R3a的一个氢被Ay1替代。

[0647] 应当理解在式(h-viii)中，L相当于连接Ay1和D的结构部分。

[0648] 另一优选的前药连接剂是公开的并可如WO 2011/089216 A1所述得到。因此，优选的前药连接剂-生物活性结构部分试剂Ay1-L-D具有式(h-ix)的结构：

[0649]

[0650] 其中：

[0651] Ay1为如步骤(e)中所定义的官能团；

[0652] D为通过形成酰胺键而借助相应药物的脂族胺与分子的其余部分连接的生物活性结构部分；

[0653] X1选自O、S或CH-R1a；

[0654] R1和R1a独立地选自H、OH、CH3；

[0655] R2、R2a、R4和R4a独立地选自H和C1-4烷基，

[0656] R3和R3a独立地选自H、C1-4烷基和R5；

[0657] R5选自：

[0658]

[0659]

[0660] 其中：

[0661] 虚线表示连接在结构部分的其余部分上，

[0662] 条件是R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、R4、R4a和R5的一个氢被Ay1替代。

[0663] 应当理解在式(h-ix)中，L相当于连接Ay1和D的结构部分。

[0664] 优选，式(h-ix)的R3为H，且式(h-ix)的R3a为R5。

[0665] 优选，式(h-ix)的R4/R4a中的一个为H。

[0666] 任选，式(h-ix)的一个或多个对R3/R3a、R4/R4a、R3/R4可独立地形成一个或多个选自C3-8环烷基、4-7元杂环基或8-11元杂二环基的环片段。

[0667] 任选，式(h-ix)的R3、R3a、R4和R4a进一步被C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、苯基、4-7元杂环或卤素取代。

[0668] 另一优选的前药连接剂是公开的并可如WO 2011/089215 A1所述得到。因此，优选的前药连接剂-生物活性结构部分试剂Ay1-L-D具有式(h-x)的结构：

[0669]

[0670] 其中：

[0671] Ay1为如步骤(e)中所定义的官能团；

[0672] D为通过形成酰胺键而借助相应药物的芳族胺与分子的其余部分连接的生物活性结构部分；

[0673] R1、R1a、R2、R3、R3a、R4和R4a独立地选自H和C1-4烷基；

[0674] 任选，R1、R1a、R2、R3、R3a、R4和R4a中的任何两个可独立地形成一个或多个选自如下的环片段：C3-8环烷基、4-7元杂环基、苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢化萘基或8-11元杂二环基；

[0675] 任选R1、R1a、R2、R3、R3a、R4和R4a进一步被选自如下的取代基取代：C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、C3-8环烷基、4-7元杂环基、苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢化萘基或8-11元杂二环基；

[0676] 条件是R1、R1a、R2、R3、R3a、R4和R4a的一个氢被Ay1替代。

[0677] 应当理解在式(h-x)中，L相当于连接Ay1和D的结构部分。

[0678] 另一优选的前药连接剂是公开的并可如PCT/EP2012/065748所述得到。因此，优选的前药连接剂-生物活性结构部分试剂Ay1-L-D具有式(h-xi)的结构：

[0679]

[0680] 其中：

[0681] Ay1为如步骤(e)中所定义的官能团；

[0682] D为通过形成羧酸酯键而借助相应药物的羧酸基团(-(C＝O)-OH)与分子的其余部分连接的生物活性结构部分；

[0683] R1选自未取代烷基；取代烷基；未取代苯基；取代苯基；未取代萘基；取代萘基；未取代茚基；取代茚基；未取代茚满基；取代茚满基；未取代四氢化萘基；取代四氢化萘基；未取代C3-10环烷基；取代C3-10环烷基；未取代4-7元杂环基；取代4-7元杂环基；未取代8-11元杂二环基；和取代8-11元杂二环基；

[0684] R2选自H、未取代烷基和取代烷基，

[0685] R3和R4独立地选自H、未取代烷基和取代烷基；

[0686] e为0或1；

[0687] 任选，R1和R3与它们连接的原子一起连接形成环A；

[0688] A选自C3-10环烷基；4-7元脂族杂环基；和8-11元脂族杂二环基，其中A为未取代或取代的；

[0689] Q选自C1-50烷基、C2-50链烯基或C2-50炔基，所述链段任选被一个或多个选自如下的基团间隔：-NH-、-N(C1-4烷基)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)N(C1-4烷基)-、-O-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、4-7元杂环基、苯基或萘基。

[0690] 应当理解在式(h-xi)中，L相当于连接Ay1和D的结构部分。

[0691] 另一优选的前药连接剂是公开的并可如EP12165516所述。因此，优选的前药连接y1
剂-生物活性结构部分试剂A -L-D具有式(h-xii)的结构：

[0692]

[0693] 其中：

[0694] Ay1为如步骤(e)中所定义的官能团；

[0695] D为通过形成酯或氨基甲酸酯键而借助相应药物的羟基与分子的其余部分连接的生物活性结构部分；

[0696] Y为-C(R1)(R1a)-；或-N(R1)-；

[0697] X为-C(R4)(R4a)-；-N(R4)-；-O-；-C(R4)(R4a)-C(R5)(R5a)-；-C(R4)(R4a)-N(R6)-；-N(R6)-C(R4)(R4a)-；-C(R4)(R4a)-O-；-O-C(R4)(R4a)-；-C(O)-N(R6)-；或-N(R6)-C(O)-；

[0698] X1为 或

[0699] X2为-C(R7)(R7a)-；或-C(R7)(R7a)-C(R8)(R8a)-；

[0700] X3为＝O；＝S；或＝N-CN；

[0701] R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、R4、R4a、R5、R5a、R6、R7、R7a、R8、R8a独立地选自H；C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、C1-20杂烷基和Y1-T；且独立地不存在0、1个或多个对R1a/R4a、R1a/R5a、R4a/R5a、R7a/R8a，且它们连接的相应碳原子形成顺式双键；

[0702] Y1为化学键或C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基；

[0703] T选自苯基；萘基；茚基；茚满基；四氢化萘基；C3-10环烷基；4-7元杂环基；或8-11元杂二环基，其中T任选被一个或多个相同或不同的R9取代；

[0704] R9为卤素；-CN；氧(＝O)；-C(O)OH；-OH；-S(O)2NH2；-S(O)NH2；-S(O)2OH；-S(O)OH；-SH；-NH2；-NO2；C1-6烷基、或C1-10杂烷基；

[0705] 任选，一个或多个对R1/R1a、R1/R4、R1/R6、R1/R5、R2/R2a、R2/R3、R4/R4a、R4/R5、R5/R5a、R7/R7a、R7/R8、R8/R8a与它们连接的原子一起连接形成环T；

[0706] 任选，R3/R3a与它们连接的氮原子一起连接形成4-7元杂环；

[0707] 条件是R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、R4、R4a、R5、R5a、R6、R7、R7a、R8或R8a的一个氢被Ay1替代。

[0708] 应当理解在式(h-xii)中，L相当于连接Ay1和D的结构部分。

[0709] 在一个优选实施方案中，前药连接剂-生物活性结构部分试剂Ay1-L-D具有式(h-i)或(h-ii)。

[0710] 在另一优选实施方案中，前药连接剂-生物活性结构部分试剂Ay1-L-D具有式(h-vi)。

[0711] 包含至少一个官能团的任何药物可与前药连接剂试剂共轭以得到前药连接剂-生y1
物活性结构部分试剂A -L-D。这类药物选自多肽、蛋白质和低聚核苷酸。优选，药物为蛋白质。

[0712] 优选，D具有2-500kDa，更优选5-250kDa，更优选5-100kDa，最优选10-60kDa的分子量。

[0713] 在一个实施方案中，药物为蛋白质药物。优选，药物为调整一个或多个生物靶标的活性的蛋白质药物，所述生物靶标选自：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、转化生长因子α(TGFa)、转化生长因子β(TGFβ)、血小板源生长因子(PDGF)、血管生成素、血小板源内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-12、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素-I、Del-I、卵泡抑素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、瘦蛋白、肝素结合细胞因子、胎盘生长因子、多效生长因子(pleiotrophin，PTN)、生长因子(progranulin)、多育曲菌素、肿瘤坏死因子-α(TNF-alpha)、肿瘤血管形成抑制因子(angioarrestin)、血管抑素(纤溶酶原片段)、抗血管生成性抗凝血酶III、软骨来源抑制剂(CDI)、CDS9补体片段、内皮抑素(胶原质XVIII片段)、纤连蛋白片段、Gro-beta、肝素酶、肝素六糖片段、人类绒毛膜促性腺素(hCG)、干扰素α/β/γ、干扰素诱生蛋白(IP-IO)、Kringle S(血纤维蛋白溶酶原片段)、金属蛋白酶抑制剂(TIMP)、2-甲氧雌二醇、胎盘核糖核酸酶抑制剂、纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂、血小板因子-4(PF4)、催乳素16kD片段、增殖蛋白相关蛋白(PRP)、维甲类、四氢皮质醇-S、凝血酶致敏蛋白-I(TSP-I)、脉管抑素(vasculostatin)和血管形成抑素(vasostatin)(钙网蛋
白片段)、前列腺素、生长激素、胰岛素状生长因子-I(IGF-I)、1-磷酸-鞘氨醇
(sphingosine-1-phosphate)、因子D、RTP801、补体抑制剂，包括C1、C3和C5，α2肾上腺素激动药、mTOR、睫状神经营养因子(CNTF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、晶状体上皮源性生长因子(LEDGF)、杆细胞来源视锥细胞活性因子(rod-
derived cone viability factor，RdCVF)、色素上皮细胞源性因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)。

