一种麻附甘制剂的鉴别方法

摘要

本发明的一种麻附甘药物制剂的鉴别方法，用高效液相色谱法鉴别附子，其色谱柱为以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；用薄层色谱法鉴别麻黄；用薄层色谱法鉴别甘草；本发明能简便准确,专属性强，耐用性好的鉴别麻附甘药物的真伪。

权利要求

1.一种麻附甘药物的鉴别方法，其特征在于：用高效液相色谱法鉴别附子，其色谱柱以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；其中高效液相色谱法是：系统适用性试验，流动相以乙腈：0.05％-0.2％的磷酸溶液比例为18：82至25：75，其中磷酸溶液含有0.02％-0.06％三乙胺和0.01％-0.03％二正丁胺，检测波长为222-242nm，理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于6000；

对照品溶液的制备：取苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml分别含20-70μg、5-20μg、5-20μg的混合溶液，作为对照品贮备液，精密量取对照品储备液用0.05％-0.2％磷酸溶液稀释2-10倍，摇匀作为对照品溶液；

固相萃取柱系统适用性试验：精密量取对照品贮备液5ml，室温减压回收至干，精密加入0.1mol/L盐酸50ml使溶解，精密量取10ml，加在固相萃取柱上，以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150-200mg，容量为4-10ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱，依次以水3ml、

1.25％氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈-浓氨试液＝90：10的混合溶液10ml洗脱，收集乙腈-浓氨试液洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈-0.1％的磷酸溶液＝20：80的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；

分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各10-30μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，不得小于0.95；

供试品溶液的制备：取检品，称取0.2-2g，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理10-50分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，以每分钟2000-6000转离心10-40分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“加在固相萃取柱上”起，依法操作，制备供试品溶液；

鉴别：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10-30μl，注入液相色谱仪测定，供试品色谱中呈现与苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱对照品色谱峰保留时间相对应的色谱峰，即确定制剂中含有附子，否则制剂中不含附子。

2.根据权利要求1的一种麻附甘药物的鉴别方法，其特征在于：理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于6000。

3.根据权利要求1的一种麻附甘药物的鉴别方法，其特征在于：制备供试品溶液时取样量是0.5-1g。

4.根据权利要求1的一种麻附甘药物的鉴别方法，其特征在于：所用固相萃取柱填料为混合型阳离子交换反相吸附剂，规格为150-200mg，容积为5-10ml，并预先依次用乙腈、水各

6ml洗脱处理。

5.根据权利要求2的一种麻附甘药物的鉴别方法，其特征在于：供试品溶液的制备过程中，固相萃取柱的洗脱过程依次为水3ml，1.25％氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml，待洗脱液流尽后，放置5分钟，再用乙腈：浓氨试液＝90：10的混合溶液10ml洗脱，收集乙腈-浓氨试液洗脱液。

说明书

一种麻附甘制剂的鉴别方法

技术领域

[0001] 本发明涉及药品，具体涉及一种麻附甘制剂的鉴别方法，属药品技术领域。技术背景

[0002] 麻附甘制剂是麻黄附子甘草汤方制成制剂的简称，由附子、麻黄、甘草组成，其处方出于《伤寒论》，具有解表散寒，固本通阳的功效，主治少阴病，恶寒身疼，无汗，微发热，脉沉微者。

[0003] 麻附甘处方制成制剂后，其外表形态、颜色与其它药物制剂近似，本领域技术人员，以外观鉴别不易区分真假，伪劣。现有技术用高效液相色谱法鉴别麻黄、附子与甘草的方法众多，通过实验证明用于麻附甘制剂的专属性均较差，因此，为了保证麻附甘药物质量和临床用药效果，提供一种简便、可靠的鉴别方法非常重要。

发明内容

[0004] 本发明的目的是为了提供一种麻附甘药物制剂的鉴别方法，为生产、流通、使用及检验、监督管理部门提供一种简便、可靠的鉴别方法。

[0005] 本发明的目的通过以下技术方案实现：

[0006] 本发明所述的一种麻附甘制剂的鉴别方法，其特征在于：用高效液相色谱法鉴别附子，其色谱柱以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂。

