一种脱乙酰基酶突变体及其应用

摘要

本发明公开了一种大肠杆菌UDP?3?O?N?乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体及其应用，大肠杆菌UDP?3?O?N?乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码基因如SEQ ID No.2所示。本发明的有益效果为：通过易错PCR的方法对野生型大肠杆菌UDP?3?O?N?乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶（LpxC）进行突变，获得最高酶活达163.2IU/ml的突变体菌株，是野生型菌株酶活力的9.3倍；并且本发明涉及的生产产品葡萄糖胺和乙酰葡萄糖胺的应用范围广泛，有利于市场的推广与应用。

权利要求

1.一种大肠杆菌UDP-3-O-N-乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。

2.编码权利要求1所述的大肠杆菌UDP-3-O-N-乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。

3.一种载体，其特征在于，其含有权利要求2所述的基因。

4.一种工程菌，其特征在于，其含有权利要求2所述的基因。

5.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于，其出发菌株为大肠杆菌。

6.一种转基因细胞系，其特征在于，其含有权利要求2所述的基因。

7.权利要求1所述大肠杆菌UDP-3-O-N-乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体在N-乙酰葡萄糖胺去乙酰化中的应用。

8.权利要求1所述大肠杆菌UDP-3-O-N-乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：通过PCR技术扩增编码预先准备好的大肠杆菌UDP-3-O-N-乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体的基因；

步骤2：将步骤1所得PCR产物连接表达载体pET-24a；以及步骤3：连接产物转入预先准备好的大肠杆菌感受态细胞，获得表达产物。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，PCR扩增所用引物为：正向引物：5'-GGGAATTCCATATGATCAAACAAAGGACACT-3'；

反向引物：5'-CGGAATTCATTATGCCAGTACAGCTGAAGG-3'。

说明书

一种脱乙酰基酶突变体及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程及微生物发酵领域，具体来说，涉及一种大肠杆菌UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体基因及其表达及其制备方法。

背景技术

[0002] 葡萄糖胺（D-glucosamine，GlcN）盐酸盐是最新的第三代保健功能性食品添加剂，主要用于各种关节炎症，能起到有效的治疗作用。现在世界各地有大量患者忍受不同程度关节炎痛苦，仅美国就有3300万人忍受骨关节炎及关节疼痛，我国有1.5亿人以上。正是由于葡萄糖胺应用范围广泛，特别是在关节炎及关节疼痛的治疗与保健功能方面，使其已成为目前国外市场非常走俏的原料药品种，而国内还没有形成规模化市场。

[0003] 传统的D-葡萄糖胺生产方法是使用甲壳类动物如蟹、虾类的壳作原料来实现的。方法概括为：将甲壳类动物的壳压碎；用稀释的酸溶液对压碎的产品脱钙；用碱去除蛋白质以生产纯化的甲壳素；用酸水解得到的甲壳素以生产葡萄糖胺。用酸水解甲壳素生产葡萄糖胺的方法，还包括使用来自真菌渣（柠檬酸发酵使用的黑曲霉菌的菌渣），如美国专利US7049433B2公开的在高浓度盐酸下水解生产葡萄糖胺的方法。同时，常规方法还包括WO2004/003175公布的涉及使用遗传修饰的微生物，特别是遗传修饰的大肠杆菌，发酵生产N-乙酰-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖胺盐酸盐的方法。

[0004] 以上所述的用甲壳类动物（如蟹、虾类）的壳或柠檬酸渣作原料化学水解生产D-葡萄糖胺的方法，是通过使用高浓度的酸溶液和碱溶液来实现的，因此存在产生大量废液的问题。用虾蟹壳提取每生产1吨产品将产生大量废渣和100吨以上废水，用柠檬酸渣提取每30-50吨渣才能产1吨产品。同时，如果对甲壳类过敏的个体食用了用蟹、虾类的壳作原料获得的产品，可能出现过敏症状。许多有水产品过敏的人使用后会造成严重的问题，甚至危及生命。而且，甲壳素的材料来自鱼类资源，它的供应依赖于鱼类的捕捞，过度的捕捞将会引发环境的破坏。另外，由于环境污染，从虾蟹壳中提取不可避免的受到重金属污染。此外，通过培养遗传修饰的微生物生产N-乙酰-D-葡萄糖胺的方法需要一些措施来防止微生物在设备内的扩散，因此存在操作复杂的问题和与食品安全有关的危及社会的问题。化学合成方法制备葡萄糖胺目前国内外很少使用，因为生产成本高、严重的环境污染、存在安全性隐患。而微生物发酵法生产葡萄糖胺是一条良好的途径，因为发酵法生产葡萄糖胺无鱼腥味，生产不受季节和资源限制。但是，由于葡萄糖胺易于降解，而且降解产物对细胞有毒性。所以，微生物发酵法生产葡萄糖胺一般采用以在发酵液稳定的N-乙酰葡萄糖胺为目标产物的生产方式。