[0714] 如果药物是蛋白质，则它优选选自ACTH、腺苷脱氨酶、阿加西酶、白蛋白、α-1抗胰蛋白酶(AAT)、α-1蛋白酶抑制剂(API)、阿葡糖苷酶、阿替普酶、阿尼普酶、安克洛酶丝氨酸蛋白酶、抗体(单克隆或多克隆和片段或融合体)、抗凝血酶III、抗胰蛋白酶、抑肽酶、天门冬酰胺酶、双菲林(biphalin)、骨形态生成蛋白(bone-morphogenic protein)、降血钙素(salmon)、胶原酶、DNase、内啡肽、恩夫韦肽(enfuvirtide)、脑啡肽、促红细胞生成素、因子VIIa、因子VIII、因子VIIIa、因子IX、纤溶酶、融合蛋白、卵泡刺激激素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、半乳糖苷酶、胰高血糖素、胰高血糖素状肽如GLP-1、葡糖脑苷脂酶、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、绒毛膜促性腺激素(hCG)、血红蛋白、乙型肝炎疫苗、水蛭素、透明质酸酶、爱多诺酶(idurnonidase)、免疫球蛋白、流感疫苗、白细胞介素(1α、1β、2、3、4、
6、10、11、12)、IL-1受体拮抗剂(rhIL-1ra)、胰岛素、干扰素(α2a、α2b、α2c、β1a、β1b、γ1a、γ1b)、角化细胞生长因子(KGF)、乳糖酶、亮脯利特(leuprolide)、左旋甲状腺素、促黄体激素、莱姆病(lyme)疫苗、利钠肽、胰脂肪酶、木瓜蛋白酶、甲状旁腺素、PDGF、胃蛋白酶、磷脂酶激活蛋白(PLAP)、血小板激活因子乙酰水解酶(platelet activating factor 
alcetylhydrolase，PAF-AH)、催乳素、蛋白质C、奥曲肽(octreotide)、分泌素、舍莫瑞林(sermorelin)、超氧化物歧化酶(SOD)、促生长激素(生长激素)、生长激素抑制素、链激酶、蔗糖酶、破伤风毒素片段、半乳糖苷酶、凝血酶、胸腺素、甲状腺刺激激素、促甲状腺素、转化生长因子、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF受体-IgG Fc、组织型纤溶酶原激活物(tPA)、铁传递蛋白、TSH、尿酸盐氧化酶和尿激酶。

[0715] 如果药物为抗体，则它可以为单克隆或多克隆抗体或片段或其融合体。优选的抗体片段选自Fab(片段、抗原结合)、F(ab)2片段、Fc(片段、可结晶)、pFc'片段、Fv(片段、可变)、scFv(单链可变片段)、di-scFv/双特异抗体、双特异性T细胞衔接器(engager)、CDR(互补决定区)、单域抗体(sdABs/纳米抗体)、重链(α、δ、ε、γ、μ)或重链片段、轻链(λ、κ)或轻链片段、VH片段(重链的可变区)、VL片段(轻链的可变区)、VHH片段和VNAR片段。

[0716] 如果药物为亲和支架蛋白，则它优选选自鲨鱼衍生的亲和支架蛋白、Kunitz域衍生的亲和支架蛋白、辛替恩(centyrin)衍生的亲和支架蛋白、泛素衍生的亲和支架蛋白、脂质运载蛋白衍生的亲和支架蛋白、锚蛋白衍生的亲和支架蛋白、非萨体(versabodies)(富
二硫化物亲和支架蛋白)、纤维连接蛋白衍生的亲和支架蛋白、骆驼状衍生的抗体片段
(cameloid-derived antibody fragments)和亲和支架蛋白、骆驼衍生的抗体片段(llama-
derived antibody fragments)和亲和支架蛋白、转铁蛋白衍生亲和支架蛋白和具有半胱
氨酸结支架衍生亲和支架蛋白的南瓜型(squash-type)蛋白酶抑制剂。

[0717] 在另一方面中，本发明涉及可通过本发明制备连接载体的前药的方法得到的连接载体的前药。

[0718] 这类连接载体的前药以1小时至12个月，例如6小时至12个月、12小时至11个月、1天至10个月、3天至9个月、6天至9个月、1星期至9个月、2星期至9个月、3个星期至8个月、4个星期至8个月、6个星期至7个月、8星期至7个月、10个星期至6个月、12个星期至6个月或16星期至5个月的半衰期释放药物分子。

[0719] 本发明另一方面为包含本发明连接载体的前药或其药物盐与药物可接受赋形剂一起的药物组合物。

[0720] 本发明又一方面为用作药剂的本发明连接载体的前药或者包含本发明连接载体的前药的药物组合物

[0721] 本发明又一方面为根据一种或多种状况的处理需要而处理、控制、延缓或防止哺乳动物病患(优选人)的方法，所述方法包括向所述病患给药治疗有效量的本发明连接载体
的前药或者包含本发明连接载体的前药或其药物可接受盐的药物组合物。
实施例

[0722] 材料和方法

[0723] 材料：

[0724] 氨基4臂PEG5000由JenKem Technology,Beijing,P.R.China得到。CithrolTM DPHS由Croda International Pic,Cowick Hall,United Kingdom得到。

[0725] 顺-1,4-环己烷二羧酸由TCI EUROPE N.V.,Boerenveldseweg 6-Haven 1063,2070Zwijndrecht,Belgium得到。

[0726] 异丙基丙二酸由ABCR GmbH&Co.KG,76187Karlsruhe,Germany得到。

[0727] 戊二酸单苄基酯由IRIS Biotec GmbH,95615Marktredwitz,Germany得到。

[0728] N-(3-马来酰亚胺基丙基)-21-氨基-4,7,10,13,16,19-六氧杂-二十一烷酸五氟苯基酯(马来酰亚胺-NH-PEG6-PFE)和N-(3-马来酰亚胺基丙基)-39-氨基-4,7,10,13,16,
19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-三十九烷酸五氟苯基酯(马来酰亚胺-NH-PEG12-PFE)由
Biomatrik Inc.,Jiaxing,P.R.China得到。

[0729] Oxyma pure和Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH由Merck Biosciences GmbH,Schwalbach/Ts,Germany购买。

[0730] 4-硝基苯基碳酸(5-甲基-2-氧代-1,3-间二氧杂环戊烯-4-基)-甲酯由Chemzon Scientific Inc.,Lachine,QC,Canada购买。

[0731] 所有其它化学品来自Sigma-ALDRICH Chemie GmbH，Taufkirchen,Germany。

[0732] 方法：

[0733] RP-HPLC在分别与Waters 600或2535HPLC系统和Waters 2487或2489吸收检测器连接的100×20mm或100×40mm C18 ReproSil-Pur 300 ODS-3 5μ柱(Dr.Maisch,
Ammerbuch,Germany)上进行。使用溶液A(在H2O中的0.1％TFA)和溶液B(在乙腈中的0.1％
TFA)的线性梯度。将包含产物的HPLC级分结合并冻干。

[0734] 快速色谱提纯在来自Biotage AB,Sweden的Isolera One系统上进行，使用Biotage KP-Sil二氧化硅筒和正庚烷、乙酸乙酯和甲醇作为洗脱液进行。产物在254nm下检测。对于不显示出在240nm以上的吸收的产物，将该级分通过LC/MS筛分。

[0735] 分析超高效LC(UPLC)在来自Thermo Scientific的装配有Waters BEH300 C18柱(2.1×50mm，1.7μm粒度)，与LTQ Orbitrap Discovery质谱仪连接的Waters Acquity系统
上进行。

[0736] HPLC-电喷雾离子化质谱法(HPLC-ESI-MS)在具有Acquity PDA检测器，与装配有Waters ACQUITY UPLC BEH300 C18 RP柱(2.1×50mm， 1.7μm，流量：0.25mL/min；溶
剂A：UP-H20+0.04％TFA，溶剂B：UP-乙腈+0.05％TFA)的Thermo LTQ Orbitrap Discovery高分辨率/高精确度质谱仪连接的Waters Acquity UPLC上进行。

[0737] 由于PEG原料的多分散性，PEG产物的MS光谱显示一系列(CH2CH2O)n结构部分。为了更容易地解释，在实施例中仅给出一个单一代表性m/z信号。

[0738] 实施例1

[0739] 骨架试剂1a、1g和1h的合成：

[0740]

[0741] 骨架试剂1a如WO 2011/012715 A1的实施例1中所述合成，不同的是使用Boc-DLys(Boc)-OH代替Boc-LLys(Boc)-OH。