[0007] 本发明所述的本发明所述的一种麻附甘制剂的鉴别方法，其特征在于：系统适用性试验，流动相以乙腈：0.05%-0.2%的磷酸溶液比例为19：81至25：75(其中0.05%-0.2%的磷酸溶液还含0.02%-0.06%三乙胺和0.01%-0.03%二正丁胺)，检测波长为222-242nm，理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于5000；

[0008] 对照品溶液的制备：取苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml分别含20-70μg、5-20μg、5-20μg的混合溶液，作为对照品贮备液，精密量取对照品储备液用0.05%-0.2%磷酸溶液稀释2-10倍，摇匀作为对照品溶液；

[0009] 固相萃取柱系统适用性试验：精密量取对照品贮备液5ml，室温减压回收至干，精密加入0.1mol/L盐酸50ml使溶解，精密量取10ml，加在固相萃取柱上，以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150-200mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱，依次以水3ml、1.25%氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%的磷酸溶液（20：80）的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；

[0010] 分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各10-20μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，不得小于0.95；

[0011] 供试品溶液的制备：取检品研细，称取0.2-2g，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理30-50分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，以每分钟2000-5000转离心10-40分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“加在固相萃取柱上”起，依法操作，制备供试品溶液；

[0012] 鉴别：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10-30μl，注入液相色谱仪测定，供试品色谱中呈现与苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰，即确定制剂中含有附子，否则制剂中不含附子。

[0013] 本发明所述的一种麻附甘制剂的鉴别方法，其特征在于：理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于6000。

[0014] 本发明所述的一种麻附甘制剂的鉴别方法，其特征在于：制备供试品溶液时取样量是0.5-1g。

[0015] 本发明所述的一种麻附甘制剂的鉴别方法，其特征在于：供试品溶液的制备过程中，所用固相萃取柱填料为混合型阳离子交换反相吸附剂，规格为100-200mg，容积为5-10ml，并预先依次用乙腈、水各6ml洗脱处理。

[0016] 本发明所述的一种麻附甘制剂的鉴别方法，其特征在于：供试品溶液的制备过程中，固相萃取柱的洗脱过程依次为水3ml，1.25%氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml，待洗脱液流尽后，放置5分钟，再用乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液。

[0017] 本发明所述的一种麻附甘药物的鉴别方法，其特征在于：用薄层色谱法鉴别麻黄：取检品研细，称取0.5-5g，加浓氨试液数滴，再加三氯甲烷10ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml充分振摇，滤过，取滤液作为供试品溶液；另取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每lml含0.5-2mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述两种溶液各5-20µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷：甲醇：浓氨试液（20：5：0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色斑点，即确定是含有麻黄的制剂。

[0018] 本发明所述的一种麻附甘药物的鉴别方法，其特征在于：用薄层色谱法鉴别甘草：取检品研细，称取0.5-3g，加乙醚40ml，加热回流1小时，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材0.5-1.5g，同法制成对照药材溶液；吸取上述两种溶液各3-10μl，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以正丁醇：浓氨试液：乙醇（5：2：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，即确定是含有甘草的制剂。

[0019] 本发明的有益效果是：提供了简便准确，专属性强，耐用性好的麻附甘制剂的鉴别方法。为药品的生产、流通、使用过程中提供了一种鉴别真假的依据。

[0020] 为了更好的理解本发明，以下通过本发明鉴别方法的方法学研究进一步说明本发明的有益效果。方法学研究旨在进一步说明本发明的作用，而非本发明的限制。

[0021] 一、制备样品

[0022] 1、制备麻附甘颗粒剂

[0023] 取附子20kg，麻黄13.34kg，甘草13.34g，加水煎煮二次，第一次加8倍量，煎煮3小时，第二次加6倍量，煎煮2小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至稠膏状，在80℃以下减压干燥，粉碎，与适量辅料混匀，制成颗粒，干燥，整粒，得麻附甘药物的颗粒剂。

