儿童活动性结核病蛋白特征谱及其构建方法

摘要

本发明公开了一种儿童活动性结核病蛋白特征谱及其构建方法。本发明通过比较活动性结核病组与健康对照组蛋白质组学差异，获得儿童活动性结核病的蛋白特征谱。此外，本发明还涉及儿童活动性结核病蛋白特征谱的构建方法，利用相对和绝对定量的非标记串联质谱技术，能有效地对血浆里的蛋白进行鉴定和相对定量，采用该技术能获得儿童活动性结核病人血浆中的蛋白表达差异质谱。本发明所发现的一系列蛋白质为寻找新的更理想的标志物提供了基础和资源；与以往的血浆学检测方法比较具有较高的敏感性和特异性，并能用于筛选儿童活动性结核病的药物中；本发明同时也为探索疾病发生发展的机制提供了新的思路。

权利要求

1.一种非诊断目的的儿童活动性结核病相关蛋白特征谱的构建方法，包括如下步骤：

分别从儿童活动性结核病患者组和健康对照儿童组的离体血浆中提取总蛋白，用胰蛋白酶进行酶解，对酶解所得多肽进行液相色谱-电喷雾电离串联质谱检测和相对定量分析，根据分析结果获得儿童活动性结核病相关蛋白特征谱；

所述儿童活动性结核病相关蛋白特征谱中，所述儿童活动性结核病患者组和所述健康对照儿童组中表达差异的蛋白质包括表达上调的蛋白质和表达下调的蛋白质；所述表达上调的蛋白质有PTCD3、ADAMTSL2、HTT、SNX4、VPS37B、RANBP17、UBE2O、VWDE、MCM4、ZC3H11A、WIZ、CCDC81、DSP、MMP2、GEMIN5、SPIRE2、PC、ADCY3、LIMS2、WWC1、RP1、ADAM18、AARSD1、PCSK6、ST3GAL4、ZNF584、ZMYM1、XB、LRRK2、SOCS5、RASAL3、SMC3、ATP10A、KDM1A、TTLL10、HERC6、PCCA、C1QTNF1、NUP88、SORBS1、NKD2、PIWIL4、AKAP2、SYNM、NPM1、HP、NOS1、NLRP14、SKIV2L、ICE1、ASAP2、ABAT、ORM1、CASK、SPECC1、NIPBL、DOCK11、CACTIN、ZNF526、SYNRG、FANCD2、PLXNC1、SPATA31D1、FBXO46、PSG3、BMPR2、DKFZp434A2017、KIF4A、COX10、ARHGDIG、RASAL2、MYH7、RFC1、DOCK5、ATP11A、ANKRD27、ZNF521、ZNF281、DLL1、TBL3、MYH14、EML4、CLTCL1、PRRC2C、TSTD2、C1orf94、NSD1、GPR137B、FRMPD2、ANKRD33B、SIN3A、TAS1R1、KIF3C、CYP26B1、HERC2、DCAF12L2、CCDC15、SP140、ABCC12、WDR91、SEC31A、GTPBP3、TLR4、CHMP4B、HECW1、CP、C16orf71、PPP2R5D、COL13A1、ZBTB10、ZNF311、PINLYP、AIM2、KCNMB3、HAL、MTHFD1、ALPP、PPP1R9A、IFT81、DDX60、CCDC71、RNF152、UBR4、ASH1L、CORO1C、ACAN、NARG1L、ZNF831、ABCA2、HCFC1、REXO1、TRIP12、PCNT、CAD、AK3、GUSB、SERPINA1、MTUS2、ZNF606、ARAP3、DZIP1、POLR3C、NLRP13、IFNA14、DNAH7、GPAM、SAMD9L、LMO3、USP11、RASGRF2、TATDN2、DCAF17、POFUT2、LAMA2、AXIN2、AP2A2、KIAA1033、HPS6、SORT1、TNPO3、NHLRC1、ADAM15、SLC25A41、CLEC14A、SERPINA3、DRG2、SYCP1、MRPS18B、ATP12A、SERPING1、MACF1、RSAD1、VPS13D、TTC3、RIMS1、GRK6、SP110、SOWAHC、HDGFRP3、POLR2A、C10orf76、INTS2、PROZ、MYO7B、TRMT1、ARHGEF1、LCE3A、SLC38A10、A2M、PAMR1、MCM5、ANK2、KLK8、PRG4、ZMYM3、PPP2R1B、TSSK4、INPP5B、SKIL、ZNF543、SLCO3A1、ATR、MID2、ZFP57、TICRR、XRCC4、SPTBN2、AHCTF1、C2CD3、ZC3H12B、LOX、PLOD3、ACACB、SDK2、C9orf85、CASP8、PLAA、KAT8、UTRN、MROH8、DMTN、SAA1、NRXN2、LEPREL4、SMC5、SPATA31C1、SAMHD1、PIAS3、L1CAM、JADE1、PKD1L1、MDC1、FAT2、PSD4、TAP1、CEP290、TTC28、ABCA7、LONP2、RGAG1、TAB2和TRPM5；所述表达下调的蛋白质有KIAA1211、CGN、DDAH1、HHIP、CLIC3、PPP6C、PNN、PRPF8、KIT、GLMN、CCDC89、DNAH14、COL6A2、GFRA1、PRPF6、KIAA0319、ATP13A1、PHKG2、COL7A1、TRIP6、TRIM14、DNAJC1、PHLDB3、ICA1、PRPF4B、TFAP4、LACTB、CEP63、MYO19、ARHGAP19、ANKRD17、EYS、PRDM9、TIGD5、ECHDC3、RHBDF1、GLG1、TMEM141、TNS1、GDPD3、LYST、HRH3、HBD、MZF1、FLYWCH1、OVOL2、HSPA5、ZNF30、ZNF492、FRAT1、AHSG、PIK3R6、KANSL1、MUC12、ESCO1、MIEF1、CACNA1E、DPYSL3、CHD7、ADCY9、EIF5、DDX31、RIT1、TECTA、RAB3GAP2、APOC3、RNF144B、SF3B4、ZNF709、EVC2、RB1CC1、MYH13、TIAM2、SEMA4A、COBLL1、UHRF1BP1L、SPTAN1、BCOR、SMG1、DPYD、RNASE4、PCCB、WDR62、BRD4、RBM26、DOPEY2、ZMYM5、RAB11FIP1、INADL、ZNF19、WNK1、WDR46、DAOA、ADIPOQ、F11、GOLGA4、ALK、TANGO6、BCL9L、COL4A1、CLEC2B、PDLIM1、CD22、EFNB2、COL8A2、NXF2、RNF180、ADAMTSL3、TTI2、LRP4、CDC37、CHD6、OCRL、ANO7、GBA2、PCF11、AGO3、CPT2、KMT2A、RASA3、ZNF431、CHIC1、ISCA2、BRINP1、MTO1、CASP2、MKI67、CNTRL、RPP40、DOK3、KRT82、FNDC1、WFDC5、KRT12、PTGDR2、BEND2和ZNF225；