[0742] MS：m/z 888.50＝[M+10H+]10+(计算值＝888.54)

[0743]

[0744] 骨架试剂1g根据以下方案由氨基4臂PEG50001b合成：

[0745]

[0746]

[0747] 对于化合物1b的合成，将氨基4臂PEG5000(MW约5350g/mol，10.7g，2.00毫摩尔，HCl盐)和双(五氟苯基)碳酸酯(4.73g，12.0毫摩尔)溶于43mL的DCM(无水)中，并在室温下
加入DIPEA(3.10g，24.0毫摩尔，4.18mL)。在10分钟以后，加入1,9-双-boc-1,5,9-三氮杂壬烷(5.30g，16.0毫摩尔)并将混合物搅拌15分钟。然后加入另外的1,9-双-boc-1,5,9-三氮
杂壬烷(0.33g，1.0毫摩尔)。在完全溶解以后，将反应混合物过滤并在室温下将溶剂蒸发。

[0748] 将残余物溶于40mL iPrOH中并用320mL MTBE稀释。将产物在-20℃下沉淀过夜。将沉淀物通过玻璃过滤器Por.3过滤而收集，并用200mL冷MTBE(0℃)洗涤。将产物在真空下干燥过夜。

[0749] 收率：11.1g(83％)白色固体1b。

[0750] MS：m/z 1112.86＝[M+6H]6+(计算值＝1113.04)。

[0751] 对于化合物1c的合成，将boc-保护的化合物1b(11.1g，1.66毫摩尔)溶于40mL的3M HCl的MeOH溶液中，并在45℃下搅拌20分钟，然后在55℃下搅拌10分钟。对于沉淀，加入10mL MeOH和200mL的MTBE并将混合物在-20℃下储存16小时。将沉淀物通过玻璃过滤器Por.3过滤而收集，并用200mL冷MTBE(0℃)洗涤。将产物在真空下干燥过夜。

[0752] 收率：9.14g(89％)白色粉末1c(HCl盐)。

[0753] MS：m/z 979.45＝[M+6H]6+(计算值＝979.55)。

[0754] 对于化合物1d的合成，将化合物1c(9.06g，1.47毫摩尔，HCl盐)和双(五氟苯基)碳酸酯(6.95g，17.6毫摩尔)溶于50mL DCM(无水)中并在室温下加入DIPEA(4.56g，35.3毫摩尔，6.15mL)。在10分钟以后，加入1,9-双-boc-1,5,9-三氮杂壬烷(7.80g，23.5毫摩尔)并将混合物搅拌15分钟。然后加入另外的1,9-双-boc-1,5,9-三氮杂壬烷(0.49g，1.5毫摩尔)。
在完全溶解以后，将溶剂在室温下蒸发。

[0755] 将残余物在40℃下溶于35mL iPrOH中并用200mL MTBE稀释。将产物在-20℃下沉淀过夜。将沉淀物通过玻璃过滤器Por.3过滤而收集，并用200mL冷MTBE(0℃)洗涤。将产物在真空下干燥过夜以得到作为白色固体的1d。

[0756] 收率：11.6g(90％)白色固体1d。

[0757] MS：m/z 1248.08＝[M+7H]7+(计算值＝1248.27)。

[0758] 对于化合物1e的合成，将boc-保护的化合物1d(11.4g，1.31毫摩尔)溶于40mL的3M HCl的MeOH溶液中，并在45℃下搅拌20分钟，然后在55℃下搅拌10分钟。对于沉淀，加入10mL MeOH和200mL MTBE，并将混合物在-20℃下储存16小时。将沉淀物通过玻璃过滤器Por.3过滤而收集，并用200mL冷MTBE(0℃)洗涤。将产物在真空下干燥过夜以得到白色粉末1e。

[0759] 收率：7.60g(75％)白色粉末1e(HCl盐)。

[0760] MS：m/z 891.96＝[M+8H]8+(计算值＝892.13)。

[0761] 对于化合物1f的合成，将化合物1e(7.56g，0.980毫摩尔，HCl盐)和双(五氟苯基)碳酸酯(9.27g，23.0毫摩尔)溶于250mL DCM(无水)中并在35℃下加入DIPEA(6.08g，47.0毫摩尔，8.19mL)。在10分钟以后，加入1,9-双-boc-1,5,9-三氮杂壬烷(5.30g，16.0毫摩尔)并将混合物搅拌15分钟。加入另外的1,9-双-boc-1,5,9-三氮杂壬烷(0.33g，1.0毫摩尔)。在完全溶解以后，将溶剂在室温下蒸发。

[0762] 将残余物在60℃下溶于250mL iPrOH中，并用1350mL MTBE稀释。将产物在-20℃下沉淀过夜。将沉淀物通过玻璃过滤器Por.3过滤而收集，并用400mL冷MTBE(0℃)洗涤。将产物在真空下干燥过夜以得到作为玻璃状固体的1f。

[0763] 收率：11.1g(83％)玻璃状固体1f。

[0764] MS：m/z 1312.01＝[M+10H]10+(计算值＝1312.21)。

[0765] 对于骨架试剂1g的合成，将boc-保护的化合物1f(7.84g，0.610毫摩尔)在37℃下溶于16mL MeOH中，并在室温下加入4M HCl(4℃)在二 烷中的55mL预冷溶液。将混合物不
冷却地搅拌20分钟。在20分钟以后，加入在MeOH中的110mL 3M HCl。将溶液分配到24个
Falcon管(50mL)中，并通过将40mL冷MTBE(-20℃)加入各个Falcon管中而沉淀。在以
3214rcf离心1分钟以后，倾析出上清液，将玻璃状固体溶于5mL MeOH每Falcon管中并通过
再次将40mL冷MTBE(-20℃)加入各个Falcon管中而沉淀。倒出上清液并将其余固体在真空
下干燥过夜。

[0766] 收率：5.74g(87％)白色玻璃状固体1g(HCl盐)。

[0767] MS：m/z 965.46＝[M+10H]10+(计算值＝965.45)。

[0768]

[0769] 骨架试剂1h如WO 2011/012715 A1的实施例中关于化合物1e所述合成，不同的是使用Boc-DLys(Boc)-OH代替Boc-LLys(Boc)-OH。

[0770] MS：m/z 848.52＝[M+8H+]8+(计算值＝848.57)。

[0771] 实施例2

[0772] 交联剂试剂2d、2g、rac-2k、rac-2o、2s、2v、rac-2y、2ac、2ag和2ak的合成

[0773] 交联剂试剂2e根据以下方案由壬二酸单苄基酯和PEG10000制备：

[0774]

[0775] 对于壬二酸单苄基酯2a的合成，将壬二酸(37.6g，200毫摩尔)、苄醇(21.6g，200毫摩尔)、对甲苯磺酸(0.80g，4.2毫摩尔)和240mL甲苯的混合物在迪安斯达克设备中回流7小时。在冷却以后，将溶剂蒸发并加入300mL饱和NaHCO3水溶液。将该混合物用3×200mL MTBE萃取。结合的有机相经Na2SO4干燥并将溶剂蒸发。将产物在2×340g二氧化硅上使用乙酸乙酯/庚烷(10:90→25:75)作为洗脱液提纯。将洗脱液蒸发并将残余物在真空下干燥过夜。

[0776] 收率：25.8g(46％)无色油2a。

[0777] MS：m/z 279.16＝[M+H]+(计算值＝279.16)。

[0778] 对于化合物2b的合成，将壬二酸单苄基酯2a(3.90g，14.0毫摩尔)和PEG 10000(40.0g，4.00毫摩尔)溶于64mL二氯甲烷中并用冰浴冷却。加入DCC(2.89g，14.0毫摩尔)和DMAP(0.024g，0.020毫摩尔)在32mL二氯甲烷中的溶液。将冰浴除去并将混合物在室温下搅拌过夜。将所得悬浮液冷却至0℃并将固体滤出。将溶剂在真空下蒸发。

[0779] 将残余物溶于65mL二氯甲烷中并在室温下用308mL MTBE稀释。将混合物在-20℃下储存过夜。将沉淀物通过玻璃过滤器Por.3过滤而收集，并用250mL冷MTBE(-20℃)洗涤。
将产物在真空下干燥过夜。

[0780] 收率：40.8g(97％)白色粉末2b。

[0781] MS：m/z 835.50＝[M+14H]14+(计算值＝835.56)。

[0782] 对于化合物2c的合成，将化合物2b(40.6g，3.86毫摩尔)溶于乙酸甲酯(250mL)中并加入203mg木炭上载钯。在环境压力的氢气气氛下，将混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过赛力特(celite)垫过滤，将滤液蒸发并在真空下干燥过夜。