[0024] 2、制备不含附子的阴性颗粒剂

[0025] 取麻黄200g，甘草200g，照制备麻附甘颗粒剂的方法制成不含附子的阴性颗粒剂。

[0026] 3、制备不含麻黄的阴性颗粒剂

[0027] 取附子300g，甘草200g，照制备麻附甘颗粒剂的方法制成不含麻黄的阴性颗粒剂。

[0028] 4、制备不含甘草的阴性颗粒剂

[0029] 取附子300g，麻黄200g，照制备麻附甘颗粒剂的方法制成不含甘草的阴性颗粒剂。

[0030] 二、附子鉴别方法及方法学验证

[0031] 1、固相萃取柱系统适用性试验

[0032] 色谱条件与系统适用性试验：色谱柱以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；以乙腈：0.092%磷酸溶液（21：79）为流动相，其中0.092%磷酸溶液中含有0.04%的三乙胺和0.02%的二正丁胺；检测波长为232nm。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于6000。

[0033] 对照品溶液的制备：取苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml分别含50μg、10μg、10μg的混合溶液，作为对照品贮备液。精密量取对照品储备液5ml，置25ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

[0034] 固相萃取柱系统适用性试验：精密量取对照品贮备液5ml，室温减压回收至干，精密加入0.1mol/L盐酸50ml使溶解，精密量取10ml，加在固相萃取柱（以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱）上，依次以水3ml、氨溶液（5→100）、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%的磷酸溶液（20：80）的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液。

[0035] 分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定。

[0036] 表1  固相萃取柱系统适用性试验结果

[0037]项目 过柱前面积 过柱后面积 比值
苯甲酰新乌头原碱 304247.7 297951.1 0.979
苯甲酰乌头原碱 50207.9 49585 0.988
苯甲酰次乌头原碱 61488.5 60221.1 0.979

[0038] 固相萃取柱系统适用性试验结果显示本法测定所用固相萃取柱对三种单酯型生物碱吸附、解吸附率均在95%以上，表明所选用固相萃取柱适用于本法中单酯型生物碱的测定。

[0039] 2、专属性试验

[0040] 对照品溶液制备：取固相萃取柱系统适用性试验项下对照品溶液。

[0041] 供试品溶液制备：取检品混匀，精密称取1.0001g，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理（功率200W，频率40kHz）40分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，离心（转速为每分钟
4000转）30分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“加在固相萃取柱上”起，依法操作，即得。

[0042] 阴性供试品溶液的制备：取不含附子的阴性制剂1g，照供试品溶液制备方法制备阴性供试品溶液。

[0043] 测定：取供试品溶液、阴性样品溶液及对照品溶液，照固相萃取柱系统适用性试验项下液相条件及测定法测定。

[0044] 结果显示供试品溶液在与对照品溶液各色谱峰保留时间内均有相对应的色谱峰，阴性溶液在相应保留时间内无色谱峰，供试品溶液中其他色谱峰与各目标峰分离良好。结果表明阴性对测定无干扰，本法测定专属性强。

[0045] 3、耐用性试验

[0046] 3.1、溶液稳定性试验

[0047] 取供试品溶液室温放置，于第0h、8h、20h分别精密吸取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果显示供试品溶液室温放置20小时，三种单酯型生物碱峰面积、理论板数、分离度、拖尾因子均无明显变化，表明本法测定时供试品溶液在室温放置20小时内仍稳定，满足本法测定要求。

[0048] 3.2、检测波长耐用性试验

[0049] 取本品供试品溶液，分别在222nm、232nm、242nm波长下进行测定，结果表明本方法在此波长范围内均可对附子进行有效鉴别，耐用性良好。

[0050] 3.3、流速耐用性试验

[0051] 取本品供试品溶液，分别采用0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min流速进行测定，结果表明本方法在此流速范围内均可对附子进行有效鉴别，耐用性良好。

[0052] 3.4、流动相比例调整耐用性试验

[0053] 取本品供试品溶液，分别采用乙腈：0.092%磷酸溶液（含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺）的比例分别为19:81、21:79、23:77进行测定，结果表明，本方法在上述三种流动相比例下均可对附子进行有效鉴别，耐用性良好。

