大菱鲆生长相关位点Sma-USC114及检测引物

摘要

大菱鲆生长相关位点Sma‑USC114及检测引物，属于分子生物学领域，所述位点与大菱鲆生长性能具有极其显著的相关性，用得到的引物检测与指导大菱鲆生长性状选育，从而为快速生长大菱鲆的选育工作提供科学的辅助工具。

权利要求

1.大菱鲆位点Sma-USC114在大菱鲆生长性状选育中的应用，其特征在于用引物对大菱鲆DNA进行扩增，扩增片段为154-174bp，共出现3个扩增片段，根据片段由小到大，依次命名为A、B、C，其中，具有155bp处扩增片段A的个体为快速生长个体，具有170bp处扩增片段C的个体为慢速生长个体；所述的引物序列为R:TCTATCCCCTGTTGGTGTC，F:

AAGGTTGTGAGTGTTTGGTG。

说明书

大菱鲆生长相关位点Sma-USC114及检测引物

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体地涉及大菱鲆生长相关位点Sma-USC114及检测引物。

背景技术

[0002] 近年来随着生物技术的发展，国内外学者利用分子遗传学原理和基因工程、分子标记辅助育种技术，对养殖鱼类与生长相关的功能基因进行筛选和克隆，取得了一系列成果，为进一步选育快速生长的鱼类新品种奠定了基础。其中，微卫星分子标记，因其具有多态性丰富、方法简便、快速、稳定性好等特点(徐莉等，2002)，已经被广泛应用于鱼类性状的筛选工作中。王美玉等(2012)检测半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)半同胞家系，筛选出12个与全长、体高、体重显著或极显著相关的微卫星位点；叶华等(2014)利用51个大黄鱼微卫星标记，以一个F1家系为实验材料，发现了9个与体长、体高、体质量显著或极显著相关的微卫星位点；贾志武等(2012)分析鲫微卫星标记与几个生长性状的相关性，获得了4个标记及基因型。以上所得的微卫星标记在分子辅助育种方面起到了重要的指导作用。本实验室许可等(2009)采用分群分离分析法，以同一批受精卵孵化的同池养殖大菱鲆生长性状发生分离的群体为材料,进行微卫星遗传分析,发现位点Smc09在226bp的等位基因片段与生长性状的正相关性显著，相关系数达到0.354。本实验室应用此引物进行了长期的大菱鲆快速生长品系的选育工作，取得良好效果。然而，由于不断近交，家系后代中具有此片段的大菱鲆个体越来越多，继续应用此引物评估新建家系的生长性能变得相对困难。

发明内容

[0003] 本发明要解决的技术问题是提供大菱鲆生长相关位点Sma-USC114及检测引物，所述位点与大菱鲆生长性能具有极其显著的相关性，并用得到的引物检测与指导大菱鲆生长性状选育，从而为快速生长大菱鲆的选育工作提供科学的辅助工具。

[0004] 本发明是按如下技术方案实现的：

[0005] 大菱鲆生长相关位点Sma-USC114，其与快速生长极显著正相关的155bp处扩增片段A的序列为

[0006]TAAGGTTGTGAGTGTTTGGTGGCAGGGGCTCTTCTTCTGACTCTATCTGTCTATCTGTCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCCTTCCTTCCTTCCTTGCATCCATCCAATAGATTATTCTACCTCCTTTTACTCGACACCAACAGGGGATAGA。

[0007] 大菱鲆生长相关位点Sma-USC114的检测引物，其序列为

[0008] R:TCTATCCCCTGTTGGTGTC，F:AAGGTTGTGAGTGTTTGGTG。

[0009] 本发明还提供一种大菱鲆快速生长个体的快速检测方法，包括提取大菱鲆基因组DNA，利用所述引物进行PCR扩增，退火温度55℃。

[0010] 本发明还提供一种上述位点在大菱鲆生长性状选育中的应用，利用上述引物对大菱鲆DNA进行扩增，扩增片断为154-174bp，共出现3个扩增片段，根据片段由小到大，依次命名为A、B、C，其中，具有155bp处扩增片段A的个体为快速生长个体，具有170bp处扩增片段C的个体为慢速生长个体。