[0783] 收率：37.2g(93％)玻璃状固体2c。

[0784] MS：m/z 882.53＝[M+13H]13+(计算值＝882.51)。

[0785] 对于化合物2d的合成，将化合物2c(32.0g，3.10毫摩尔)和TSTU(3.73g，12.4毫摩尔)在室温下溶于150mL二氯甲烷中。然后加入DIPEA(1.60g，12.4毫摩尔)并将混合物搅拌1小时。将所得悬浮液过滤并将滤液用170mL二氯甲烷稀释，用140mL的750g水/197g NaCl/3g NaOH溶液洗涤。有机相经MgSO4干燥并将溶剂在真空下蒸发。

[0786] 将残余物溶于200mL甲苯中，在室温下用180mL MTBE稀释并在-20℃下储存过夜。将沉淀物通过玻璃过滤器Por.3过滤而收集，并用100mL冷MTBE(-20℃)洗涤。将产物在真空下干燥过夜。

[0787] 收率：28.8g(88％)白色粉末2d。

[0788] MS：m/z 795.47＝[M+15H]15+(计算值＝795.54)。

[0789] 交联剂试剂2g根据以下方案由壬二酸单苄基酯和PEG6000制备。

[0790]

[0791] 对于化合物2e的合成，将壬二酸单苄基酯2a(6.50g，23.3毫摩尔)和PEG 6000(40.0g，6.67毫摩尔)溶于140mL二氯甲烷中并用冰浴冷却。加入DCC(4.81g，23.3毫摩尔)和DMAP(0.040g，0.33毫摩尔)在40mL二氯甲烷中的溶液。将冰浴除去并将混合物在室温下搅
拌过夜。将所得悬浮液冷却至0℃并将固体滤出。将溶剂在真空下蒸发。

[0792] 将残余物溶于70mL二氯甲烷中并在室温下用300mL MTBE稀释。将混合物在-20℃下储存过夜。将沉淀物通过玻璃过滤器Por.3过滤而收集，并用500mL冷MTBE(-20℃)洗涤。
将产物在真空下干燥过夜。

[0793] 收率：41.2g(95％)白色粉末2e。

[0794] MS：m/z 833.75＝[M+8H]8+(计算值＝833.74)。

[0795] 对于化合物2f的合成，将化合物2e(41.2g，6.32毫摩尔)溶于乙酸甲酯(238mL)和乙醇(40mL)中，然后加入400mg木炭上载钯。在环境压力的氢气气氛下，将混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过赛力特(celite)垫过滤，将滤液蒸发并在真空下干燥过夜。

[0796] 收率：38.4g(96％)玻璃状固体2f。

[0797] MS：m/z 750.46＝[M+9H]9+(计算值＝750.56)。

[0798] 对于化合物2g的合成，将化合物2f(38.2g，6.02毫摩尔)和TSTU(7.25g，毫摩尔)在室温下溶于130mL二氯甲烷中。然后加入DIPEA(3.11g，24.1毫摩尔)并将混合物搅拌1小时。将所得悬浮液过滤，将滤液用100mL二氯甲烷稀释，并用200mL的750g水/197g NaCl/3g 
NaOH溶液洗涤。有机相经MgSO4干燥并将溶剂在真空下蒸发。

[0799] 将残余物溶于210mL甲苯中，在室温下用430mL MTBE稀释并在-20℃下储存过夜。将沉淀物通过玻璃过滤器Por.3过滤而收集，并用450mL冷MTBE(-20℃)洗涤。将产物在真空下干燥过夜。

[0800] 收率：35.8g(91％)白色粉末2g。

[0801] MS：m/z 857.51＝[M+8H]8+(计算值＝857.51)。

[0802] 交联剂试剂2k根据以下方案由异丙基丙二酸单苄基酯和PEG10000制备：

[0803]

[0804]

[0805] 对于异丙基丙二酸单苄基酯rac-2h的合成，将异丙基丙二酸(35.0g，239毫摩尔)、苄醇(23.3g，216毫摩尔)和DMAP(1.46g，12.0毫摩尔)溶于100mL乙腈中。将混合物用冰浴冷却至0℃。在0℃下在15分钟内加入DCC(49.4g，239毫摩尔)在150mL乙腈中的溶液。除去冰浴并将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后将固体滤出。将滤液在真空下在40℃下蒸发并将残余物溶于300mL MTBE中。将该溶液用2×300mL饱和NaHCO3水溶液萃取，然后将结合水相
用6N盐酸酸化至pH＝1-3。将所得乳液用2×300mL MTBE萃取并将溶剂蒸发。将结合有机相
用200mL饱和含水NaCl洗涤并经MgSO4干燥。将产物在340g二氧化硅上使用乙酸乙酯/庚烷
(10:90→20:80)作为洗脱液提纯。将洗脱液蒸发并将残余物在真空下干燥过夜。

[0806] 收率：9.62g(17％)无色油rac-2h。

[0807] MS：m/z 237.11＝[M+H]+(计算值＝237.11)。

[0808] 对于化合物rac-2i的合成，将异丙基丙二酸单苄基酯rac-2h(945mg，4.00毫摩尔)和PEG 10000(10.0g，4.00毫摩尔)溶于20mL二氯甲烷中并用冰浴冷却。加入DCC(825mg，
4.00毫摩尔)和DMAP(6mg，0.05毫摩尔)在10mL二氯甲烷中的溶液。将冰浴除去并将混合物
在室温下搅拌过夜。将所得悬浮液冷却至0℃并将固体滤出。将溶剂在真空下蒸发。

[0809] 将残余物溶于20mL二氯甲烷中并在室温下用150mL MTBE稀释。将混合物在-20℃下储存过夜。将沉淀物通过玻璃过滤器Por.3过滤而收集，并用500mL冷MTBE(-20℃)洗涤。
将产物在真空下干燥过夜。

[0810] 收率：9.63g(92％)白色粉末rac-2i。

[0811] MS：m/z 742.50＝[M+16H]16+(计算值＝742.51)。

[0812] 对于化合物rac-2j的合成，将化合物rac-2i(3.38g，0.323毫摩尔)溶于乙酸甲酯(100mL)中并加入105mg木炭上载钯。在环境压力的氢气气氛下，将混合物在室温下搅拌过
夜。将反应混合物通过赛力特(celite)垫过滤，将滤液蒸发并在真空下干燥过夜。

[0813] 收率：3.25g(98％)玻璃状固体rac-2j。

[0814] MS：m/z 731.25＝[M+16H]16+(计算值＝731.25)。

[0815] 对于化合物rac-2k的合成，将化合物rac-2j(3.10g，0.302毫摩尔)和TSTU(0.364g，1.21毫摩尔)在室温下溶于15mL二氯甲烷中。然后加入DIPEA(0.156g，1.21毫摩
尔)并将混合物搅拌45分钟。将所得悬浮液过滤并将滤液用2×10mL 0.5M磷酸盐缓冲剂pH
＝6.5洗涤。有机相经MgSO4干燥并将溶剂在真空下蒸发。将残余物溶于20mL甲苯中，在室温下用10mL MTBE稀释并在-20℃下储存过夜。将沉淀物通过玻璃过滤器Por.3过滤而收集，并用250mL冷MTBE(-20℃)洗涤。将产物在真空下干燥过夜。

[0816] 收率：2.66g(84％)白色粉末rac-2k。

[0817] MS：m/z 743.37＝[M+16H]16+(计算值＝743.38)。

[0818] 交联剂试剂rac-2o根据以下方案由顺-1,4-环己烷二羧酸和PEG10000制备：

[0819]

[0820] 对于顺-1,4-环己烷二羧酸单苄基酯rac-2l的合成，将顺-1,4-环己烷二羧酸(20.0g，116毫摩尔)、苄醇(11.3g，105毫摩尔)和DMAP(710mg，5.81毫摩尔)溶于200mL THF中。将混合物用冰浴冷却至0℃。在0℃下在15分钟内加入DCC(49.4g，239毫摩尔)在100mL THF中的溶液。除去冰浴并将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后将固体滤出。在滤液在40℃下蒸发并将残余物溶于300mL MTBE中。将该溶液用2×300mL饱和NaHCO3水溶液萃取，然
后将结合水相用6N盐酸酸化至pH＝1-3。将所得乳液用2×300mL MTBE萃取并将溶剂蒸发。
将结合有机相用200mL饱和含水NaCl洗涤并经MgSO4干燥。将产物在340g二氧化硅上使用乙
酸乙酯/庚烷(10:90→20:80)作为洗脱液提纯。将洗脱液蒸发，无色油质残余物在真空下干燥过夜期间结晶。

[0821] 收率：4.82g(16％)无色晶体rac-2l。

[0822] MS：m/z 263.13＝[M+H]+(计算值＝263.13)。

[0823] 对于化合物rac-2m的合成，将顺-1,4-环己烷二羧酸单苄基酯rac-2l(2.10g，8.00毫摩尔)和PEG 10000(20.0g，10.0毫摩尔)溶于50mL二氯甲烷中并用冰浴冷却。加入DCC
(1.65g，8.00毫摩尔)和DMAP(0.012g，0.10毫摩尔)在25mL二氯甲烷中的溶液。将冰浴除去并将混合物在室温下搅拌过夜。将所得悬浮液冷却至0℃并将固体滤出。将溶剂在真空下蒸发。