[0054] 3.5、柱温耐用性试验

[0055] 取本品供试品溶液，分别采用25℃、30℃、35℃柱温进行测定，结果表明，本方法在此柱温范围内均可对附子进行有效鉴别，耐用性良好。

[0056] 3.6、不同填料的色谱柱耐用性试验

[0057] 取本品，分别采用以极性乙醚连接苯基键合硅胶（以下简称“苯基柱”）和十八烷基硅烷键合硅胶（以下简称“C18柱”）为填充剂的色谱柱测定，两种填料的色谱柱理论塔板数及拖尾因子比较如下：

[0058] 表2  不同填料的色谱柱理论板数及拖尾因子比较

[0059]

[0060] 由结果看出，虽然两种色谱柱拖尾因子差异不大，但极性乙醚连接苯基键合硅柱胶有效降低了半峰宽，明显提高了理论塔板数，改善了峰形，提高了分离度。说明极性乙醚连接苯基键合硅柱胶更适用于本品测定。

[0061] 三、麻黄鉴别方法及方法学验证过程

[0062] 1、鉴别方法

[0063] 采用薄层色谱法鉴别。

[0064] 取本品4g，研细，加浓氨试液数滴，再加三氯甲烷10ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml充分振摇，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述两种溶液各10µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（20：5：0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色斑点，即确定是含有麻黄的制剂。

[0065] 2、专属性试验

[0066] 色谱条件：以硅胶G为薄层板固定相；点样量为10µl；以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液(20：5：0.5)为展开剂；以茚三酮试液为显色剂；105℃加热显色。

[0067] 供试品溶液制备：取检品4g，加浓氨试液数滴，再加三氯甲烷10ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml充分振摇，滤过，取滤液即得。

[0068] 对照品溶液制备：取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液。

[0069] 阴性溶液制备：取阴性制剂同供试品溶液制备方法配制溶液。

[0070] 吸取上述溶液各10µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。

[0071] 结果显示供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色斑点。阴性溶液在相应位置无斑点。表明本法鉴别胶囊中蜜麻黄专属性强。

[0072] 3、薄层条件耐用性试验

[0073] 3.1、溶液稳定性试验

[0074] 供试品溶液室温放置8小时，照专属性试验点样展开。结果显示与0小时相比较无差异，表明本法鉴别供试品溶液在室温放置8小时仍稳定。

[0075] 3.2、薄层板耐用性试验

[0076] 分别采用自制硅胶G板、市售硅胶G预制板，照专属性试验项下鉴别。结果显示采用不同薄层板蜜麻黄鉴别结果一致。

[0077] 四、甘草鉴别方法及方法学验证过程

[0078] 1、鉴别方法

[0079] 采用薄层色谱法鉴别。

[0080] 取本品2g，研细，加乙醚40ml，加热回流1小时，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液。另取甘草对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15：1：1：2）为展开剂，阴凉处展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，即确定是含有甘草的制剂。

[0081] 2、方法学验证

[0082] 2.1、专属性

[0083] 色谱条件：以1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G为薄层板固定相；点样量为5µl；以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15:1:1:2)为展开剂；以10%硫酸乙醇溶液为显色剂；105℃加热显色，紫外光灯(365nm)下检视。

[0084] 供试品溶液制备：取本品2g，研细，加乙醚40ml，加热回流1小时，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，即得。

[0085] 对照药材溶液制备：取甘草对照药材1g，同法制成对照药材溶液。

[0086] 阴性溶液制备：取阴性制剂同供试品溶液制备方法配制溶液。

[0087] 吸取上述溶液各5µl，分别点于同一1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，阴凉处展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。

[0088] 结果显示供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点，阴性溶液在相应位置无斑点。表明鉴别本品中炙甘草可采用对照药材法，专属性强。

[0089] 2.2、薄层条件耐用性

[0090] 2.2.1、溶液稳定性

[0091] 供试品溶液室温放置8小时后图谱显示与0小时相比较无差异，表明本法鉴别供试品溶液在室温放置8小时仍稳定。

[0092] 2.2.2、薄层板

[0093] 分别采用自制硅胶G板、市售硅胶G预制板，照专属性试验项下鉴别。图谱显示采用不同薄层板炙甘草鉴别结果一致。

[0094] 下面通过具体实施例近一步说明本发明，具体实施例所用的以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的高效液相色谱柱，非同一型号或同一型号不同使用时间。