所述液相色谱-电喷雾电离串联质谱检测过程中，色谱为毛细管高效液相色谱，色谱条件如下：色谱柱的填料为反向碳18，内径为150μm，柱长100mm，流动相由A液和B液组成，所述A液为含有体积百分含量为2％的乙腈和体积百分含量为0.1％的甲酸的水溶液，B液为含有体积百分含量为84％的乙腈和体积百分含量为0.1％的甲酸的水溶液；采用所述A液和所述B液按照如下进行梯度洗脱：0min-100min，所述流动相中所述B液的体积百分含量由0％匀速增加至45％；100min-108min，所述流动相中所述B液的体积百分含量由45％匀速增加至

100％；108min-120min，所述流动相中所述B液的体积百分含量维持在100％；流速为400nl/min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述相对定量分析过程中，利用Trans-Proteomic Pipeline软件提取一级质谱定量信息，利用ProfileAnalysis2.0软件进行定量，并利用ProteinScape2.1软件进行数据检索和整合，筛选出比值＞2的蛋白为表达上调的蛋白，比值<0.5的蛋白为表达下调的蛋白，所述比值为所述儿童活动性结核病患者组的蛋白表达量与所述健康对照儿童组的蛋白表达量的比值。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述液相色谱-电喷雾电离串联质谱检测过程中，质谱条件如下：分析时长为120min，检测方式为正离子，母离子扫描范围为300-

1800m/z，多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照每次全扫描后采集10个碎片图谱的方式采集，MS1在M/Z 200时分辨率为70000，MS2在M/Z 200时分辨率为17500。

说明书

儿童活动性结核病蛋白特征谱及其构建方法

技术领域

[0001] 本发明属于蛋白质组学领域，涉及一种儿童活动性结核病蛋白特征谱及其构建方法。

背景技术

[0002] 结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的当今世界上最普遍的传染病之一，是当前导致发展中国家儿童死亡的重要疾病之一。据估计，结核病患儿已占全球结核病人总数的10％-15％，且该比率在结核病高发国家和地区如非洲更高。我国作为结核病高发国家之一，0-14岁儿童结核感染率为9.0％，活动性结核病患病率为91.8/10万。随着近年来耐药结核杆菌的流行以及HIV病毒感染的增多，儿童结核病出现明显回升趋势。因此，加强儿童结核病的早期诊断已经成为儿童结核病控制工作亟待解决的问题。

[0003] 儿童结核病长期面临诊断困难的问题。首先，儿童结核病通常细菌载量较低，咳嗽反射和气管纤毛运动能力差，常常合并肺外结核而导致痰涂片阳性率很低。结核病患儿发病早期临床症状尚不明显时，实验室不能及时提供准确的病原学诊断结果，常常延误诊断，不能准确的选择有效药物，易引起病情恶化，失去抢救的最佳时机。免疫力低下、使用过免疫抑制剂以及患有严重结核病的患儿，由于机体免疫应答减弱，常规免疫学诊断方法常常出现假阴性，对早期诊断和预防治疗造成不良影响。