[0824] 将残余物溶于55mL二氯甲烷中并在室温下用300mL MTBE稀释。将混合物在-20℃下储存过夜。将沉淀物通过玻璃过滤器Por.3过滤而收集，并用250mL冷MTBE(-20℃)洗涤。
将产物在真空下干燥过夜。

[0825] 收率：18.2g(87％)白色粉末rac-2m。

[0826] MS：m/z 745.76＝[M+16H]16+(计算值＝745.77)。

[0827] 对于化合物rac-2n的合成，将化合物rac-2m(9.00g，0.857毫摩尔)溶于乙酸甲酯(100mL)中并加入157mg木炭上载钯。在环境压力的氢气气氛下，将混合物在室温下搅拌过
夜。将反应混合物通过赛力特(celite)垫过滤，将滤液蒸发并在真空下干燥过夜。

[0828] 收率：8.83g(100％)玻璃状固体rac-2n。

[0829] MS：m/z 734.50＝[M+16H]16+(计算值＝734.50)。

[0830] 对于化合物rac-2o的合成，将化合物rac-2n(8.92g，0.864毫摩尔)和TSTU(1.04g，3.64毫摩尔)在室温下溶于35mL二氯甲烷中。然后加入DIPEA(0.447g，3.46毫摩尔)并将混
合物搅拌45分钟。将所得悬浮液过滤并将滤液用2×10mL 0.5M磷酸盐缓冲剂pH＝6.5洗涤。
有机相经MgSO4干燥并将溶剂在真空下蒸发。

[0831] 将残余物溶于50mL甲苯中，在室温下用25mL MTBE稀释并在-20℃下储存过夜。将沉淀物通过玻璃过滤器Por.3过滤而收集，用400mL冷MTBE(-20℃)洗涤。将产物在真空下干燥过夜。

[0832] 收率：7.62g(84％)白色粉末rac-2o。

[0833] MS：m/z 702.60＝[M+16H]16+(计算值＝702.59)。

[0834] 交联剂试剂2s根据以下方案由辛二酸单苄基酯和PEG10000制备：

[0835]

[0836] 辛二酸单苄基酯2p根据壬二酸单苄基酯2a由辛二酸和苄醇合成。

[0837] 化合物2q根据PEG衍生物2b由辛二酸单苄基酯2p和PEG10000合成。

[0838] 化合物2r根据PEG衍生物2c由化合物2q合成。

[0839] 对于化合物2s的合成，将化合物2r(18.0g，1.74毫摩尔)和碳酸对硝基苯酯(2.12g，6.76毫摩尔)在室温下溶于70mL乙腈中。然后加入在1.0mL二氯甲烷中的DIPEA
(0.90g，6.76毫摩尔)并将混合物搅拌17小时。将混合物在室温下用270mL MTBE稀释并在-
20℃下储存过夜。将沉淀物通过玻璃过滤器Por.3过滤而收集，并用200mL冷MTBE(-20℃)洗涤。将产物在真空下干燥过夜。

[0840] 收率：17.6g(96％)浅黄色粉末2s。

[0841] MS：m/z 822.20＝[M+14H]14+(计算值＝822.25)。

[0842] 交联剂试剂2v根据以下方案由辛二酸单苄基酯2p和PEG6000制备：

[0843]

[0844] 化合物2t根据PEG衍生物2b由辛二酸单苄基酯2p和PEG6000合成。

[0845] 化合物2u根据PEG衍生物2c由化合物2t合成。

[0846] 对于化合物2v的合成，将化合物2u(2.40g，0.38毫摩尔)和碳酸对硝基苯酯(4.61g，1.52毫摩尔)在室温下溶于6mL乙腈中。然后加入在0.14mL二氯甲烷中的DIPEA
(0.20g，1.52毫摩尔)并将混合物搅拌1小时。将混合物在室温下用26mL MTBE稀释并在-20
℃下储存过夜。将沉淀物通过玻璃过滤器Por.3过滤而收集，并用100mL冷MTBE(-20℃)洗
涤。将产物在真空下干燥过夜。

[0847] 收率：2.37g(95％)浅黄色粉末2v。

[0848] MS：m/z 774.34＝[M+9H]9+(计算值＝774.34)。

[0849] 交联剂试剂2y根据以下方案由异丙基丙二酸单苄基酯和PEG8000制备：

[0850]

[0851] 对于化合物rac-2w的合成，将异丙基丙二酸单苄基酯rac-2h(2.25g，9.50毫摩尔)和PEG 8000(19.0g，2.38毫摩尔)溶于100mL二氯甲烷中并用冰浴冷却。加入DCC(1.96g，
9.50毫摩尔)和DMAP(14mg，0.12毫摩尔)在10mL二氯甲烷中的溶液。将冰浴除去并将混合物在室温下搅拌过夜。将所得悬浮液冷却至0℃并将固体滤出。将溶剂在真空下蒸发。

[0852] 将残余物溶于40mL二氯甲烷中并在室温下用270mL MTBE稀释。将混合物在-20℃下储存过夜。将沉淀物通过玻璃过滤器Por.3过滤而收集，并用500mL冷MTBE(-20℃)洗涤。
将产物在真空下干燥过夜。

[0853] 收率：18.5g(92％)白色粉末rac-2w。

[0854] MS：m/z 737.43＝[M+13H]13+(计算值＝737.42)。

[0855] 对于化合物rac-2x的合成，将化合物rac-2w(18.4g，2.18毫摩尔)溶于乙酸甲酯(160mL)中并加入254mg木炭上载钯。在环境压力的氢气气氛下，将混合物在室温下搅拌过
夜。将反应混合物通过赛力特(celite)垫过滤，将滤液蒸发并在真空下干燥过夜。

[0856] 收率：17.7g(98％)玻璃状固体rac-2x。

[0857] MS：m/z 723.51＝[M+13H]13+(计算值＝723.55)。

[0858] 对于化合物rac-2y的合成，将化合物rac-2x(13.6g，1.65毫摩尔)和TSTU(1.96g，6.60毫摩尔)在室温下溶于60mL二氯甲烷中。然后加入DIPEA(852mg，6.60毫摩尔)并将混合物搅拌45分钟。将所得悬浮液过滤，将滤液用70mL乙酸乙酯稀释并用70mL 0.5M磷酸盐缓冲剂pH＝6.5洗涤。有机相经MgSO4干燥并将溶剂在真空下蒸发。将残余物溶于80mL甲苯中，将其余固体滤出并用20mL甲苯洗涤。将结合的甲苯级分在室温下用35mL MTBE稀释并在-20℃
下储存过夜。将沉淀物通过玻璃过滤器Por.3过滤而收集，并用600mL冷MTBE(-20℃)洗涤。
将产物在真空下干燥过夜。

[0859] 收率：12.1g(87％)白色粉末rac-2y。

[0860] MS：m/z 738.51＝[M+13H]13+(计算值＝738.49)。

[0861] 交联剂试剂2ac根据以下方案由癸二酸单苄基酯和PEG10000制备：

[0862]

[0863] 对于癸二酸单苄基酯2z的合成，将癸二酸(20.2g，100毫摩尔)、苄醇(10.8g，100毫摩尔)、对甲苯磺酸(0.40g，2.1毫摩尔)和120mL甲苯的混合物在迪安斯达克设备中回流19小时。在冷却以后，将溶剂蒸发并加入150mL饱和NaHCO3水溶液。将该混合物用3×100mL 
MTBE萃取。结合的有机相经Na2SO4干燥并将溶剂蒸发。将产物在340g二氧化硅上使用乙酸乙酯/庚烷(10:90→25:75)作为洗脱液提纯。将洗脱液蒸发并将残余物在真空下干燥过夜。

[0864] 收率：13.4g(46％)无色油2z。

[0865] MS：m/z 293.16＝[M+H]+(计算值＝293.16)。

[0866] 对于化合物2aa的合成，将癸二酸单苄基酯2z(1.02g，3.50毫摩尔)和PEG 10000(10.0g，1.00毫摩尔)溶于40mL二氯甲烷中并用冰浴冷却。加入DCC(722mg，3.5毫摩尔)和
DMAP(6.1mg，0.05毫摩尔)在12mL二氯甲烷中的溶液。将冰浴除去并将混合物在室温下搅拌过夜。将所得悬浮液冷却至0℃并将固体滤出。将溶剂在真空下蒸发。

[0867] 将残余物溶于12mL二氯甲烷中并在室温下用45mL MTBE稀释。将混合物在-20℃下储存过夜。将沉淀物通过玻璃过滤器Por.3过滤而收集，并用250mL冷MTBE(-20℃)洗涤。将产物在真空下干燥过夜。

[0868] 收率：9.92g(94％)白色粉末2aa。

[0869] MS：m/z 793.48＝[M+15H]15+(计算值＝793.56)。

[0870] 对于化合物2ab的合成，将化合物2aa(9.83g，0.93毫摩尔)溶于乙酸甲酯(100mL)中并加入123mg木炭上载钯。在环境压力的氢气气氛下，将混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过赛力特(celite)垫过滤，将滤液蒸发并在真空下干燥过夜。