具体实施方式

[0095] 实施例1：麻附甘颗粒剂鉴别

[0096] 1）制备颗粒剂：

[0097] 取附子6kg，麻黄2kg，甘草2kg，加水煎煮两次，第一次加8倍量水，煎煮2小时，第二次加6倍量水，煎煮1小时，合并两次煎液，滤过，浓缩至稠膏状，在80℃以下减压干燥，粉碎，与适量糊精混匀，制成颗粒，干燥，整粒，得麻附甘药物的颗粒剂。

[0098] 2）用高效液相色谱法鉴别附子：

[0099] 色谱条件与系统适用性试验：色谱柱以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂（Welch Ultimate Phenyl-Ether，新柱）；乙腈：0.05%磷酸溶液（含0.02%三乙胺和0.01%二正丁胺）（18：82）为流动相，检测波长为222nm，理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算为14820。

[0100] 对照品溶液的制备：取苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml分别含20μg、5μg、5μg的混合溶液，作为对照品贮备液，精密量取对照品储备液用0.05%磷酸溶液稀释2倍，摇匀作为对照品溶液。

[0101] 固相萃取柱系统适用性试验：固相萃取柱系统适用性试验：精密量取对照品贮备液5ml，室温减压回收至干，精密加入0.1mol/L盐酸50ml使溶解，精密量取10ml，加在固相萃取柱上，以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为4ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱，依次以水3ml、1.25%氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%的磷酸溶液（20：80）的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液。

[0102] 分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各30μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，结果均大于0.95。

[0103] 供试品溶液的制备：取检品研细，称取0.2g，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理50分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，离心（每分钟6000转）10分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“加在固相萃取柱上”起，依法操作，制备供试品溶液。

[0104] 鉴别方法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各30μl，注入液相色谱仪测定。

[0105] 结果：供试品色谱中呈现与苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰。结论：检品麻附甘颗粒剂中含有附子。

[0106] 3）用薄层色谱法鉴别麻黄：

[0107] 取检品研细，称取0.5g，加浓氨试液3滴，再加三氯甲烷10ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml充分振摇，滤过，取滤液作为供试品溶液；另取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每lml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述两种溶液各20µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（20：5：0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。

[0108] 结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色斑点。结论：检品麻附甘颗粒剂中含有麻黄。

[0109] 4）用薄层色谱法鉴别甘草：

[0110] 取检品研细，称取0.5g，加乙醚40ml，加热回流1小时，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液；吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以正丁醇：浓氨试液：乙醇（5：2：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视。

[0111] 结果：供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。结论：检品麻附甘颗粒剂中含有甘草。

[0112] 实施例2：麻附甘颗粒剂鉴别

[0113] 1）制备颗粒剂：

[0114] 取附子12kg，麻黄10kg，甘草10kg，加水煎煮两次，第一次加10倍量水，煎煮2.5小时，第二次加8倍量水，煎煮1.5小时，合并两次煎液，滤过，浓缩至稠膏状，在80℃以下减压干燥，粉碎，与适量糊精混匀，制成颗粒，干燥，整粒，得麻附甘药物的颗粒剂。

[0115] 2）用高效液相色谱法鉴别附子：

[0116] 色谱条件与系统适用性试验：色谱柱以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂（Welch Ultimate Phenyl-Ether，使用1个月）；乙腈：0.2%磷酸溶液（含0.06%三乙胺和0.03%二正丁胺）（25：75）为流动相，检测波长为242nm，理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算为12975。

[0117] 对照品溶液的制备：取苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml分别含70μg、20μg、20μg的混合溶液，作为对照品贮备液，精密量取对照品储备液用0.2%磷酸溶液稀释5倍，摇匀作为对照品溶液。

[0118] 固相萃取柱系统适用性试验：固相萃取柱系统适用性试验：精密量取对照品贮备液5ml，室温减压回收至干，精密加入0.1mol/L盐酸50ml使溶解，精密量取10ml，加在固相萃取柱上，以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，200mg，容量为10ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱，依次以水3ml、1.25%氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%的磷酸溶液（20：80）的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液。

[0119] 分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，结果均大于0.95。

[0120] 供试品溶液的制备：取检品研细，称取2g，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，离心（每分钟2000转）40分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“加在固相萃取柱上”起，依法操作，制备供试品溶液。

[0121] 鉴别方法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定。

[0122] 结果：供试品色谱中呈现与苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰。结论：检品麻附甘颗粒剂中含有附子。

[0123] 3）用薄层色谱法鉴别麻黄：

[0124] 取检品研细，称取5g，加浓氨试液10滴，再加三氯甲烷10ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml充分振摇，滤过，取滤液作为供试品溶液；另取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每lml含2mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述两种溶液各5µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（20：5：0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。

[0125] 结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色斑点。结论：检品麻附甘颗粒剂中含有麻黄。

[0126] 4）用薄层色谱法鉴别甘草：

[0127] 取检品研细，称取3g，加乙醚40ml，加热回流1小时，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材1.5g，同法制成对照药材溶液；吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以正丁醇：浓氨试液：乙醇（5：2：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视。

[0128] 结果：供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。结论：检品麻附甘颗粒剂中含有甘草。

[0129] 实施例3：麻附甘胶囊剂鉴别

[0130] 1）制备胶囊剂：

[0131] 取附子10kg，麻黄6.67kg，甘草6.67kg，加水煎煮二次，第一次加8倍量，煎煮3小时，第二次加6倍量，煎煮2小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至稠膏状，在80℃以下减压干燥，粉碎，与适量淀粉混匀，装入胶囊，得麻附甘药物的胶囊剂。

[0132] 2）用高效液相色谱法鉴别附子：

[0133] 色谱条件与系统适用性试验：色谱柱以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂（Agela Venusil XBP Polar-Phenyl，新柱）；乙腈：0.1%磷酸溶液（含0.03%三乙胺和0.02%二正丁胺）（20：80）为流动相，检测波长为232nm，理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算为15196。

[0134] 对照品溶液的制备：取苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml分别含50μg、10μg、10μg的混合溶液，作为对照品贮备液，精密量取对照品储备液用0.1%磷酸溶液稀释5倍，摇匀作为对照品溶液。

[0135] 固相萃取柱系统适用性试验：固相萃取柱系统适用性试验：精密量取对照品贮备液5ml，室温减压回收至干，精密加入0.1mol/L盐酸50ml使溶解，精密量取10ml，加在固相萃取柱上，以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱，依次以水3ml、1.25%氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%的磷酸溶液（20：80）的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液。

[0136] 分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，结果均大于0.95。

[0137] 供试品溶液的制备：取检品研细，称取1g，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，离心（每分钟4000转）30分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“加在固相萃取柱上”起，依法操作，制备供试品溶液。

[0138] 鉴别方法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪测定。

[0139] 结果：供试品色谱中呈现与苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰。结论：检品麻附甘胶囊剂中含有附子。

[0140] 3）用薄层色谱法鉴别麻黄：

[0141] 取检品研细，称取1g，加浓氨试液5滴，再加三氯甲烷10ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml充分振摇，滤过，取滤液作为供试品溶液；另取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每lml含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述两种溶液各10µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（20：5：0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。

[0142] 结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色斑点。结论：检品麻附甘胶囊剂中含有麻黄。

[0143] 4）用薄层色谱法鉴别甘草：

[0144] 取检品研细，称取1g，加乙醚40ml，加热回流1小时，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材1g，同法制成对照药材溶液；吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以正丁醇：浓氨试液：乙醇（5：2：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视。

[0145] 结果：供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。结论：检品麻附甘胶囊剂中含有甘草。

[0146] 实施例4：麻附甘片剂鉴别

[0147] 1）制备片剂：

[0148] 取附子10kg，麻黄5kg，甘草5kg，加水煎煮三次，第一次加8倍量，煎煮2小时，第二、三次分别加6倍量，分别煎煮1小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至稠膏状，在80℃以下减压干燥，粉碎，与适量淀粉混匀，70%乙醇作润湿剂制粒，加适量硬脂酸镁，混匀，压片，得麻附甘药物的片剂。

[0149] 2）用高效液相色谱法鉴别附子：

[0150] 色谱条件与系统适用性试验：色谱柱以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂（Agela Venusil XBP Polar-Phenyl，使用6个月）；乙腈：0.092%磷酸溶液（含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺）（22：78）为流动相，检测波长为230nm，理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算为6792。

[0151] 对照品溶液的制备：取苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml分别含30μg、5μg、5μg的混合溶液，作为对照品贮备液，精密量取对照品储备液用0.15%磷酸溶液稀释2倍，摇匀作为对照品溶液。

[0152] 固相萃取柱系统适用性试验：固相萃取柱系统适用性试验：精密量取对照品贮备液5ml，室温减压回收至干，精密加入0.1mol/L盐酸50ml使溶解，精密量取10ml，加在固相萃取柱上，以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱，依次以水3ml、1.25%氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%的磷酸溶液（20：80）的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液。

[0153] 分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，结果均大于0.95。

[0154] 供试品溶液的制备：取检品研细，称取0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理20分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，离心（每分钟3000转）30分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“加在固相萃取柱上”起，依法操作，制备供试品溶液。

[0155] 鉴别方法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各15μl，注入液相色谱仪测定。

[0156] 结果：供试品色谱中呈现与苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰。结论：检品麻附甘片剂中含有附子。

[0157] 3）用薄层色谱法鉴别麻黄：

[0158] 取检品研细，称取2g，加浓氨试液6滴，再加三氯甲烷10ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml充分振摇，滤过，取滤液作为供试品溶液；另取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每lml含0.8mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述两种溶液各8µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（20：5：0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。

[0159] 结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色斑点。结论：检品麻附甘片剂中含有麻黄。

[0160] 4）用薄层色谱法鉴别甘草：

[0161] 取检品研细，称取0.9g，加乙醚40ml，加热回流1小时，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材1.2g，同法制成对照药材溶液；吸取上述两种溶液各6μl，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以正丁醇：浓氨试液：乙醇（5：2：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视。

[0162] 结果：供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。结论：检品麻附甘片剂中含有甘草。

[0163] 实施例5：麻附甘口服液鉴别

[0164] 1）制备口服液剂：

[0165] 取附子9kg，麻黄7kg，甘草7kg，加水煎煮两次，第一次加8倍量水，煎煮2小时，第二次加6倍量水，煎煮1小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至稠膏状，放冷，加入乙醇至含醇量达70%，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至适量，加入糖粉及抑菌剂适量，静置，滤过，灌封，灭菌，得麻附甘药物的口服液剂。

[0166] 2）用高效液相色谱法鉴别附子：

[0167] 色谱条件与系统适用性试验：以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；乙腈：0.1%磷酸溶液（含0.03%三乙胺和0.01%二正丁胺）（24：76）为流动相，检测波长为235nm，理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算为14017。

[0168] 对照品溶液的制备：取苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml分别含20μg、10μg、10μg的混合溶液，作为对照品贮备液，精密量取对照品储备液用0.15%磷酸溶液稀释2倍，摇匀作为对照品溶液。

[0169] 固相萃取柱系统适用性试验：固相萃取柱系统适用性试验：精密量取对照品贮备液5ml，室温减压回收至干，精密加入0.1mol/L盐酸50ml使溶解，精密量取10ml，加在固相萃取柱上，以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱，依次以水3ml、1.25%氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%的磷酸溶液（20：80）的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液。

[0170] 分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，结果均大于0.95。

[0171] 供试品溶液的制备：取检品，称取2g，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理10分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，离心（每分钟5000转）20分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“加在固相萃取柱上”起，依法操作，制备供试品溶液。

[0172] 鉴别方法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪测定。

[0173] 结果：供试品色谱中呈现与苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰。结论：检品麻附甘口服液剂中含有附子。

[0174] 3）用薄层色谱法鉴别麻黄：

[0175] 取检品，称取5g，加浓氨试液10滴，再加三氯甲烷10ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml充分振摇，滤过，取滤液作为供试品溶液；另取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每lml含1.2mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述两种溶液各8µl，分别点于同一