[0004] 结核菌素皮试(PPD试验)是目前诊断结核病的重要辅助手段，但由于PPD是多种抗原的混合物，所含抗原为致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌及卡介苗菌株所共有，其结果受到卡介苗接种及其他分枝杆菌感染的影响，特异度较差，常可导致假阳性结果。当患儿出现免疫功能低下时可出现假阴性结果。PPD试验诊断的特异度和敏感度还受其阳性判断标准的影响，且目前国内PPD试验在儿童潜伏结核感染诊断中的标准尚不统一，从而给临床医师的诊断带来一定的困难。

[0005] γ干扰素释放试验作为一种新型的免疫学诊断方法已在欧美等国广泛应用于结核病、结核性脑膜炎、结核病疗效评估等的常规诊断。由于该试验结果不受卡介苗接种的影响，因此尤其适用于卡介苗接种率较高的人群。但目前关于该实验在儿童结核病诊断中的准确性研究结论尚不一致。有研究认为γ干扰素释放试验不受小年龄的影响，在儿童中具有较好的敏感度。而有的研究则认为该试验即使在细菌培养阳性的儿童中，其敏感度也很低，不适用于在儿童中作为一种常规的诊断方法，因此，探索新的适于儿童的诊断方法，达到早期诊断早期治疗的目的势在必行。

[0006] 蛋白质组学是在1994年由Williams和Wilkins提出的，通过寻找特异性蛋白质，为研究疾病机制提供线索。近年来随着人类蛋白质组学计划的全面启动，蛋白质组学的研究也产生了巨大进展，蛋白质组学研究中应用的定量方法主要有两种，一种是基于传统双向凝胶电泳及染色基础上的定量，另外一种是基于质谱检测技术的定量，包括标记定量技术(iTRAQ)和非标记定量技术(Label free quantification)两种。非标记定量技术不需要昂贵的同位素标签做内部标准，实验耗费低；对样本的操作也最少，从而使其最接近原始状态；并且不受样品条件的限制，克服了标记定量技术在对多个样本进行定量方面的缺陷，因此它在定量蛋白质组学研究中受到了众多科学工作者的推崇，得到了越来越广泛的应用。

[0007] 近年来，蛋白质组学技术用于疾病诊断的研究已日趋广泛，该技术通过对机体病理改变引起的蛋白质产物的变化进行分析，运用化学计量学方法对疾病组和正常组进行辨识，寻找疾病相关的生物标志物，并用于临床诊断。该诊断技术克服了传统医学诊断模式的诊断准确率低、诊断指标单一、对专家诊疗水平依赖性强、治疗模式缺乏个体化等缺陷，充分利用蛋白质组学产物进行系统分析，对各个状态都作出更准确和客观的评价，大大提高诊断的科学化、定量化，并避免人为因素的误诊。

发明内容

[0008] 本发明的一个目的是提供一种非诊断目的的儿童活动性结核病相关蛋白特征谱的构建方法。

[0009] 本发明所提供的非诊断目的的儿童活动性结核病相关蛋白特征谱的构建方法，具体可包括如下步骤：分别从儿童活动性结核病患者组和健康对照儿童组的离体血浆中提取总蛋白，用胰蛋白酶进行酶解，对酶解所得多肽进行液相色谱-电喷雾电离串联质谱检测和相对定量分析，根据分析结果获得儿童活动性结核病相关蛋白特征谱；

[0010] 所述儿童活动性结核病相关蛋白特征谱中，所述儿童活动性结核病患者组和所述健康对照儿童组中表达差异的蛋白质包括表达上调的蛋白质和表达下调的蛋白质；所述表达上调的蛋白质有实施例表2中的前242种蛋白(即如上所述PTCD3至所述TRPM5)；所述表达下调的蛋白质有实施例表2中的后137种蛋白(即如上所述KIAA1211至所述ZNF225)。

[0011] 其中，在提取总蛋白之后，还可包括去除高丰度蛋白、进行蛋白浓度测定的步骤。

[0012] 在所述方法中，所述相对定量分析过程中，利用Trans-Proteomic Pipeline软件提取一级质谱定量信息，利用ProfileAnalysis2.0软件进行定量，并利用ProteinScape2.1软件进行数据检索和整合，筛选出比值＞2的蛋白为表达上调的蛋白，比值<0.5的蛋白为表达下调的蛋白，所述比值为所述儿童活动性结核病患者组的蛋白表达量与所述健康对照儿童组的蛋白表达量的比值。

[0013] 其中，所述利用ProteinScape2.1软件进行数据检索和整合具体为：以Peptide FDR≤0.05对数据进行筛选过滤，导入Maxquant软件进行Label free分析。主要参数如下：

[0014] Main search ppm：6Missed cleavage：2

[0015] MS/MS tolerance ppm：20De-Isotopic：TRUE

[0016] enzyme：Trypsin database：ipi.human.3.87.fasta

[0017] Fixed modification：Carbamidomethyl(C)

[0018] Variable modification：Oxidation(M)，Acetyl(Protein N-term)

[0019] Decoy database pattern：reverse

[0020] Lable free quantification(LFQ)：TRUE

[0021] LFQ min ratio count：2

[0022] Match between runs：2min

[0023] Peptide FDR：0.05

[0024] Protein FDR：0.05

[0025] 在所述方法中，所述液相色谱-电喷雾电离串联质谱检测过程中，质谱条件如下：分析时长为120min，检测方式为正离子，母离子扫描范围为300-1800m/z，多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照每次全扫描后采集10个碎片图谱的方式采集，MS1在M/Z200时分辨率为70000，MS2在M/Z 200时分辨率为17500。