[0871] 收率：9.14g(95％)玻璃状固体2ab。

[0872] MS：m/z 840.51＝[M+14H]14+(计算值＝840.44)。

[0873] 对于化合物2ac的合成，将化合物2ab(9.00g，0.87毫摩尔)和TSTU(1.05g，3.47毫摩尔)在室温下溶于30mL二氯甲烷中，然后加入DIPEA(449mg，3.47毫摩尔)并将混合物搅拌
1小时。将所得悬浮液过滤并用30mL二氯甲烷稀释，用60mL 750g水/197g NaCl/3g NaOH溶
液洗涤。有机相经MgSO4干燥并将溶剂在真空下蒸发。

[0874] 将残余物溶于45mL甲苯中，在室温下用35mL MTBE稀释并在-20℃下储存过夜。将沉淀物通过玻璃过滤器Por.3过滤而收集，并用350mL冷MTBE(-20℃)洗涤。将产物在真空下干燥过夜。

[0875] 收率：8.29g(90％)白色粉末2ac。

[0876] MS：m/z 794.47＝[M+15H]15+(计算值＝794.48)。

[0877] 交联剂试剂2ag根据以下方案由十一烷二酸单苄基酯和PEG10000制备：

[0878]

[0879] 对于十一烷二酸单苄基酯2ad的合成，将十一烷二酸(21.6g，100毫摩尔)、苄醇(10.8g，100毫摩尔)、对甲苯磺酸(0.40g，2.1毫摩尔)和120mL甲苯的混合物在迪安斯达克设备中回流19小时。在冷却以后，将溶剂蒸发并加入150mL饱和NaHCO3水溶液。将该混合物用3×100mL MTBE萃取。结合的有机相经Na2SO4干燥并将溶剂蒸发。将产物在340g二氧化硅
上使用乙酸乙酯/庚烷(10:90→25:75)作为洗脱液提纯。将洗脱液蒸发并将残余物在真空
下干燥过夜。

[0880] 收率：14.8g(48％)无色油2ad。

[0881] MS：m/z 307.19＝[M+H]+(计算值＝307.19)。

[0882] 对于化合物2ae的合成，将十一烷二酸单苄基酯2ad(1.07g，3.50毫摩尔)和PEG 10000(10.0g，1.00毫摩尔)溶于40mL二氯甲烷中并用冰浴冷却。加入DCC(722mg，3.5毫摩
尔)和DMAP(6.1mg，0.05毫摩尔)在12mL二氯甲烷中的溶液。将冰浴除去并将混合物在室温
下搅拌过夜。将所得悬浮液冷却至0℃并将固体滤出。将溶剂在真空下蒸发。

[0883] 将残余物溶于13mL二氯甲烷中并在室温下用43mL MTBE稀释。混合物在-20℃下储存过夜。将沉淀物通过玻璃过滤器Por.3过滤而收集，并用250mL冷MTBE(-20℃)洗涤。将产物在真空下干燥过夜。

[0884] 收率：10.0g(95％)白色粉末2ae。

[0885] MS：m/z 792.48＝[M+15H]15+(计算值＝792.49)。

[0886] 对于化合物2af的合成，将化合物2ae(9.83g，0.93毫摩尔)溶于乙酸甲酯(100mL)中并加入103mg木炭上载钯。在环境压力的氢气气氛下，将混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过赛力特(celite)垫过滤，将滤液蒸发并在真空下干燥过夜。

[0887] 收率：8.90g(92％)玻璃状固体2af。

[0888] MS：m/z 780.47＝[M+15H]15+(计算值＝780.47)。

[0889] 对于化合物2ag的合成，将化合物2af(8.75g，0.84毫摩尔)和TSTU(1.01g，3.37毫摩尔)在室温下溶于30mL二氯甲烷中。然后加入DIPEA(435mg，3.37毫摩尔)并将混合物搅拌
1小时。将所得悬浮液过滤并将滤液用30mL二氯甲烷稀释，用60mL 750g水/197g NaCl/3g 
NaOH溶液洗涤。有机相经MgSO4干燥并将溶剂在真空下蒸发。

[0890] 将残余物溶于38mL甲苯中，在室温下用30mL MTBE稀释并在-20℃下储存过夜。将沉淀物通过玻璃过滤器Por.3过滤而收集，并用350mL冷MTBE(-20℃)洗涤。将产物在真空下干燥过夜。

[0891] 收率：7.51g(84％)白色粉末2ag。

[0892] MS：m/z 793.48＝[M+14H]14+(计算值＝793.38)。

[0893] 交联剂试剂2ak根据以下方案由戊二酸单苄基酯和PEG10000制备：

[0894]

[0895] 对于化合物2ai的合成，将戊二酸单苄基酯2ah(1.95g，8.78毫摩尔)和PEG 10000(25.1g，2.51毫摩尔)溶于70mL二氯甲烷中并用冰浴冷却。加入DCC(1.81g，8.78毫摩尔)和DMAP(15.3mg，0.13毫摩尔)在18mL二氯甲烷中的溶液。将冰浴除去并将混合物在室温下搅
拌过夜。将所得悬浮液冷却至0℃并将固体滤出。将溶剂在真空下蒸发。

[0896] 将残余物溶于70mL二氯甲烷中，并在室温下用360mL MTBE稀释。将混合物在-20℃下储存过夜。将沉淀物通过玻璃过滤器Por.3过滤而收集，并用500mL冷MTBE(-20℃)洗涤。
将产物在真空下干燥过夜。

[0897] 收率：24.9g(95％)白色粉末2ai。

[0898] MS：m/z 740.76＝[M+16H]16+(计算值＝740.76)。

[0899] 对于化合物2aj的合成，将化合物2ai(24.9g，2.39毫摩尔)溶于乙酸甲酯(220mL)中并加入302mg木炭上载钯。在环境压力的氢气气氛下，将混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过赛力特(celite)垫过滤，将滤液蒸发并在真空下干燥过夜。

[0900] 收率：24.3g(99％)玻璃状固体2aj。

[0901] MS：m/z 729.50＝[M+16H]16+(计算值＝729.49)。

[0902] 对于化合物2ak的合成，将化合物2aj(23.9g，2.33毫摩尔)和TSTU(2.81g，9.33毫摩尔)在室温下溶于100mL二氯甲烷中。然后加入DIPEA(1.21g，9.33毫摩尔)并将混合物搅
拌1小时。将所得悬浮液过滤并将滤液用20mL二氯甲烷稀释，用120mL 750g水/197g NaCl/
3g NaOH溶液洗涤。有机相经MgSO4干燥并将溶剂在真空下蒸发。

[0903] 将残余物溶于125mL甲苯中，在室温下用100mL MTBE稀释并在-20℃下储存过夜。将沉淀物通过玻璃过滤器Por.3过滤而收集，并用650mL冷MTBE(-20℃)洗涤。将产物在真空下干燥过夜。

[0904] 收率：22.5g(92％)白色粉末2ak。

[0905] MS：m/z 741.63＝[M+16H]16+(计算值＝741.63)。

[0906] 实施例3

[0907] 包含游离氨基的水凝胶珠3a、3b、3c和3d的制备

[0908] 在具有底部出口、直径60mm、装配有挡板的圆柱形250mL反应器中，将218mg CithrolTM DPHS在100mL十一烷中的乳液在环境温度下用直径50mm的isojet搅拌器以
580rpm搅拌。加入250mg 1a和2205mg 2d在22.1g DMSO中的溶液并在室温下搅拌10分钟以
形成悬浮液。加入1.1mL TMEDA以进行聚合。将混合物搅拌16小时。加入1.7mL乙酸，然后在
10分钟以后，加入100mL 15重量％氯化钠水溶液。在10分钟以后，停止搅拌器，并使相分离。
在2小时以后，将包含水凝胶的水相排出。

[0909] 对于珠粒尺寸分级，将水-水凝胶悬浮液用40mL乙醇稀释并使用Retsch AS200控制筛分机在125、100、75、63、50、40和32μm钢筛上湿筛分15分钟。筛分幅度为1.5mm，水流
300mL/min。收集保留在63和75μm筛上的珠粒级分并用0.1％AcOH洗涤3次，用乙醇洗涤10次并在0.1毫巴下干燥16小时以得到670mg作为白色粉末的3a。

[0910] 通过将fmoc-氨基酸共轭在水凝胶的游离氨基上，随后fmoc-测定而测定水凝胶的氨基含量为0.145毫摩尔/克。

[0911] 3b如关于3a所述制备，不同的是应用560rpm的搅拌器速度，使用350mg 1a、2548mg 2g、26.1g DMSO、257mg CithrolTM DPHS、1.5mL TMEDA和2.4mL乙酸，得到550mg作为白色粉末的3b，游离氨基0.120毫摩尔/克。

[0912] 3c如关于3a所述制备，不同的是应用560rpm的搅拌器速度，使用250mg 1a、3019mg rac-2k、32.7g DMSO、290mg CithrolTM DPHS、1.1mL ml TMEDA和1.7mL乙酸，得到770mg作为白色粉末的3c，游离氨基0.126毫摩尔/克。