[0005] 将N-乙酰葡萄糖胺变成葡萄糖胺，传统的做法是化学水解法，即将N-乙酰葡萄糖胺通过高浓度盐酸进行去乙酰化处理。然而，该过程会产生大量稀盐酸和废酸水，污染环境。同时，生产过程中，也有损耗，因为N-乙酰-D-葡萄糖胺化合物结构中含有比较脆弱的酯键，在脱去糖基上的乙酰基同时酯键难免被破坏，影响收率。

[0006] 另一种方法是通过酶法将N-乙酰葡萄糖胺去乙酰化生产葡萄糖胺。酶法制备葡萄糖胺显然是一条减少污染的有效途径，但最重要的问题是如何获得专一性而高效的酶，进行脱乙酰基反应。

[0007] 过去的研究显示，甲壳素脱乙酰酶可以催化水解甲壳素的N-乙酰基，甲壳素脱乙酰酶广泛存在于自然界，尤其是一些真菌和昆虫中。这些酶都是糖蛋白，而且都表现出较高的热稳定性和严格的专一性(只作用于水溶性的以β-1，4键相连的N-乙酰-D-葡糖胺聚合物)。但是对于水不溶甲壳素，酶法脱乙酰效果并不理想。为此，需要在加酶前对甲壳素进行处理，以改善酶与底物之间的相互作用，对于提高酶催化脱乙酰的速度和产率是必要的。不同来源甲壳素脱乙酰酶的特性比较发现，甲壳素脱乙酰酶催化水解底物的乙酰基符合多作用位点模式作用位点为3个。酶与底物结合形成复合物，并催化水解多个(1个以上)乙酰基后，与底物分开，再与其他底物结合，继续发挥催化作用。通过研究鲁氏毛霉(M．rouxii)甲壳素脱乙酰酶催化聚合度为2～7的甲壳低聚糖脱乙酰，发现低聚物的聚合度对于酶的作用模式有很大影响。但该酶不能催化水解聚合度小于3的甲壳素低聚物脱乙酰，能够催化水解4-N-乙酰壳四糖和5-N-乙酰壳五糖脱去全部乙酰基。

[0008] 此外，人们尝试过许多N-乙酰葡糖胺酶，如N-脱乙酰酶 (N-deacetylase)、N-脱乙酰基酶/N-磺基转移酶（N-Deacetylase/N-Sulfotransferases）、N-乙酰葡糖胺脱乙酰酶 （N-Acetylglucosamine deacetylase）、N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶（N-Acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase），均未获得很好效果。

[0009] 大肠杆菌UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶（UDP-3-O-acyl N-acetylglucosamine deacetylase，LpxC）是催化革兰氏阴性菌外膜脂多糖主要成分类脂A的关键酶，负责类脂A合成第二步中UDP-3-O(R-3-羟基肉豆蔻酰基)-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基工作，而LpxC在革兰阴性菌中高度保守，并在结构和序列上与各种哺乳动物蛋白都不同源。

[0010] 针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。

发明内容

[0011] 本发明的目的是提供一种大肠杆菌UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体基因及其表达及其制备方法，以克服目前现有技术存在的上述不足。

[0012] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

[0013] 根据本发明的一方面，提供了一种大肠杆菌UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或将所述SEQ ID N0.1所示序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

[0014] 根据本发明的另一方面，提供了一种编码所述大肠杆菌UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，或Seq ID N0.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或在严格条件下与Seq ID N0.2所示序列杂交的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1%SDS的0.1×SSPE或含0.1%SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

[0015] 根据本发明的另一方面，提供了一种含有上述基因的重组载体。

[0016] 根据本发明的另一方面，提供了一种转基因细胞系，该转基因细胞系含有编码基因的重组载体。

[0017] 根据本发明的另一方面，提供了一种重组菌，该重组菌含有编码基因的重组载体。

[0018] 进一步的，其出发菌株为大肠杆菌。

[0019] 根据本发明的另一方面，提供了一种碱基优化后的UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶基因，其氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示。

[0020] 根据本发明的另一方面，提供了一种大肠杆菌UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体的制备方法，包括以下步骤：

[0021] 步骤1：通过PCR技术扩增编码预先准备好的大肠杆菌UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体的基因；

[0022] 步骤2：将步骤1所得PCR产物连接表达载体pET-24a；

[0023] 步骤3：连接产物转入预先准备好的大肠杆菌感受态细胞，获得表达产物；

[0024] 其中，步骤1中PCR扩增所用引物为：

[0025] 正向引物：5' - GGGAATTCCATATGATCAAACAAAGGACACT -3'；

[0026] 反向引物：5' - CGGAATTCATTATGCCAGTACAGCTGAAGG -3'。

[0027] 本发明的有益效果为：通过易错PCR的方法对野生型大肠杆菌UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶（LpxC）进行突变，获得最高酶活达163.2IU/ml的突变体菌株，是野生型菌株酶活力的9.3倍；并且本发明涉及的生产产品葡萄糖胺和乙酰葡萄糖胺的应用范围广泛，有利于市场的推广与应用。

具体实施方式

[0028] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0029] 本发明提供一种酶法将N-乙酰葡萄糖胺去乙酰化生产葡萄糖胺的方法。以大肠杆菌UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶（LpxC）为对象，通过错误倾向(聚合酶链式反应)易错PCR随机诱变法，引进随机的碱基替换，进行DNA改组，筛选该酶的理想突变体，作为N-乙酰葡萄糖胺脱乙酰基有效工具。

[0030] 为此，采用易错PCR向UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶基因中引入突变，再结合DNA改组对其进行改造，转化大肠杆菌，构建改组文库，进行试管初筛，摇瓶复筛，最终得到高活性酶突变体。

[0031] 与野生型的UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶基因测序比对，该突变体基因较原基因发生了8处碱基点突变，致氨基酸5处错义突变。本发明的UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体发生改变的氨基酸序列为：K23E (第23位赖氨酸变为谷氨酸)，V112L (第112位缬氨酸变为亮氨酸)，F161I (第161位苯丙氨酸变为异亮氨酸)，R222G (第222位精氨酸变为甘氨酸)，A291P(第291丙氨酸变为脯氨酸)。

[0032] 野生型的UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。

[0033] 本发明还提供所述大肠杆菌UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体在乙酰葡萄糖胺去乙酰化中的应用。

[0034] 所述大肠杆菌UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体的筛选方法，包括以下步骤：

[0035] 步骤1：从大肠杆菌(Escherichia coli)基因组DNA中，PCR扩增LpxC的编码基因LpxC；

[0036] 其中，PCR扩增所用引物为:

[0037] 正向引物（T7LpxC-F）Seq ID N0.5：

[0038] 5' -GGGAATTCCATATGATCAAACAAAGGACACT-3'(NdeI)；

[0039] 反向引物（T7LpxC-R）Seq ID N0.6：

[0040] 5' -CGGAATTCATTATGCCAGTACAGCTGAAGG-3'(EcoRI)。

[0041] 本发明的大肠杆菌UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶编码基因还可以通过人工合成序列的方法获得。

[0042] 步骤2：采用易错PCR技术，以LpxC的编码基因LpxC为模板，扩增获得LpxC突变体基因；

[0043] 步骤3：将步骤2所得易错PCR产物用NdeI和EcoRI双酶切后，与NdeI和EcoRI酶切的pET-24d(+)载体连接，连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布至LB(Kan)平板，将平板置37℃恒温培养箱培养，即得构建好的重组LpxC基因突变库；

[0044] 步骤4：LB (Kan)平板上长出菌落，挑取其中的300个单克隆，转接到LB (Kan)液体培养基中，37℃摇床培养，待菌液0D600值达0.8时，加入终浓度为1.0mM的IPTG诱导，放回37℃摇床继续培养12h后，收集菌体，超声破碎，获得LpxC （野生型）及LpxCM （突变体）的诱导上清液，并进行SDS-PAGE 分析。同时测定LpxC野生型和突变体酶活，挑选酶活力最强的一株LpxCM2，并测定其基因序列，结果所述UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体具有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列和SEQ IDN0.2所示的基因序列。

[0045] 过表达碱基优化后的突变体LpxCM2，其基因序列如SEQ ID N0.7所示，该酶突变体较野生型转化子的酶活提高了9.3倍。

[0046] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件。

[0047] 实施例1：大肠杆菌UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶基因的获得[0048] 根据Pubmed 公开的GeneID:12932864： Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶（UDP-3-O-acyl N-acetylglucosamine deacetylase）野生型基因序列（如SEQ ID N0.4所示）设计引物。

[0049] 其中，所述引物包括正向引物和反向引物，具体的，

[0050] 正向引物（T7LpxC-F）Seq ID N0.5：

[0051] 5’-GGGAATTCCATATGATCAAACAAAGGACACT-3’；

[0052] 反向引物（T7LpxC-R）Seq ID N0.6：

[0053] 5’-CGGAATTCATTATGCCAGTACAGCTGAAGG-3’。

[0054] 其中，标记有下划线的部分分别为酶切位点NdeI和EcoRI。PCR反应在50μl总体系中进行，反应条件为:94℃变性5min ；94℃变性 30s，58℃退火 lmin，72℃延伸 2min，共 30 个循环；72℃延伸10min；取 5μl PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳验证，目标产物大小约
0.9kb。

[0055] 实施例2：构建野生型UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶基因表达载体[0056] 将实施例1中的PCR产物做琼脂糖凝胶电泳，按照胶回收试剂盒的说明回收目的片段，取100μl PCR产物经限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切消化后，与用NdeI和EcoRI内切酶消化的pET-24a (+)质粒进行连接反应。用连接产物混合物转化大肠杆菌TOP10，挑20个克隆，用引物T7LpxC-F和T7LpxC-R做PCR鉴定；选择PCR鉴定阳性克隆进行序列测定，保存测序正确的载体,命名为：pET-LpxC。

[0057] 实施例3：易错PCR扩增大肠杆菌UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶基因[0058] 利用Taq DNA聚合酶不具有3' -5'校对功能的性质，在高镁离子浓度(8mmol/L)和不同浓度dNTP的浓度下(其中dATP和dGTP浓度为1.5mmol/L，dTTP和dCTP浓度为3.0mmol/L)，来控制随机突变的频率，向目的基因中引入随机突变，构建突变库；模板浓度A260值为1000ng/mL，酶浓度为5U/μL，引物浓度为100μM。

[0059] 易错PCR反应体系(50μl)：10×PCR反应缓冲液5μl，dNTP(2.5nM)5μl，MgCl25μl，正向引物（T7LpxC-F）1μl,反向引物（T7LpxC-R）1μl，DNA模板（实施例1的PCR产物）1μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，ddH2O 31.5μl。

[0060] PCR 程序：96℃预变性 4min；94℃变性 1min，56℃退火1min，75℃延伸 2min，45个循环；最后75℃延伸15min，采用胶回收方法回收PCR产物；取5μl产物1%琼脂糖凝胶电泳检验，-20℃保存备用。

[0061] 实施例4 ：构建UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体库

[0062] 将实施例3中的PCR产物（DNA改组后的混合物）经限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切消化后，与用NdeI和EcoRI内切酶消化的pET-24a质粒进行连接反应，然后用连接产物混合物转化大肠杆菌BL21 (DE3)，获得大量克隆转化子，构建转化菌体突变库。

[0063] 实施例5：筛选高酶活突变体

[0064] 从转化菌体突变库中，随机挑取突变克隆300株，分别接种至含50μg/mL 卡拉霉素（Kan）的5ml LB培养基中，37℃、150rpm培养，待OD600值达0.6-0.8，加入IPTG(终浓度1.0mmol/L)，继续培养12h后，10000rpm，5mim离心收集菌体。弃上清后，在4℃下重悬于1ml PBS(pH值7.5，10mmol/L)溶液中，在冰浴条件下选取300V电压，超声3s间歇6s对其进行超声破碎10min，离心取上清作为酶粗提液，进行酶活测定；检测酶活性最高的菌株，并挑选其克隆，并提取质粒，命名为pET-LpxCM，测序，该UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体基因序列如SEQ ID N0.2所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID N0.1 所示。

[0065] UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶的酶活检测：

[0066] 以5ml反应体系为酶活测定体系，其中含500mmol/L N -乙酰葡萄糖胺、5mmol/L 葡萄糖、100mmol/L Tris-HCl (pH8.0)及 100μl 粗酶液。酶活反应在37℃水浴中进行，保温4h，然后将酶解液在70℃下10min终止反应。3000rpm离心10 min，取上清液。HPLC测定D-氨基葡萄糖含量。

[0067] HPLC测定条件：

[0068] 仪器与设备：岛津LC-15C型高效液相色谱仪；检测器：可变波长紫外检测器；

[0069] 色谱柱：NH2色谱柱（4.6 mm*15cm，5μm）；

[0070] 流动相：乙腈-磷酸缓冲液（60∶40）；

[0071] 流速：1.5mL/min；

[0072] 检测波长：195 nm；

[0073] 柱温：35℃；

[0074] 进样量：10μl；

[0075] 酶活单位定义: 在酶促反应条件下，每分钟产生相当于1μmol D-氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量，定义为一个酶活力单位(IU) 。

[0076] 结果：最高突变体菌株的最高酶活为163.2 IU/ml，野生型菌株的酶活为17.5 IU/ml。

[0077] 结果表明，通过易错PCR对LpxC进行改造，获得酶活力提高了9.3倍的突变株。

[0078] 实施例6：突变体LpxCM的碱基优化

[0079] 对实施例5筛选到的最高酶活UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体LpxCM，根据其氨基酸序列，使用Escherichia coli偏爱密码子进行碱基优化，碱基优化后的UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶基因序列，如SEQ ID N0.5所示。按碱基优化序列，合成UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶基因，并插入pET-24a质粒中，命名为pET-LpxCM2。

[0080] 实施例7：突变体LpxCM2诱导表达、纯化与应用

[0081] 将UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体LpxCM2表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性克隆，分别接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至约为0.6-0.8时，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，37℃诱导12h，接种上述转化后的大肠杆菌BL21(DE3)于1000mL LB培养基，待0D600值约达2.0时，诱导与上述相同；离心收集菌体，以50mmol/L、pH8.0Tris-HCl(含lmmol/L咪唑)缓冲液悬浮（湿菌体与缓冲液的比例为Ig湿菌体:5mL缓冲液），在冰浴中以超声波破碎菌体，离心后收集上清，冻干、保存备用。

[0082] 取微生物发酵生产得N-乙酰葡萄糖胺粗品（85%）100g，加入含5mmol/L 葡萄糖、100mmol/L Tris-HCl (pH8.0)缓冲液1000L中，再加入5000IU UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体LpxCM2。37℃下进行酶解反应。在酶解开始后第1h、2h、3h、4h、5h取样，70℃下10min终止反应。3000rpm离心10 min，取上清液。测定反应产物中D-氨基葡萄糖含量，具体结果详见表1。

[0083] 表1 反应产物中生成D-氨基葡萄糖的量与转化率

[0084]反应时间 D-氨基葡萄糖（g/L） 转化率（%）
1 29.6 g/L 43.0%
2 62.8 g/L 91.3%
3 69.8 g/L 101.5%
2 68.2 g/L 99.1%
3 69.1 g/L 100.4%

[0085] 结果表明，UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体LpxCM2对N-乙酰葡萄糖胺的脱乙酰酶解反应3h可反应完全，产物为D-氨基葡萄糖。

[0086] 综上所述，借助于本发明的上述技术方案，本发明通过易错PCR的方法对野生型大肠杆菌UDP-3-O-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶（LpxC）进行突变。获得最高酶活达163.2IU/ml的突变体菌株，是野生型菌株酶活力的9.3倍，并且在应用领域方面，本发明涉及的生产产品葡萄糖胺和乙酰葡萄糖胺主要应用于食品抗氧化剂、婴幼儿食品添加剂、糖尿病患者热低量甜味剂，也可作为抗癌、防癌、降血脂、降血压的食品添加剂，是最新的第三代保健功能性食品添加剂。同时应用于医药行业和作为生化试剂；用于药物合成；有效的提高了葡萄糖胺和乙酰葡萄糖胺的应用范围，有利于市场的推广与应用。

[0087] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

[0088] 序列表

[0089] <110>  安徽正方生物科技有限公司

[0090] <120>  一种突变体及其应用

[0091] <130>  2014

[0092] <160>  7

[0093] <170>  PatentIn version 3.3

[0094] <210>  1

[0095] <211>  305

[0096] <212>  PRT

[0097] <213>  人工序列

[0098] <400>  1

[0099] Met Ile Lys Gln Arg Thr Leu Lys Arg Ile Val Gln Ala Thr Gly Val[0100] 1               5                   10                  15

[0101] Gly Leu His Thr Gly Lys Glu Val Thr Leu Thr Leu Arg Pro Ala Pro[0102]             20                  25                  30

[0103] Ala Asn Thr Gly Val Ile Tyr Arg Arg Thr Asp Leu Asn Pro Pro Val[0104]         35                  40                  45

[0105] Asp Phe Pro Ala Asp Ala Lys Ser Val Arg Asp Thr Met Leu Cys Thr[0106]     50                  55                  60

[0107] Cys Leu Val Asn Glu His Asp Val Arg Ile Ser Thr Val Glu His Leu[0108] 65                  70                  75               80[0109] Asn Ala Ala Leu Ala Gly Leu Gly Ile Asp Asn Ile Val Ile Glu Val[0110]                 85                  90                  95

[0111] Asn Ala Pro Glu Ile Pro Ile Met Asp Gly Ser Ala Ala Pro Phe Leu[0112]             100                 105                 110

[0113] Tyr Leu Leu Leu Asp Ala Gly Ile Asp Glu Leu Asn Cys Ala Lys Lys[0114]         115                 120                 125

[0115] Phe Val Arg Ile Lys Glu Thr Val Arg Val Glu Asp Gly Asp Lys Trp[0116]     130                 135                 140

[0117] Ala Glu Phe Lys Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Leu Asp Phe Thr Ile Asp[0118] 145                 150                 155                 160[0119] Ile Asn His Pro Ala Ile Asp Ser Ser Asn Gln Arg Tyr Ala Met Asn[0120]                 165                 170             175

[0121] Phe Ser Ala Asp Ala Phe Met Arg Gln Ile Ser Arg Ala Arg Thr Phe[0122]             180                 185                 190

[0123] Gly Phe Met Arg Asp Ile Glu Tyr Leu Gln Ser Arg Gly Leu Cys Leu[0124]         195                 200                 205

[0125] Gly Gly Ser Phe Asp Cys Ala Ile Val Val Asp Asp Tyr Gly Val Leu[0126]     210                 215                 220

[0127] Asn Glu Asp Gly Leu Arg Phe Glu Asp Glu Phe Val Arg His Lys Met[0128] 225                 230                 235                 240[0129] Leu Asp Ala Ile Gly Asp Leu Phe Met Cys Gly His Asn Ile Ile Gly[0130]                 245                 250                 255

[0131] Ala Phe Thr Ala Tyr Lys Ser Gly His Ala Leu Asn Asn Lys Leu Leu[0132]             260                 265                 270

[0133] Gln Ala Val Leu Ala Lys Gln Glu Ala Trp Glu Tyr Val Thr Phe Gln[0134]         275                 280                 285

[0135] Asp Asp Pro Glu Leu Pro Leu Ala Phe Lys Ala Pro Ser Ala Val Leu[0136]     290                 295                 300

[0137] Ala

[0138] 305

[0139] <210>  2

[0140] <211>  918

[0141] <212>  DNA

[0142] <213>  人工序列

[0143] <400>  2

[0144] atgatcaaac aaaggacact taaacgtatc gttcaggcga cgggtgtcgg tttacatacc 60[0145] ggcaaggaag tcaccctgac gttacgccct gcgccggcca acaccggggt catctatcgt 120[0146] cgcaccgact tgaatccacc ggtagatttc ccggccgatg ccaaatctgt gcgtgatacc 180[0147] atgctctgta cgtgtctggt caacgagcat gacgtacgga tttcaaccgt agagcacctc 240[0148] aatgctgctc tcgcgggctt gggcatcgat aacattgtta tcgaagttaa cgcgccggaa 300[0149] atcccgatca tggacggcag cgctgctccg tttttatacc tgctgcttga cgccggtatc 360[0150] gacgagttga actgcgccaa aaaatttgtt cgcatcaaag agactgttcg tgtcgaagat 420[0151] ggcgataagt gggctgaatt taagccgtac aatggttttt cgctggattt caccatcgat 480[0152] attaaccatc cggctattga ttccagcaac cagcgctatg cgatgaactt ctccgctgat 540[0153] gcgtttatgc gccagatcag ccgtgcgcgt acgttcggtt tcatgcgtga tatcgaatat 600[0154] ctgcagtccc gtggtttgtg cttgggcggc agcttcgatt gtgccatcgt tgttgacgat 660[0155] tatggcgtac tgaacgaaga cggcctgcgt tttgaagacg aatttgtgcg tcacaaaatg 720[0156] ctcgatgcga tcggtgactt gttcatgtgt ggtcacaata ttattggtgc atttaccgct 780[0157] tataaatccg gtcatgcact gaataacaaa ctgctgcagg ctgtcctggc gaaacaggaa 840[0158] gcctgggaat atgtgacctt ccaggacgac ccagaactgc cgttggcctt caaagcgcct 900[0159] tcagctgtac tggcataa                                               918[0160] <210>  3

[0161] <211>  305

[0162] <212>  PRT

[0163] <213>  人工序列

[0164] <400>  3

[0165] Met Ile Lys Gln Arg Thr Leu Lys Arg Ile Val Gln Ala Thr Gly Val[0166] 1               5                   10                  15

[0167] Gly Leu His Thr Gly Lys Lys Val Thr Leu Thr Leu Arg Pro Ala Pro[0168]             20                  25                  30

[0169] Ala Asn Thr Gly Val Ile Tyr Arg Arg Thr Asp Leu Asn Pro Pro Val[0170]         35                  40                  45

[0171] Asp Phe Pro Ala Asp Ala Lys Ser Val Arg Asp Thr Met Leu Cys Thr[0172]     50                  55                  60

[0173] Cys Leu Val Asn Glu His Asp Val Arg Ile Ser Thr Val Glu His Leu[0174] 65                  70                  75                  80[0175] Asn Ala Ala Leu Ala Gly Leu Gly Ile Asp Asn Ile Val Ile Glu Val[0176]                 85                  90                  95

[0177] Asn Ala Pro Glu Ile Pro Ile Met Asp Gly Ser Ala Ala Pro Phe Val[0178]             100                 105                 110

[0179] Tyr Leu Leu Leu Asp Ala Gly Ile Asp Glu Leu Asn Cys Ala Lys Lys[0180]         115                 120                 125

[0181] Phe Val Arg Ile Lys Glu Thr Val Arg Val Glu Asp Gly Asp Lys Trp[0182]     130                 135                 140

[0183] Ala Glu Phe Lys Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Leu Asp Phe Thr Ile Asp[0184] 145                 150                 155                 160[0185] Phe Asn His Pro Ala Ile Asp Ser Ser Asn Gln Arg Tyr Ala Met Asn[0186]                 165                 170                 175

[0187] Phe Ser Ala Asp Ala Phe Met Arg Gln Ile Ser Arg Ala Arg Thr Phe[0188]             180                 185                 190

[0189] Gly Phe Met Arg Asp Ile Glu Tyr Leu Gln Ser Arg Gly Leu Cys Leu[0190]         195                 200                 205

[0191] Gly Gly Ser Phe Asp Cys Ala Ile Val Val Asp Asp Tyr Arg Val Leu[0192]     210                 215                 220

[0193] Asn Glu Asp Gly Leu Arg Phe Glu Asp Glu Phe Val Arg His Lys Met[0194] 225                 230                 235                 240[0195] Leu Asp Ala Ile Gly Asp Leu Phe Met Cys Gly His Asn Ile Ile Gly[0196]                 245                 250                 255

[0197] Ala Phe Thr Ala Tyr Lys Ser Gly His Ala Leu Asn Asn Lys Leu Leu[0198]             260                 265                 270

[0199] Gln Ala Val Leu Ala Lys Gln Glu Ala Trp Glu Tyr Val Thr Phe Gln[0200]         275                 280                 285

[0201] Asp Asp Ala Glu Leu Pro Leu Ala Phe Lys Ala Pro Ser Ala Val Leu[0202]     290                 295                 300

[0203] Ala

[0204] 305

[0205] <210>  4

[0206] <211>  918

[0207] <212>  DNA

[0208] <213>  人工序列

[0209] <400>  4

[0210] atgatcaaac aaaggacact taaacgtatc gttcaggcga cgggtgtcgg tttacatacc 60[0211] ggcaagaaag tcaccctgac gttacgccct gcgccggcca acaccggggt catctatcgt 120[0212] cgcaccgact tgaatccacc ggtagatttc ccggccgatg ccaaatctgt gcgtgatacc 180[0213] atgctctgta cgtgtctggt caacgagcat gatgtacgga tttcaaccgt agagcacctc 240[0214] aatgctgctc tcgcgggctt gggcatcgat aacattgtta tcgaagttaa cgcgccggaa 300[0215] atcccgatca tggacggcag cgccgctccg tttgtatacc tgctgcttga cgccggtatc 360[0216] gacgagttga actgcgccaa aaaatttgtt cgcatcaaag agactgttcg tgtcgaagat 420[0217] ggcgataagt gggctgaatt taagccgtac aatggttttt cgctggattt caccatcgat 480[0218] tttaaccatc cggctattga ttccagcaac cagcgctatg cgatgaactt ctccgctgat 540[0219] gcgtttatgc gccagatcag ccgtgcgcgt acgttcggtt tcatgcgtga tatcgaatat 600[0220] ctgcagtccc gtggtttgtg cctgggcggc agcttcgatt gtgccatcgt tgttgacgat 660[0221] tatcgcgtac tgaacgaaga cggcctgcgt tttgaagacg aatttgtgcg tcacaaaatg 720[0222] ctcgatgcga tcggtgactt gttcatgtgt ggtcacaata ttattggtgc atttaccgct 780[0223] tataaatccg gtcatgcact gaataacaaa ctgctgcagg ctgtcctggc gaaacaggaa 840[0224] gcctgggaat atgtgacctt ccaggacgac gcagaactgc cgttggcctt caaagcgcct 900[0225] tcagctgtac tggcataa                                          918[0226] <210>  5

[0227] <211>  31

[0228] <212>  DNA

[0229] <213>  人工序列

[0230] <400>  5

[0231] gggaattcca tatgatcaaa caaaggacac t                                 31[0232] <210>  6

[0233] <211>  30

[0234] <212>  DNA

[0235] <213>  人工序列

[0236] <400>  6

[0237] cggaattcat tatgccagta cagctgaagg                                   30[0238] <210>  7

[0239] <211>  918

[0240] <212>  DNA

[0241] <213>  人工序列

[0242] <400>  7

[0243] atgatcaaac agcgtaccct gaaacgtatc gttcaggcta ccggtgttgg tctgcacacc 60[0244] ggtaaagaag ttaccctgac cctgcgtccg gctccggcta acaccggtgt tatctaccgt 120[0245] cgtaccgacc tgaacccgcc ggttgacttc ccggctgacg ctaaatctgt tcgtgacacc 180[0246] atgctgtgca cctgcctggt taacgaacac gacgttcgta tctctaccgt tgaacacctg 240[0247] aacgctgctc tggctggtct gggtatcgac aacatcgtta tcgaagttaa cgctccggaa 300[0248] atcccgatca tggacggttc tgctgctccg ttcctgtacc tgctgctgga cgctggtatc 360[0249] gacgaactga actgcgctaa aaaattcgtt cgtatcaaag aaaccgttcg tgttgaagac 420[0250] ggtgacaaat gggctgaatt taaaccgtac aacggtttct ctctggactt caccatcgac 480[0251] attaaccacc cggctatcga ctcttctaac cagcgttacg ctatgaactt ctctgctgac 540[0252] gctttcatgc gtcagatctc tcgtgctcgt accttcggtt tcatgcgtga catcgaatac 600[0253] ctgcagtctc gtggtctgtg cctgggtggt tctttcgact gcgctatcgt tgttgacgac 660[0254] tacggcgttc tgaacgaaga cggtctgcgt ttcgaagacg aatttgttcg tcacaaaatg 720[0255] ctggacgcta tcggtgacct gttcatgtgc ggtcacaaca tcatcggtgc tttcaccgct 780[0256] tacaaatctg gtcacgctct gaacaacaaa ctgctgcagg ctgttctggc taaacaggaa 840[0257] gcttgggaat acgttacctt ccaggacgac ccggaactgc cgctggcttt caaagctccg 900[0258] tctgctgttc tggcttaa                                            918