[0026] 在所述方法中，所述液相色谱-电喷雾电离串联质谱检测过程中，色谱为毛细管高效液相色谱，色谱条件如下：色谱柱的填料为反向碳18，内径为150μm，柱长100㎜(如Thermo EASY column SC200150μm*100mm(RP-C18))，流动相由A液和B液组成，所述A液为含有2％(体积分数)乙腈和0.1％(体积分数)甲酸的水溶液，B液为含有84％(体积分数)乙腈和0.1％(体积分数)甲酸的水溶液。采用所述A液和所述B液按照如下进行梯度洗脱：0min-
100min，所述流动相中所述B液的体积百分含量由0％匀速增加至45％；100min-108min，所述流动相中所述B液的体积百分含量由45％匀速增加至100％；108min-120min，所述流动相中所述B液的体积百分含量维持在100％；流速为400nl/min。

[0027] 本发明的还一个目的是提供一种非诊断目的的儿童活动性结核病相关蛋白特征谱。

[0028] 本发明所提供的非诊断目的的儿童活动性结核病相关蛋白特征谱中差异表达的蛋白质为表达上调的蛋白质和表达下调的蛋白质；所述表达上调的蛋白质有实施例表2中的前242种蛋白(即如上所述PTCD3至所述TRPM5)；所述表达下调的蛋白质有实施例表2中的后137种蛋白(即如上所述KIAA1211至所述ZNF225)。

[0029] 其中，所述表达上调的蛋白质为与健康对照儿童组相比，在儿童活动性结核病患者组中表达上调的蛋白质；所述表达下调的蛋白质为与健康对照儿童组相比，在儿童活动性结核病患者组中表达下调的蛋白质。

[0030] 本发明的再一个目的是提供一种用于检测如下379种蛋白表达量的成套产品在制备筛查儿童活动性结核病患者(即鉴定或辅助鉴定待测儿童是否为儿童活动性结核病患者)的系统中的应用：

[0031] PTCD3、ADAMTSL2、HTT、SNX4、VPS37B、RANBP17、UBE2O、VWDE、MCM4、ZC3H11A、WIZ、CCDC81、DSP、MMP2、GEMIN5、SPIRE2、PC、ADCY3、LIMS2、WWC1、RP1、ADAM18、AARSD1、PCSK6、ST3GAL4、ZNF584、ZMYM1、XB、LRRK2、SOCS5、RASAL3、SMC3、ATP10A、KDM1A、TTLL10、HERC6、PCCA、C1QTNF1、NUP88、SORBS1、NKD2、PIWIL4、AKAP2、SYNM、NPM1、HP、NOS1、NLRP14、SKIV2L、ICE1、ASAP2、ABAT、ORM1、CASK、SPECC1、NIPBL、DOCK11、CACTIN、ZNF526、SYNRG、FANCD2、PLXNC1、SPATA31D1、FBXO46、PSG3、BMPR2、DKFZp434A2017、KIF4A、COX10、ARHGDIG、RASAL2、MYH7、RFC1、DOCK5、ATP11A、ANKRD27、ZNF521、ZNF281、DLL1、TBL3、MYH14、EML4、CLTCL1、PRRC2C、TSTD2、C1orf94、NSD1、GPR137B、FRMPD2、ANKRD33B、SIN3A、TAS1R1、KIF3C、CYP26B1、HERC2、DCAF12L2、CCDC15、SP140、ABCC12、WDR91、SEC31A、GTPBP3、TLR4、CHMP4B、HECW1、CP、C16orf71、PPP2R5D、COL13A1、ZBTB10、ZNF311、PINLYP、AIM2、KCNMB3、HAL、MTHFD1、ALPP、PPP1R9A、IFT81、DDX60、CCDC71、RNF152、UBR4、ASH1L、CORO1C、ACAN、NARG1L、ZNF831、ABCA2、HCFC1、REXO1、TRIP12、PCNT、CAD、AK3、GUSB、SERPINA1、MTUS2、ZNF606、ARAP3、DZIP1、POLR3C、NLRP13、IFNA14、DNAH7、GPAM、SAMD9L、LMO3、USP11、RASGRF2、TATDN2、DCAF17、POFUT2、LAMA2、AXIN2、AP2A2、KIAA1033、HPS6、SORT1、TNPO3、NHLRC1、ADAM15、SLC25A41、CLEC14A、SERPINA3、DRG2、SYCP1、MRPS18B、ATP12A、SERPING1、MACF1、RSAD1、VPS13D、TTC3、RIMS1、GRK6、SP110、SOWAHC、HDGFRP3、POLR2A、C10orf76、INTS2、PROZ、MYO7B、TRMT1、ARHGEF1、LCE3A、SLC38A10、A2M、PAMR1、MCM5、ANK2、KLK8、PRG4、ZMYM3、PPP2R1B、TSSK4、INPP5B、SKIL、ZNF543、SLCO3A1、ATR、MID2、ZFP57、TICRR、XRCC4、SPTBN2、AHCTF1、C2CD3、ZC3H12B、LOX、PLOD3、ACACB、SDK2、C9orf85、CASP8、PLAA、KAT8、UTRN、MROH8、DMTN、SAA1、NRXN2、LEPREL4、SMC5、SPATA31C1、SAMHD1、PIAS3、L1CAM、JADE1、PKD1L1、MDC1、FAT2、PSD4、TAP1、CEP290、TTC28、ABCA7、LONP2、RGAG1、TAB2、TRPM5、KIAA1211、CGN、DDAH1、HHIP、CLIC3、PPP6C、PNN、PRPF8、KIT、GLMN、CCDC89、DNAH14、COL6A2、GFRA1、PRPF6、KIAA0319、ATP13A1、PHKG2、COL7A1、TRIP6、TRIM14、DNAJC1、PHLDB3、ICA1、PRPF4B、TFAP4、LACTB、CEP63、MYO19、ARHGAP19、ANKRD17、EYS、PRDM9、TIGD5、ECHDC3、RHBDF1、GLG1、TMEM141、TNS1、GDPD3、LYST、HRH3、HBD、MZF1、FLYWCH1、OVOL2、HSPA5、ZNF30、ZNF492、FRAT1、AHSG、PIK3R6、KANSL1、MUC12、ESCO1、MIEF1、CACNA1E、DPYSL3、CHD7、ADCY9、EIF5、DDX31、RIT1、TECTA、RAB3GAP2、APOC3、RNF144B、SF3B4、ZNF709、EVC2、RB1CC1、MYH13、TIAM2、SEMA4A、COBLL1、UHRF1BP1L、SPTAN1、BCOR、SMG1、DPYD、RNASE4、PCCB、WDR62、BRD4、RBM26、DOPEY2、ZMYM5、RAB11FIP1、INADL、ZNF19、WNK1、WDR46、DAOA、ADIPOQ、F11、GOLGA4、ALK、TANGO6、BCL9L、COL4A1、CLEC2B、PDLIM1、CD22、EFNB2、COL8A2、NXF2、RNF180、ADAMTSL3、TTI2、LRP4、CDC37、CHD6、OCRL、ANO7、GBA2、PCF11、AGO3、CPT2、KMT2A、RASA3、ZNF431、CHIC1、ISCA2、BRINP1、MTO1、CASP2、MKI67、CNTRL、RPP40、DOK3、KRT82、FNDC1、WFDC5、KRT12、PTGDR2、BEND2和ZNF225。所述379种蛋白在NCBI上的GI编号如实施例中表2所示。

[0032] 本发明的另一个目的是提供一种筛查儿童活动性结核病患者的系统。

[0033] 本发明所提供的筛查儿童活动性结核病患者的系统，包括用于检测所述379种蛋白表达量的成套产品。

[0034] 在所述应用和所述系统中，所述成套产品包括用于从离体血浆中进行总蛋白抽提所需的试剂和/或仪器，以及胰蛋白酶和液相色谱-电喷雾电离串联质谱仪。根据需要，所述成套产品还可包括去除高丰度蛋白和/或进行蛋白浓度测定所需的试剂和/或仪器。其中，所述高丰度蛋白主要为白蛋白和IgG。

[0035] 在所述应用和所述系统中，所述筛查儿童活动性结核病患者的系统包括蛋白质表达量数据处理装置，所述蛋白质表达量数据处理装置具有如下功能：分别比较取自待测儿童和健康对照儿童的离体血浆中的所述379种蛋白的表达量，根据比较结果确定待测儿童是否为儿童活动性结核病患者。

[0036] 所述蛋白质表达量数据处理装置中内设模块；所述模块用于分别比较取自待测儿童和健康对照儿童的离体血浆中的所述379种蛋白的表达量；

[0037] 所述根据比较结果确定待测儿童是否为儿童活动性结核病患者，具体为：若所述待测儿童的离体血浆样本中前242种蛋白(即如上所述PTCD3至所述TRPM5)与所述健康对照儿童相比上调，且所述待测儿童的离体血浆样本中后137种蛋白(即如上所述KIAA1211至所述ZNF225)与所述健康对照儿童相比下调，则所述待测儿童为或候选为儿童活动性结核病患者；反之，则所述待测儿童不为或候选不为儿童活动性结核病患者。其中，“上调”体现为比值＞2，“下调”体现为比值<0.5，所述比值为某一蛋白在所述儿童活动性结核病患者中的表达量与在所述健康对照儿童组中的表达量的比值。

[0038] 在本发明中，所述儿童的年龄为3个月-16岁。

[0039] 本发明检测儿童活动性结核病蛋白质组学产物，可用于建立血浆特征代谢产物模型以及应用于在儿童活动性结核病早期检测和筛查，本发明的模型，可用于儿童活动性结核病的早期检测和筛查。本发明与其它儿童活动性结核病的检测方法比较，具有以下优点：

[0040] 第一，本发明采用非标记定量蛋白质组学方法对儿童活动性结核病患者与正常人血浆的检测，并采用了传统统计学与现代生物信息学方法相结合的方法进行数据处理，从而得到儿童活动性结核病患者和健康儿童血浆蛋白质质谱检测模型，并且所发现的一系列蛋白质为寻找新的更理想的标志物提供了基础和资源。

[0041] 第二，与以往的血浆学检测方法比较具有较高的敏感性和特异性，并能用于筛选儿童活动性结核病的药物中。

[0042] 第三，本发明模型的构建方法设计合理可行，为提供儿童活动性结核病的临床治愈率提供了新的筛查方法，同时也为探索疾病发生发展的机制提供了新的思路。

[0043] 第四，本发明检测方法结果准确，可对儿童活动性结核病做诊断，尽早对病人治疗。

附图说明

[0044] 图1为蛋白质含量测定标准曲线图。

具体实施方式

[0045] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0046] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0047] 实施例1、儿童活动性结核病蛋白特征谱的建立

[0048] 1、样本和仪器

[0049] 39例选自年龄为3个月-16岁的儿童血浆样本，其中19例为儿童活动性结核病患者血浆，另外20例为健康儿童血浆，儿童活动性结核病患者均有实验室及临床诊断报告确定。所有的血浆样本均在清晨空腹下抽取，分离血浆后储存在-80低温冰箱中。

[0050] 实验用仪器是液相色谱-电喷雾电离串联质谱(Q-Exactive Thermo Finnigan)，电泳仪(Bio-rad,美国)，MultiSkans酶标仪(Thermo,美国)，白蛋白/IgG去除试剂盒购自德国Merck公司。

[0051] 2、蛋白质提取

[0052] 采用默克公司的ProteoExtract Albumin/IgG Removal Kit去除样本中的高丰度蛋白。去高速离心后的血浆样本50μL，在冰上按使用说明书操作处理，处理后的样本体积1800μL。

[0053] 由于样本经过去除高丰度蛋白处理后，浓度被稀释了300倍，因此需要对样本进行浓缩处理。1800μL处理后的样本加入8mL-20℃预冷丙酮，沉淀过夜。6000g离心后，弃去上清，晾干丙酮后，用100μL溶解液(7M尿素和2M硫脲)溶解沉淀。溶解后的样本4℃下40000g离心30min，待用。

[0054] 3、蛋白质定量

[0055] A.方法

[0056] (1)开分光光度计预热20min，选择“光度测量”，调节λ＝595nm。

[0057] (2)用CK(2μL裂解缓冲液+18μL ddH2O+1ml Bradford)进行调零三次。(要点：第一次按“Zero”即可，观察第二、三次的OD值，如果都很小且相差不大即可。调零完毕后，显示“-0.301Abs”。)

[0058] (3)配置表1中的各牛血清标准蛋白溶液并测定OD595值，绘制标准曲线。

[0059] (4)测B2(2μL BSA+18μL ddH2O+1ml Bradford)、B5(5μL BSA+15μL ddH2O+1ml Bradford)、B8(8μL BSA+12μL ddH2O+1ml Bradford)各三管，用于确定校正系数，校正蛋白浓度。其中，标准曲线计算方法为：在excel表格中，一列蛋白质浓度，一列对应OD值，插入图标，选择折线图，选项中选择显示R值和公式。

[0060] 注：BSA为牛血清标准蛋白；要点：所有管加好BSA和ddH2O后，加一管Bradford，测一管；动作要领“三摇一拍”；读值为放入比色皿1s后的第一个值；如有数值异常可舍弃读值或多做一次重复。

[0061] (5)测样品蛋白OD595值。操作同上。将OD595值代入标准曲线方程，得到蛋白浓度测定值，进而计算实际蛋白浓度，实际蛋白浓度＝蛋白浓度测定值×校正系数。

[0062] 表1牛血清标准蛋白溶液的设置及OD595值测定结果

[0063]BSA体积(μL) OD1 OD2 OD3 OD4 OD5 平均值 理论浓度(μg/μl)
1 0.06 0.07 0.077 0.069 0.07 0.0692 0.5
2 0.135 0.124 0.133 0.128 0.132 0.1304 1
3 0.196 0.2 0.195 0.19 0.191 0.1944 1.5
4 0.256 0.244 0.244 0.242 0.256 0.2484 2
5 0.304 0.304 0.304 0.302 0.312 0.3052 2.5
6 0.35 0.348 0.354 0.352 0.354 0.3516 3
7 0.406 0.403 0.406 0.408 0.42 0.4086 3.5
8 0.467 0.482 0.483 0.488 0.492 0.4824 4

[0064]9 0.533 0.532 0.534 0.535 0.54 0.5348 4.5
10 0.577 0.575 0.575 0.574 0.583 0.5768 5

[0065] 注：OD1-OD5为五个重复。

[0066] B.结果

[0067] 根据表1测定结果，得到标准曲线方程为y＝8.7949x-0.1539，R2＝0.9985。其中，x为OD595，y为蛋白浓度。具体见图1。

[0068] 根据上述步骤(4)计算得到校正系数为0.9985。

[0069] 进一步，测定步骤2所得的儿童活动性结核病患者血浆处理后样品中的蛋白浓度为7.8μg/μl，健康儿童血浆处理后样品中的蛋白浓度为7.1μg/μl。

[0070] 4、胰蛋白酶解样本

[0071] (1)蛋白质定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中，用8M尿素将体系定至125μl；

[0072] (2)加入现配的5μl 1M DTT溶液至体系中，混匀后，37℃孵育1h；

[0073] (3)加入现配的20μl 1M IAA溶液至体系中，混匀后，避光，室温(25℃)反应1h；

[0074] (4)吸取所有样品加入到10kD超滤管中，12000rpm(不超过14000g)离心20min，弃掉收集管底部溶液；

[0075] (5)加入100μl尿素(8M)至超滤管中，12000rpm离心10min，重复2次。

[0076] (6)在超滤管中加入胰蛋白酶(100U/μg)2-4μg(与蛋白质量比1:50-100)，体积50μl，37℃反应过夜20h；次日，12000rpm离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部。

[0077] 5、液相分级以及蛋白质质谱检测

[0078] 取酶解产物，按照定量结果取10μg进行LCMSMS分析。采用纳升流速HPLC液相系统EASY-nLC1000进行分离。液相A液为含有2％(体积分数)乙腈和0.1％(体积分数)甲酸的水溶液(即以100ml计算组成如下：2ml乙腈，0.1ml甲酸，余量为水)，B液为含有84％(体积分数)乙腈和0.1％(体积分数)甲酸的水溶液(即以100ml计算组成如下：84ml乙腈，0.1ml甲酸，余量为水)。色谱柱Thermo EASY column SC200150μm×100mm(RP-C18)以100％的A液平衡。样品由自动进样器上样到Thermo EASY column SC001traps 150μm×20mm(RP-C18)(Thermo)，再经色谱柱分离，流速为400nl/min。相关液相梯度如下：0min-100min，B液线性梯度从0％到45％(体积百分比含量，下同)；100min-108min，B液线性梯度从45％到100％；108min-120min，B液维持在100％。酶解产物经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪(Thermo Finnigan)进行质谱分析。分析时长：120min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300-1800m/z，多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描(full scan)后采集10个碎片图谱(MS2scan，HCD)。MS1在M/Z 200时分辨率为70000，MS2在M/Z 200时分辨率为17500。

[0079] 6、质谱鉴定

[0080] 先利用Trans-Proteomic Pipeline软件提取一级质谱定量信息(采用软件默认参数)，利用ProfileAnalysis2.0软件进行定量(采用软件默认参数)。然后利用ProteinScape2.1软件进行数据检索和整合，具体如下：

[0081] 以Peptide FDR ≤0.05对数据进行筛选过滤。导入Maxquant软件(属于ProteinScape2.1软件的一部分)进行Label-free分析。主要参数如下：

[0082] Main search ppm：6Missed cleavage：2

[0083] MS/MS tolerance ppm：20De-Isotopic：TRUE

[0084] enzyme：Trypsin database：ipi.human.3.87.fasta

[0085] Fixed modification：Carbamidomethyl(C)

[0086] Variable modification：Oxidation(M)，Acetyl(Protein N-term)

[0087] Decoy database pattern：reverse

[0088] Lable free quantification(LFQ)：TRUE

[0089] LFQ min ratio count：2

[0090] Match between runs：2min

[0091] Peptide FDR：0.05

[0092] Protein FDR：0.05

[0093] 筛选出379个fold change(比值)＞2或者<0.5的差异蛋白(见表2)，从而获得儿童活动性结核病蛋白特征谱。其中，比值＞2的蛋白为表达上调的蛋白，比值<0.5的蛋白为表达下调的蛋白，所述比值为所述儿童活动性结核病患者组的表达量与所述健康对照儿童组的表达量的比值。

[0094] 最终所得儿童活动性结核病蛋白特征谱中含有儿童活动性结核病患者组和健康对照儿童组表达差异的379种蛋白质，所述儿童活动性结核病患者组和所述健康对照儿童组中表达差异的蛋白质包括表达上调的蛋白质和表达下调的蛋白质；所述表达上调的蛋白质有PTCD3、ADAMTSL2、HTT、SNX4、VPS37B、RANBP17、UBE2O、VWDE、MCM4、ZC3H11A、WIZ、CCDC81、DSP、MMP2、GEMIN5、SPIRE2、PC、ADCY3、LIMS2、WWC1、RP1、ADAM18、AARSD1、PCSK6、ST3GAL4、ZNF584、ZMYM1、XB、LRRK2、SOCS5、RASAL3、SMC3、ATP10A、KDM1A、TTLL10、HERC6、PCCA、C1QTNF1、NUP88、SORBS1、NKD2、PIWIL4、AKAP2、SYNM、NPM1、HP、NOS1、NLRP14、SKIV2L、ICE1、ASAP2、ABAT、ORM1、CASK、SPECC1、NIPBL、DOCK11、CACTIN、ZNF526、SYNRG、FANCD2、PLXNC1、SPATA31D1、FBXO46、PSG3、BMPR2、DKFZp434A2017、KIF4A、COX10、ARHGDIG、RASAL2、MYH7、RFC1、DOCK5、ATP11A、ANKRD27、ZNF521、ZNF281、DLL1、TBL3、MYH14、EML4、CLTCL1、PRRC2C、TSTD2、C1orf94、NSD1、GPR137B、FRMPD2、ANKRD33B、SIN3A、TAS1R1、KIF3C、CYP26B1、HERC2、DCAF12L2、CCDC15、SP140、ABCC12、WDR91、SEC31A、GTPBP3、TLR4、CHMP4B、HECW1、CP、C16orf71、PPP2R5D、COL13A1、ZBTB10、ZNF311、PINLYP、AIM2、KCNMB3、HAL、MTHFD1、ALPP、PPP1R9A、IFT81、DDX60、CCDC71、RNF152、UBR4、ASH1L、CORO1C、ACAN、NARG1L、ZNF831、ABCA2、HCFC1、REXO1、TRIP12、PCNT、CAD、AK3、GUSB、SERPINA1、MTUS2、ZNF606、ARAP3、DZIP1、POLR3C、NLRP13、IFNA14、DNAH7、GPAM、SAMD9L、LMO3、USP11、RASGRF2、TATDN2、DCAF17、POFUT2、LAMA2、AXIN2、AP2A2、KIAA1033、HPS6、SORT1、TNPO3、NHLRC1、ADAM15、SLC25A41、CLEC14A、SERPINA3、DRG2、SYCP1、MRPS18B、ATP12A、SERPING1、MACF1、RSAD1、VPS13D、TTC3、RIMS1、GRK6、SP110、SOWAHC、HDGFRP3、POLR2A、C10orf76、INTS2、PROZ、MYO7B、TRMT1、ARHGEF1、LCE3A、SLC38A10、A2M、PAMR1、MCM5、ANK2、KLK8、PRG4、ZMYM3、PPP2R1B、TSSK4、INPP5B、SKIL、ZNF543、SLCO3A1、ATR、MID2、ZFP57、TICRR、XRCC4、SPTBN2、AHCTF1、C2CD3、ZC3H12B、LOX、PLOD3、ACACB、SDK2、C9orf85、CASP8、PLAA、KAT8、UTRN、MROH8、DMTN、SAA1、NRXN2、LEPREL4、SMC5、SPATA31C1、SAMHD1、PIAS3、L1CAM、JADE1、PKD1L1、MDC1、FAT2、PSD4、TAP1、CEP290、TTC28、ABCA7、LONP2、RGAG1、TAB2和TRPM5(即表2中的前242种蛋白)；所述表达下调的蛋白质有KIAA1211、CGN、DDAH1、HHIP、CLIC3、PPP6C、PNN、PRPF8、KIT、GLMN、CCDC89、DNAH14、COL6A2、GFRA1、PRPF6、KIAA0319、ATP13A1、PHKG2、COL7A1、TRIP6、TRIM14、DNAJC1、PHLDB3、ICA1、PRPF4B、TFAP4、LACTB、CEP63、MYO19、ARHGAP19、ANKRD17、EYS、PRDM9、TIGD5、ECHDC3、RHBDF1、GLG1、TMEM141、TNS1、GDPD3、LYST、HRH3、HBD、MZF1、FLYWCH1、OVOL2、HSPA5、ZNF30、ZNF492、FRAT1、AHSG、PIK3R6、KANSL1、MUC12、ESCO1、MIEF1、CACNA1E、DPYSL3、CHD7、ADCY9、EIF5、DDX31、RIT1、TECTA、RAB3GAP2、APOC3、RNF144B、SF3B4、ZNF709、EVC2、RB1CC1、MYH13、TIAM2、SEMA4A、COBLL1、UHRF1BP1L、SPTAN1、BCOR、SMG1、DPYD、RNASE4、PCCB、WDR62、BRD4、RBM26、DOPEY2、ZMYM5、RAB11FIP1、INADL、ZNF19、WNK1、WDR46、DAOA、ADIPOQ、F11、GOLGA4、ALK、TANGO6、BCL9L、COL4A1、CLEC2B、PDLIM1、CD22、EFNB2、COL8A2、NXF2、RNF180、ADAMTSL3、TTI2、LRP4、CDC37、CHD6、OCRL、ANO7、GBA2、PCF11、AGO3、CPT2、KMT2A、RASA3、ZNF431、CHIC1、ISCA2、BRINP1、MTO1、CASP2、MKI67、CNTRL、RPP40、DOK3、KRT82、FNDC1、WFDC5、KRT12、PTGDR2、BEND2和ZNF225(即表2中的后137种蛋白)。各蛋白在所述儿童活动性结核病患者组的表达量与所述健康对照儿童组的表达量的比值具体见表2中的“差异倍数”一栏。

[0095] 表2 379种蛋白在NCBI数据库中的编号及对应基因号

[0096]

[0097]

[0098]

[0099]

[0100]

[0101]

[0102]

[0103]

[0104]

[0105] 7、数据分析

[0106] (1)样本检测总离子流强度一致，说明样本仪器检测上样量基本一致，具有定量分析意义。

[0107] (2)样本检测TIC离子流峰型基本一致，说明样本酶解较完全，且各样本无蛋白损失，这与SDS-PAGE图谱也相符合。

[0108] (3)样本肽段的串联质谱峰分布比较平均，且大部分出现在有效梯度内，说明液相色谱条件较适合样本分析。

[0109] (4)样本的离子流峰保留时间比较一致，说明色谱比较稳定且重复性好，适合比较同一保留时间内的质谱峰，适合定量分析。