[0913] 3d如关于3a所述制备，不同的是使用250mg 1a、2258mg rac-2o、22.6g DMSO、222mg CithrolTM DPHS、1.1mL ml TMEDA和1.7mL乙酸，得到186mg作为白色粉末的3d，游离氨基0.153毫摩尔/克。

[0914] 3e如关于3a所述制备，不同的是使用250mg 1a、2168mg rac-2y、21.8g DMSO、215mg CithrolTM DPHS、1.1mL TMEDA、1.7mL乙酸，得到710mg作为白色粉末的3e，游离氨基
0.154毫摩尔/克。

[0915] 3f如关于3a所述制备，不同的是应用400rpm的搅拌器速度，使用290mg的WO 2011/TM
012715 A1的实施例1所述骨架试剂作为1g、2281mg 2v、15.8g DMSO、290mg Cithrol  
DPHS、2.2mL TMEDA、3.3mL乙酸，在250、180、125、90和63μm的钢筛上筛分，产物在180μm筛上收集。后处理得到820mg作为浅黄色粉末的3f，游离氨基0.108毫摩尔/克。

[0916] 3g如关于3a所述制备，不同的是应用500rpm的搅拌器速度，使用300mg的WO 2011/012715 A1的实施例1所述骨架试剂作为1g、2520mg 2s、32.4g DMSO、300mg CithrolTM 
DPHS、2.2mL TMEDA、3.4mL乙酸，得到770mg作为浅黄色粉末的3g，游离氨基0.175毫摩尔/克。

[0917] 3h如关于3a所述制备，不同的是使用200mg 1a、1995mg 2ac、19.8g DMSO、195mg CithrolTM DPHS、0.9mL TMEDA、1.4mL乙酸，得到650mg作为白色粉末的3h，游离氨基0.131毫摩尔/克。

[0918] 3i如关于3a所述制备，不同的是使用150mg 1a、1591mg 2ag、15.7g DMSO、154mg CithrolTM DPHS、0.7mL TMEDA、1.0mL乙酸，得到300mg作为白色粉末的3i，游离氨基0.123毫摩尔/克。

[0919] 3j如关于3a所述制备，不同的是应用570rpm的搅拌器速度，使用360mg 1h、2567mg TM2ak、26.3g DMSO、257mg Cithrol  DPHS、2.2mL TMEDA、3.4mL乙酸，得到744mg作为白色粉末的3j，游离氨基0.097毫摩尔/克。

[0920] 实施例4

[0921] 连接剂试剂4c的合成

[0922] 连接剂试剂4c根据以下方案合成：

[0923]

[0924] 4a的合成：

[0925] 将Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH(1.00g，2.43毫摩尔)随DCC(0.70g，3.33毫摩尔)溶于DCM(25mL)中。将Oxyma pure(0.51g，3.58毫摩尔)和可力丁(0.50mL，3.58毫摩尔)以一份加入并缓慢地加入N-Boc-乙二胺(0.41g，2.56毫摩尔)在DCM(15mL)中的溶液。在室温下将混合
物搅拌90分钟以后，将形成的沉淀物滤出，并将滤液用含水HCl(0.1M，50mL)洗涤。将含水层用DCM(2×20mL)萃取并将结合的有机部分用饱和含水NaHCO3(3×25mL)和盐水(1×50mL)
洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。将粗固体通过快速色谱法提纯。得到作为白色固体的中间体N-boc-N’-(N-fmoc-4-叔丁基-L-天冬氨酰)-乙二胺(0.98g，1.77毫摩尔，73％)[0926] MS：m/z 554.29＝[M+H]+，(计算值＝554.29)

[0927] 将N-boc-N’-(N-fmoc-4-叔丁基-L-天冬氨酰)-乙二胺(0.98g，1.77毫摩尔)溶于THF(15mL)中，加入DBU(0.31mL)并将溶液在室温下搅拌12分钟。将反应用AcOH(0.5ml)骤
冷，在真空下浓缩并将残余物通过快速色谱法提纯以得到作为白色固体的4a(0.61g，1.77
毫摩尔，经2个步骤73％)。

[0928] MS：m/z 332.38＝[M+H]+，(计算值＝332.22)。

[0929] 4b的合成：

[0930] 将6-乙酰硫代基己酸(0.37g，1.95毫摩尔)溶于DCM(19.5mL)中并将Oxyma pure(0.35g，2.48毫摩尔)和DCC(0.40g，1.95毫摩尔)以一份加入。将溶液在室温下搅拌30分钟，过滤并将滤液加入4a(0.61g，1.77毫摩尔)在DCM(10.5mL)中的溶液中。将DIPEA(0.46mL，
2.66毫摩尔)加入溶液中并将反应在室温下搅拌2小时。将溶液用含水H2SO4(0.1M，2×
30mL)、饱和含水NaHCO3(2×20mL)和盐水(1×20mL)洗涤。有机层经Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。将粗材料通过快速色谱法提纯以得到作为白色固体的N-boc-N’-(N-6-乙酰硫代基己基-4-叔丁基-L-天冬氨酰)-乙二胺(0.65g，1.30毫摩尔，经2个步骤73％)。

[0931] MS：m/z 504.27＝[M+H]+，(计算值＝504.28)。

[0932] 将N-boc-N’-(N-6-乙酰硫代基己基-4-叔丁基-L-天冬氨酰)-乙二胺(0.60g，1.18毫摩尔)溶于TFA(5mL)中并加入TES(0.13mL)和水(0.13ml)。将混合物在室温下搅拌30分
钟。在N2流中除去TFA，将粗4b溶于H2O/ACN 1:1中并通过RP-HPLC提纯。

[0933] 收率：0.39g，0.85毫摩尔(TFA盐)，72％。

[0934] MS：m/z 348.25＝[M+H]+，(计算值＝348.16)。

[0935] 4c的合成

[0936] 将4b(TFA盐，0.38g，0.80毫摩尔)溶于DMF(5mL)中并加入4-硝基苯基碳酸(5-甲基-2-氧代-1,3-间二氧杂环戊烯-4-基)-甲酯(0.26g，0.88毫摩尔)和DIPEA(0.28mL、1.6毫摩尔)。将所得悬浮液用DCM(5mL)稀释并在室温下搅拌3小时。加入更多的DIPEA(0.28mL 
1.6毫摩尔)并继续搅拌2小时。将DCM在真空下浓缩，将残余物用H2O/ACN 3:1稀释并通过
RP-HPLC提纯以得到作为无色油的N-(5-甲基-2-氧代-1,3-间二氧杂环戊烯-4-基)-甲基-
氧羰基-N’-(N-6-乙酰硫代基己基-L-天冬氨酰)-乙二胺(0.31g，0.62毫摩尔，77％)。

[0937] MS：m/z 504.16＝[M+H]+，(计算值＝504.17)。

[0938] 将N-(5-甲基-2-氧代-1,3-间二氧杂环戊烯-4-基)-甲基氧羰基-N’-(N-6-乙酰硫代基己基-L-天冬氨酰)-乙二胺(150mg，0.30毫摩尔)溶于DCM(17.5mL)中，并将NHS(41mg，
0.36毫摩尔)、DCC(74mg，0.36毫摩尔)和DMAP(4mg，0.03毫摩尔)以一份加入。将反应在室温下搅拌1小时并将所得悬浮液过滤。将沉淀物用少量DCM洗涤并将结合的滤液在真空下浓
缩。将4c通过RP-HPLC提纯以得到无色油(144mg，0.24毫摩尔，80％)。

[0939] MS：m/z 601.18＝[M+H]+，(计算值＝601.18)。

[0940] 实施例5

[0941] 马来酰亚胺官能化水凝胶珠5a的制备

[0942] 将259.3mg干水凝胶珠3a在10mL 1％正丙胺的NMP溶液中培育15分钟，随后用1％正丙胺的NMP溶液洗涤两次并用2％DIPEA的NMP溶液洗涤两次。将171mg马来酰亚胺-NH-
PEG12-PFE溶于1mL NMP中并加入洗过的水凝胶珠3a中。将水凝胶悬浮液在室温下培育2小
时。将所得马来酰亚胺官能化水凝胶珠5a每次用NMP、20mM琥珀酸酯、1mM Na2EDTA、pH 3.0的0.01％Tween20、水、和0.1％乙酸、0.01％Tween20洗涤5次。

[0943] 马来酰亚胺官能化水凝胶珠5b的制备

[0944] 将117.7mg干水凝胶珠3a在5mL NMP中溶胀，用NMP洗涤5次并用2％DIPEA的NMP溶液洗涤5次。将5当量(56mg)马来酰亚胺-NH-PEG6-PFE(基于水凝胶珠的胺含量)溶于0.5mL 
NMP中并加入洗过的水凝胶珠5b中。将水凝胶悬浮液在室温下培育2.5小时。将所得马来酰
亚胺官能化水凝胶珠每次用NMP，其后用0.1％乙酸、0.01％Tween20洗涤5次。