[0011] 本发明与现有技术相比的有益效果：

[0012] 本发明的微卫星位点Sma-USC114与大菱鲆生长性能具有极其显著的相关性，用来检测大菱鲆生长性能，从而为大菱鲆快速生长选育工作提供科学的辅助工具。该发明所得标记与之前报道的分子标记具有以下优点：(1)该标记多态性并不十分丰富，仅仅具有三个扩增片段，检测时方便快捷。(2)该标记同时有两个扩增片段与生长性状极显著相关，155bp处扩增片段A与快速生长性状成极显著正相关性，170bp处扩增片段C与快速生长性状成极显著负相关性。(3)经过严格的二次验证，且二次验证采用的大菱鲆为相距较远的日照普通养殖群体，具有较强的说服力。(4)对155bp处扩增片段A进行切胶回收，克隆测序，将测序结果通过NCBI数据库BLAST比对，证实该片段序列和大菱鲆发布的基因组一段高度吻合，同源性达到97％，基因登陆号为DQ810914.1，使得该标记更具有研究意义，并且在快速生长个体鉴定中更具科学性；鱼类的生长性状作为数量性状，可量可测，验证方便，对实际生产的增产增收具有重要意义。因此研究与快速生长性状相关的标记具有重要价值。

附图说明

[0013] 下面通过实施例结合附图详细叙述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

[0014] 图1：300条F3同一家系大菱鲆体长的正态分布图谱，偏度系数为-0.715，峰度系数为0.141，两个系数都小于1，可认为近似于正态分布；

[0015] 图2：300条F3同一家系大菱鲆体重的正态分布图谱：偏度系数为-0.166，峰度系数为0.175，两个系数都小于1，可认为近似于正态分布；

[0016] 图3：Sma-USC114引物对F3同一家系大菱鲆60个个体PCR扩增结果图谱；图中，M：50bp Maker，A为Sma-USC114的扩增片段A，C为扩增片段C

[0017] 图4：300条日照同龄同池孵化喂养的普通养殖大菱鲆体长的正态分布图谱，偏度系数为0.005，峰度系数为0.349，两个系数都小于1，可认为近似于正态分布；

[0018] 图5：300条日照同龄同池孵化喂养的普通养殖大菱鲆体重的正态分布图谱，偏度系数为-0.255，峰度系数为-0.684，两个系数都小于1，可认为近似于正态分布；

[0019] 图6：Sma-USC114引物对日照普通养殖群体大菱鲆60个个体PCR扩增结果图谱，图中M：50bp Maker，A为Sma-USC114的扩增片段A，C为扩增片段C。

具体实施方式

[0020] 实施例1

[0021] 利用所述引物对大菱鲆样品DNA进行PCR扩增，所述的Sma-USC114引物序列如下：R:TCTATCCCCTGTTGGTGTC，F:AAGGTTGTGAGTGTTTGGTG

[0022] 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

[0023] 所述的PCR反应体系：

[0024] 15μl体系如下：包括10×buffer 1.3μl、dNTP 1.1μl、上下游引物各0.7μl、模板DNA 1.0μl、ddH2O 10μl，rTaq酶0.2μl。

[0025] PCR反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，复性温度根据引物退火温度设定，退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。

[0026] 所述变性反应程序：95℃5min，在PCR每个样品中加入4.5μl的变性buffer，它包括甲酰胺，0.5×EDTA，溴酚蓝，二甲苯氰化。

[0027] 所述聚丙烯酰胺凝胶电泳技术：

[0028] PAGE胶的制备包括：8％丙烯酰胺40ml，它包括尿素，硼酸，Tris碱，EDTA，PAGE，ddH2O；1％过硫酸铵溶液400μl；TEMED 40μl。

[0029] 电泳程序：电泳仪(DYY-10C)电压500V，电流60mA，功率30W，电泳2-3h。

[0030] PCR产物的检测：将PCR变性后产物在浓度为8％变性聚丙烯酰胺凝胶中，30W恒功率电泳。将带有PAGE胶的板放入AgNO3溶液轻摇染色，超纯水快速冲洗胶板；把胶板转移到氢氧化钠与甲醛混合而成的显色液中轻摇至带纹出现；用超纯水清洗玻璃板两次；将胶板置于室温下自然干燥；终反应即得到PCR结果图谱，收集数据，用SPSS16.0软件分析等位基因与生长性状的相关性。结果发现：155bp处扩增片段A与快速生长性状成极显著正相关性，170bp处扩增片段C与快速生长性状成极显著负相关。通过切胶回收，克隆测序获得Sma-USC114位点的扩增片段A的基因序列为：

[0031] TAAGGTTGTGAGTGTTTGGTGGCAGGGGCTCTTCTTCTGACTCTATCTGTCTATCTGTCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCCTTCCTTCCTTCCTTGCATCCATCCAATAGATTATTCTACCTCCTTTTACTCGACACCAACAGGGGATAGA

[0032] 实施例2大菱鲆生长快组与生长慢组的挑选

[0033] 取2013年于烟台构建的快速生长品系F3的一个同池饲养的8月龄大菱鲆家系，测量记录此家系中300尾大菱鲆的体长、体重数据，建立体长、体重正态分布图，见图1和图2，舍去90％的体长与体重的中间类型，最终确定应用此家系中体长大于19cm，且体重高于144g的个体构建F(fast)组；体长小于10cm，且体重低于78g的个体构建S(slow)组。两个组各取30尾，活体运回实验室，剪取尾鳍，提取DNA，保存于-20℃中。以备用于生长快与生长慢个体进行SSR分析。

[0034] (1)PCR反应：

[0035] 15μl体系如下：包括10×buffer 1.3μl、dNTP 1.1μl、上下游引物(R:TCTATCCCCTGTTGGTGTC，F:AAGGTTGTGAGTGTTTGGTG)

[0036] 各0.7μl、模板DNA 1.0μl、ddH2O 10μl，rTaq酶0.2μl。

[0037] PCR反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，复性温度(视具体引物Tm值定)退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。反应结束后，进行变性，变性反应程序：95℃5min。在PCR每个样品中加入4.5μl的变性buffer，它包括甲酰胺，0.5×EDTA，溴酚蓝，二甲苯氰化。

[0038] (2)SSR差异扩增片段的检测

[0039] 变性结束后，应用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术呈现结果，见图3，根据胶体上出现片段由小到大，分别命名为A、B、C，对比F组与S组中出现频率差距较大的扩增片段，收集数据。

[0040] (3)差异扩增片段的统计分析

[0041] 使用SPSS采用卡方检验对SSR位点在生长快速组和生长慢速组中的出现频率差距较大的扩增片段进行分析。进行皮尔逊检验(Pearson correlation)对差异扩增片段与大菱鲆生长性状进行相关性分析。结果如下表1-表2

[0042] 表1位点Sma-USC114在大菱鲆F组和S组中差异扩增片段的频率分布

[0043]

[0044] 注：F：生长快组；S：生长慢组

[0045] 表2SSR位点扩增片段与大菱鲆生长性状的相关性分析

[0046]

[0047] 实施例3二次实验验证

[0048] 为扩大此标记的应用范围，二次验证大菱鲆为日照养殖场同池孵化饲养的普通养殖群体8月龄大菱鲆，测量其中300尾的体长与体重，建立体长与体重的正态分布图，见图4和图5，去除90％体长与体重中间型个体，同第2节。最终确定将体长大于17cm，且体重高于140g的个体命名为F(fast)组；体长小于9cm，且体重低于65g的命名为S(slow)组。以此为标准，两个组各取30尾，活体运回实验室，剪取尾鳍，提取DNA，保存于-20℃中。以备SSR分析。

[0049] (1)PCR反应：

[0050] 提取F组和S组样本的DNA进行PCR扩增，所述的PCR反应体系：15μl体系包括10×buffer 1.3μl、dNTP 1.1μl、上下游引物各0.7μl、模板DNA 1.0μl、ddH2O 10μl，rTaq酶0.2μl。

[0051] PCR反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，复性温度根据引物Tm设定退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。反应结束后，进行变性反应，变性反应程序：95℃5min，在PCR每个样品中加入4.5μl的变性buffer。

[0052] (2)SSR差异扩增片段的检测

[0053] 变性结束后，应用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术呈现结果，见图6，收集数据。

[0054] (3)差异扩增片段统计分析

[0055] 使用SPSS采用卡方检验对SSR位点155bp处扩增片段A与170bp处扩增片段C进行二次验证。进行皮尔逊检验(Pearson correlation)对差异两个扩增片段与大菱鲆生长性状进行相关性分析，结果如下表3-表4。

[0056] 表3二次验证位点Sma-USC114差异扩增片段的频率分布

[0057]

[0058]

[0059] 注：F：生长快组；S：生长慢组

[0060] 表4二次验证SSR位点扩增片段与大菱鲆生长性状的相关性分析

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