[0945] 实施例6

[0946] 短效Lucentis-连接剂-水凝胶前药6c的合成

[0947] 将4.6mg Lucentis(在以下方案中描述为Lucentis-NH2)(460μL的10mg/mL Lucentis的10mM组氨酸溶液，10wt％α,α-海藻糖，0.01％Tween20，pH 5.5)与pH 7.4的10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、140mM氯化钠缓冲剂交换，并将Lucentis浓度调整至16.4mg/mL。将
6mg连接剂试剂4c溶于100μL DMSO中以得到100mM的浓度。将相对于Lucentis的量1摩尔当
量的连接剂试剂4c加入Lucentis溶液中。将反应混合物仔细地混合并在室温下培育5分钟。
随后将另外2摩尔当量的连接剂试剂4c以1摩尔当量步阶加入Lucentis溶液中并在各当量
的添加以后将反应混合物在室温下培育5分钟，得到未改性Lucentis与经保护的Lucentis-
连接剂单共轭物6a的混合物

[0948] 通过加入pH 5.0的1M柠檬酸钠而将反应混合物的pH调整至pH  6.5，并加入Na2EDTA至5mM的最终浓度。为除去6a的保护基团，加入0.5M NH2OH(溶于10mM柠檬酸钠、
140mM氯化钠、5mM Na2EDTA中，pH 6.5)至45mM的最终浓度，并将去保护反应在室温下培育4小时，得到Lucentis-连接剂单共轭物6b。将Lucentis与Lucentis-连接剂单共轭物6b的混
合物与pH 6.5的10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、140mM氯化钠、5mM Na2EDTA、0.01％Tween 20缓冲剂交换，并将两种Lucentis物种的总浓度调整至11.8mg/mL。混合物中的Lucentis-连接
剂单共轭物6b含量通过ESI-MS测定为20％。

[0949] 将在pH 6.5的10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、140mM氯化钠、5mM Na2EDTA、0.01％Tween 20中的4mg Lucentis/Lucentis-连接剂单共轭物6b混合物加入1mg马来酰亚胺官能
化水凝胶珠5a中并在室温下培育过夜，得到短效Lucentis-连接剂-水凝胶前药6c。

[0950]

[0951] 实施例7

[0952] 体外释放动力学—体外半衰期的测定

[0953] 将Lucentis-连接剂-水凝胶前药6c(包含约1mg Lucentis)用pH 7.4的60mM磷酸钠、3mM Na2EDTA、0.01％Tween20洗涤5次，最后悬浮于1mL上述缓冲剂中。将悬浮液在37℃下培育。在不同的时间间隔后将悬浮液的缓冲剂交换，并通过HPLC-SEC在220nm下分析。集合对应于释放的Lucentis的峰并将释放的Lucentis的总量相对于总培育时间绘图。应用曲
线拟合软件以测定第一级分裂速率。

[0954] 实施例8

[0955] 包含游离氨基的水凝胶珠8a和8b的制备

[0956] 8a如关于3a所述制备，不同的是使用400mg[PEG1250-LLys-LLys2-LLys4(NH2)8]4、5082mg 2s、33.5g DMSO、400mg CithrolTM DPHS、2.3mL TMEDA和4.8mL乙酸，得到1460mg作为白色粉末的8a，游离氨基0.057毫摩尔/克。

[0957] 8b如关于3a所述制备，不同的是使用290mg[PEG1250-LLys-LLys2-LLys4(NH2)8]4、2281mg 2v、26.1g DMSO、257mg CithrolTM DPHS、1.7mL TMEDA和3.5mL乙酸，得到820mg作为白色粉末的8b，游离氨基0.108毫摩尔/克。

[0958] 8c如关于3a所述制备，不同的是使用250mg[PEG1250-LLys-LLys2-LLys4(NH2)8]4、2168mg rac-2y、21.8g DMSO、215mg CithrolTM DPHS、1.1mL TMEDA和1.7mL乙酸，得到810mg作为白色粉末的8c，游离氨基0.154毫摩尔/克。

[0959] 实施例9

[0960] 生物素共轭水凝胶9a和9b的制备

[0961] 将11mg 8a转移至装配有玻璃滤片的注射器中。将水凝胶珠8a每次用NMP和用H2O/ACN/TFA(1/1/0.002；v/v/v)分别洗涤3次。将1.14mg生物素酰胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺
酯(2.5微摩尔)溶于250μL H2O/ACN/TFA(1/1/0.002；v/v/v)中，加入洗过的水凝胶珠8a中并在搅拌(15rpm)下在室温下培育5分钟。加入50μL pH 7.4的0.5M磷酸钠，并将反应混合物在搅拌(15rpm)下在室温下培育60分钟。将所得生物素共轭水凝胶9a每次用H2O/ACN/TFA
(1/1/0.002；v/v/v)和用pH 7.4的10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、140mM氯化钠、10％ACN分别洗涤5次。

[0962] 9b根据9a制备，不同的是使用11.3mg水凝胶珠8b和2.2mg生物素酰胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(4.8微摩尔)。

[0963] 实施例10

[0964] 链霉抗生物素-生物素水凝胶10a和10b的制备

[0965] 将6mg链霉抗生物素溶于pH 7.4的10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、140mM氯化钠、10％ACN中，加入生物素共轭水凝胶9a(由11mg 8a制备)中并在搅拌(15rpm)下在室温下培育60
分钟，得到链霉抗生物素-生物素水凝胶10a。将10a用pH 7.4的850μL 10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、140mM氯化钠、10％ACN洗涤2次，并将洗涤级分结合。结合在生物素共轭水凝胶上的链霉抗生物素量通过在结合洗涤级分中280nm的链霉抗生物素浓度下的光度测定而间接地量
化，并发现为2.6mg。

[0966] 10b根据10a制备，不同的是使用生物素共轭水凝胶9b(由11.3mg 8b制备)和8.1mg链霉抗生物素。发现结合在生物素共轭水凝胶9b上的链霉抗生物素量为0.5mg。

[0967] 实施例11

[0968] 封闭型水凝胶珠11

[0969] 水凝胶珠根据实施例3c中所述程序合成并根据实施例5b中所述程序用马来酰亚胺基团官能化。其后，将4mL的10mg/mL水凝胶悬浮液转移至装配有玻璃料的20mL注射器中。
除去溶剂并将水凝胶用5mL 10mM组氨酸/10重量％α,α-海藻糖/0.01％Tween20/pH 5.5洗
涤10次。除去溶剂并将在10mM组氨酸/10重量％α,α-海藻糖/0.01％Tween20/pH 5.5中的
5mL 1mMβ-巯基乙醇引入注射器中。使所得悬浮液在温和摇动下在环境温度下培育5分钟。
将溶剂排出并将水凝胶用在10mM组氨酸/10重量％α,α-海藻糖/0.01％Tween20/pH 5.5中
的5mL 1mMβ-巯基乙醇处理另外9次。每次将溶剂排出。然后将水凝胶珠用每次5mL 10mM组氨酸/10重量％α,α-海藻糖/0.01％Tween20/pH 5.5洗涤10次，每次将溶剂排出。然后将水凝胶珠用每次5mL PBS-T/pH 7.4洗涤10次，每次将溶剂排出。最后将新鲜PBS-T/pH 7.4引
入注射器中并将悬浮液转移至Falcon管中以得到11。

[0970] 缩写：

[0971] Ac        乙酰基

[0972] ACN       乙腈

[0973] AcOH       乙酸

[0974] Asp      天冬氨酸

[0975] Boc        叔丁氧基羰基

[0976] DBU        1,8-二氮杂二环(5.4.0)十一碳-7-烯

[0977] DCC       二环己基碳二亚胺

[0978] DCM        二氯甲烷

[0979] DIPEA      二异丙基乙胺

[0980] DMAP       二甲基氨基吡啶

[0981] DMF        二甲基甲酰胺

[0982] DMSO       二甲亚砜

[0983] Fmoc       芴基甲氧基羰基

[0984] HPLC       高效液相色谱

[0985] iPrOH     异丙醇

[0986] 马来酰亚胺-NH-PEG6-PFE

[0987] N-(3-马来酰亚胺基丙基)-21-氨基-4,7,10,13,16,19-六氧杂-二十一烷酸五氟苯基酯

[0988] 马来酰亚胺-NH-PEG12-PFE

[0989] N-(3-马来酰亚胺基丙基)-39-氨基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-三十九烷酸五氟苯基酯

[0990] MeOAc     乙酸甲酯

[0991] MeOH      甲醇

[0992] MS      质谱法

[0993] MTBE      甲基叔丁基醚

[0994] NHS     N-羟基琥珀酰亚胺

[0995] Oxyma Pure    2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯

[0996] PEG       聚乙二醇

[0997] RP-HPLC  反相高效液相色谱

[0998] RT       室温

[0999] tBu        叔丁基

[1000] TAN        1,5,9-三氮杂壬烷

[1001] TES        三乙基硅烷

[1002] TFA        三氟乙酸

[1003] THF        四氢呋喃

[1004] TMEDA      N,N,N',N'-四甲基乙二胺

[1005] TSTU       O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸盐