一种用于提高免疫力的组合物及其制备方法

摘要

本发明公开了一种用于提高免疫力的组合物，所述组合物包括如下重量份数的组分：纳豆冻干粉200～300份、银杏叶提取物10～40份和沙棘粉40～80份。本发明还提出了利用上述组合物制备植物胶囊剂的方法。本发明通过采用纳豆冻干粉、银杏叶提取物、沙棘粉为主要原料，并利用海藻多糖作为植物胶囊材料制备胶囊剂，通过三种成分的作用相辅相成达到稳定人体内环境、促进人体体液及细胞免疫、清除体内过量自由基的目的，从而有效增强免疫力功能。

权利要求

1.一种用于提高免疫力的组合物，其特征在于，所述组合物由下述重量份数的组分组成：纳豆冻干粉200～300份、银杏叶提取物10～40份和沙棘粉40～80份，其中，所述的银杏叶提取物的黄酮类含量为24～30wt％，内酯类含量为6～8wt％。

2.根据权利要求1所述的用于提高免疫力的组合物，其特征在于，所述的组合物的剂型为胶囊剂。

3.根据权利要求2所述的用于提高免疫力的组合物，其特征在于，所述的胶囊剂由下述重量份数的组分组成：纳豆冻干粉200～300份、银杏叶提取物10～40份、沙棘粉40～80份、淀粉30～60份、硬脂酸镁2～4份。

4.根据权利要求3所述的用于提高免疫力的组合物，其特征在于，所述的胶囊剂通过如下步骤进行制备：(1)原料过筛：取经检验合格的纳豆冻干粉、银杏叶提取物、沙棘粉和淀粉，分别过筛后备用；

(2)混合：称取配方量的过筛后的纳豆冻干粉、银杏叶提取物、沙棘粉、淀粉和硬脂酸镁，将配方量的银杏叶提取物和沙棘粉投入到混合机中混合10～20min，得到物料A；将配方量的纳豆冻干粉与配方量的淀粉投入混合机中混合10～20min，得到物料B；将混合后的物料A和物料B以及配方量的硬脂酸镁投入到混合机中混合15～20min，得到均一粉体；

(3)制剂：将步骤(2)得到的均一粉体利用植物空心胶囊按照常规方法制成胶囊剂。

5.根据权利要求4所述的用于提高免疫力的组合物，其特征在于，步骤(1)中，所有原料过60～100目筛。

6.根据权利要求4所述的用于提高免疫力的组合物，其特征在于，步骤(3)中，所述的植物空心胶囊为羟丙基甲基纤维素空心胶囊、海藻多糖空心胶囊、普鲁兰糖空心胶囊、魔芋葡甘聚糖空心胶囊和改性淀粉空心胶囊中的任意一种。

7.权利要求1所述的组合物在制备用于提高免疫力的药物、保健食品或功能性食品中的应用。

说明书

一种用于提高免疫力的组合物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于中药保健品技术领域，尤其涉及一种用于提高免疫力的组合物及其制备方法。

背景技术

[0002] 免疫是人体自身的防御机制，使人体识别和消灭外来侵入的任何异物(病毒、细菌等)，处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞以及识别和处理体内突变细胞和病毒感染细胞的功能。当人体摄入的营养素(蛋白质、维生素、氨基酸、部分微量元素灯)不足时，免疫力就会下降，进而增加机体感染疾病的几率，如细菌、病毒感染，癌症等；但是免疫系统超过正常水平也会对人体造成损伤，如引发过敏反应等。

[0003] 近年来，随着人们生活水平的提高，社会生态环境、文化习俗和生活方式、饮食结构的改变，以及生活节奏的加快，同时工业化、城镇化、老龄化进程加快，导致免疫力低下人群在当今社会呈增长趋势，引发多种疾病，严重危害人们的身体健康。例如，老年人的免疫器官老化，导致多种老年疾病；慢性病患者或手术后病人，长期服用药物以及疾病消耗导致免疫力下降；普遍存在的健康人群存在浑身乏力、身心疲惫，抵抗力下降的症状，严重者会出现厌食、头痛、头晕、失眠等症状；常见慢性病，主要有心脑血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、慢性呼吸系统疾病等，我国慢性病发病人数快速上升，现有确诊患者2.6亿人，是重大的公共卫生问题，慢性病导致的死亡已经占到我国总死亡的85％。随着国家有关部门、媒体等组织推动的健康教育，我国人民越来越重视对自身健康的维护，已经逐渐意识到了抵抗力低下会引发多种疾病，严重危害人们身体健康，对此类保健食品的认识和需求大大增加，市场潜力巨大。同时，近年来各种突发性传染性疾病多发，如禽流感等，同时雾霾天气等日益严重的环境污染问题也危害着人体身体健康，面对这些因素导致患病人群数量显著增加，但又很难在短时间内找到行之有效的方法。患有慢性病的病人，由于长期用药以及疾病消耗导致免疫力下降。这种情况下，人们不得不转而依靠提高自身免疫力、是自身免疫系统发挥最大限度的抗击病毒入侵的能力。如何提高免疫力也是保健行业和医疗行业一直在追寻的问题。

[0004] 中医中免疫一词，始见于明朝的《免疫类方》，其意为“免除疫疠”，即古中医所说的“正气”。中医认为，正气亏虚是疾病发生的内在根据，因此，非常重视人体正气在疾病发生过程中的重要作用。正气充盛，抗病力强，致病邪气难以侵袭，疾病也就无从发生。《素问遗篇·刺法论》说：“正气存内，邪不可干。”反之，当人体正气不足，或正气相对虚弱时，卫外功能低下，往往抗邪无力，则邪气可能乘虚而入，导致机体阴阳失调，脏腑经络功能紊乱，以致引发疾病。正气能维持脏腑功能的协调、气血的流行畅达的这一功能则与免疫功能中的维持机体内在平衡的免疫稳定功能相吻合。一旦体内产生了一些病理产物，人体的正气又会奋起而抵抗之。如果正气不足，而这些病理产物又难以迅速除尽，必然会导致邪气郁结愈深，同时正气因之而耗伤，甚则危机生命。如积证的发生，常常因为情志失调，饮食失节，或感外邪，以致气机郁滞，血行不畅，淤血内阻，结而成块，积渐而大，终至不治。《素问·经脉别论》曰：“当时之时，勇者气行则已，怯者则着而病也。”现有的提高免疫力的保健品多数停留在一种或几种营养素的简单混合，缺乏中医理论支持以及“扶正固本”的效果。

发明内容

[0005] 发明目的：为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种用于提高免疫力的组合物及其制备方法，通过将纳豆、银杏叶和沙棘进行合理的复配，使三者配伍后的产品可以有效增强机体免疫力。

[0006] 技术方案：为实现上述技术目的，本发明提出一种用于提高免疫力的组合物，所述组合物包括如下重量份数的组分：纳豆冻干粉200～300份、银杏叶提取物10～40份和沙棘粉40～80份。优选地，所述组合物包括如下重量份数的组分：纳豆冻干粉250份、银杏叶提取物30份和沙棘粉60份。

[0007] 其中，所述的银杏叶提取物的黄酮类含量为24～30wt％，内酯类含量为6～8wt％。

[0008] 上述的纳豆冻干粉、银杏叶提取物和沙棘粉可以为普通市面上购买得到的产品，优选地，所述的银杏叶提取物为惠州市百草植物制品有限公司生产的银杏叶提取物，其中，所述银杏叶提取物中黄酮类含量为24.3wt％，内酯类含量为6.1wt％。

[0009] 所述的组合物可以制备成各种可接受的剂型，如胶囊剂、片剂、颗粒剂等，优选地，所述的组合物的剂型为胶囊剂。

[0010] 当上述组合物被制备成胶囊剂时，所述的胶囊剂由如下重量份数的组分组成：纳豆冻干粉200～300份、银杏叶提取物10～40份、沙棘粉40～80份、淀粉30～60份、硬脂酸镁2～4份。

[0011] 上述胶囊剂的制备方法如下：

[0012] (1)原料过筛：取经检验合格的纳豆冻干粉、银杏叶提取物、沙棘粉和淀粉，分别过筛后备用；

[0013] (2)混合：称取配方量的过筛后的纳豆冻干粉、银杏叶提取物、沙棘粉、淀粉和硬脂酸镁，将配方量的银杏叶提取物和沙棘粉投入到混合机中混合10～20min，得到物料A；将配方量的纳豆冻干粉与配方量的淀粉投入混合机中混合10～20min，得到物料B；将混合后的物料A和物料B以及配方量的硬脂酸镁投入到混合机中混合15～20min，得到均一粉体；

[0014] (3)制剂：将步骤(2)得到的均一粉体利用植物空心胶囊按照常规方法制成胶囊剂。

[0015] 优选地，在上述步骤中，步骤(1)中所有原料过60～100目筛。

[0016] 常用的植物空心胶囊如羟丙基甲基纤维素(HPMC)空心胶囊、海藻多糖空心胶囊、普鲁兰糖空心胶囊、魔芋葡甘聚糖空心胶囊、改性淀粉空心胶囊等。优选地，选用海藻多糖空心胶囊制备胶囊剂。

[0017] 通过采用植物空心胶囊制备胶囊剂，相对于传统的明胶空心胶囊具有如下优点：植物胶囊可以扩大适用人群范围，例如素食主义者及有特殊宗教信仰的人均可放心使用；
植物胶囊含水量低，胶囊本身性质稳定，而且植物胶囊不会发生交联反应、美拉德反应等。
本提高免疫力组合物具有较高含量的多糖类、黄酮类等易于和传统胶囊发生美拉德反应的物质，使用植物胶囊可以减少活性成分的损耗、减弱胶囊对活性作用的影响，而且安全性好，无动物疫源感染的危险，无高致癌物质如铬污染、药物残留、重金属残留等安全性问题不易发生。

[0018] 本发明进一步提出了上述组合物在制备用于提高免疫力的药物、保健食品或功能性食品中的应用，如将上述组合物辅以合适的辅料和载体后，制备成胶囊剂、片剂、颗粒剂等药物、保健食品或功能性食品。

[0019] 对于上述提高免疫力的组合物中的成分说明如下：

[0020] 纳豆冻干粉：纳豆是一种传统的健康食品，在日本有2000年的食用历史，被称为长寿食物，科学研究证实，纳豆中含有多种维生素、矿物质、氨基酸、蛋白激酶、异黄酮、软磷脂、低聚糖、皂苷、木质素、纳豆芽孢杆菌等多种生物活性成分，具有降血压、降血脂、抗氧化、溶血栓、增强机体免疫力等多种作用。纳豆冻干粉是由大豆经纳豆菌发酵而成，是一种传统的健康食品。纳豆不仅有丰富的营养价值，而且有多种医学保健功能。近几年来，经日本的医学家、生理学家研究得知，大豆的蛋白质具有不溶解性，而做成纳豆后，变得可溶并产生氨基酸，而且原料中不存在的各种酵素会由于纳豆菌及关联细菌产生，帮助肠胃消化吸收。纳豆的成分是：水分61.8％、粗蛋白19.26％、粗脂肪8.17％、碳水化合物6.09的％、粗纤维2.2％、灰分1.86％，作为植物性食品，粗蛋白、脂肪最丰富。纳豆系高蛋白滋养食品，纳豆中含有的醇素，食用后可排除体内部分胆固醇、分解体内酸化型脂质，使异常血压恢复正常。近年研究表明，大豆异黄酮和大豆皂苷具有增强机体免疫力的功能，能促进免疫细胞合成，提高巨噬细胞的吞噬能力，从而增强机体的非特异性免疫和特异性免疫功能。纳豆中丰富的维生素和矿物质是参与机体代谢不可缺少的辅助酶，有促进抗体形成的作用；纳豆中的小分子蛋白质和多糖能够为合成免疫细胞提供营养基础，并诱导产生人体干扰素直接作用于人体的免疫系统。纳豆中含有丰富的纳豆木质素，木质素是一种天然高效的植物纤维，能在大肠内迅速吸附致癌物质，将其排除体外，而且纳豆在发酵过程中形成的生理活性物质可以全面地补充人体生理活性物质的不足，对因免疫下降引起的类风湿性疾病、肾小球肾炎、皮肤病、肿瘤、肝炎、病毒感染等都有明显的预防和改善的作用，因此可以说纳豆是人体免疫防线可靠的天然屏障。现在，纳豆已成为各国喜爱的方便、健康食品，经常食用可起到强身健体、预防疾病的作用。

[0021] 银杏叶提取物：银杏叶为世界上最古老的孑遗植物银杏的干燥叶，作为药用已有500余年的历史。银杏叶提取物为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶经加工制成的提取物。根据卫生部关于进一步规范保健食品原料管理的通知，银杏叶属于可用于保健食品的原料。银杏叶提取物即以银杏叶为原料，经提取、分离干燥得到。自20世纪60年代起，国内外研究学者对银杏叶的化学成分、功效作用等进行了大量研究，证实了银杏叶及其提取物具有改善心脑血管循环、降低血脂、提高机体免疫力、抗菌消炎、延缓衰老等功效。近年来，银杏叶提取物的增强免疫力作用受到广泛重视，国内外通过大量科学研究证实：银杏叶提取物可促进免疫器官发育、对单核巨噬细胞的吞噬功能具有促进作用及对自然杀伤细胞有明显的增强作用；能促进抗体的生成，增强机体的体液免疫功能；增加T细胞数量，调节T淋巴细胞亚群的平衡，对细胞免疫有促进作用；另外还可以通过调节细胞因子水平、增强红细胞免疫功能和粘膜保护作用调节异常机体的免疫功能。

[0022] 沙棘：系蒙古族、藏族习用药材。为胡颓子科植物沙棘Hippophae rhamnoides L.的干燥成熟果实。沙棘是药食同源的原料之一，药用、食用历史悠久，沙棘是综合营养源，还有多种维生素、多种氨基酸、多种微量元素和多种生物活性物质，可以全方位、多系统、多器官、多环节、多层次调节保护人体的健康，被学术界誉为“21世纪人类健康的保护神”。沙棘，是果蔬中少有的集蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素为一体的富营养源植物，特别是维生素和氨基酸的高含量，已确定了沙棘的明星地位；沙棘果还含有沙棘黄酮、超氧化物歧化酶及ω-6多不饱和脂肪酸等对人体具有特殊保健作用的生物活性物质。我国是世界上利用沙棘最多的国家，古文献中就有许多记载，如《月王药诊》中就有记载沙棘果治疗肺部疾病、肺脓肿等。沙棘中含可溶性糖8％～15％，含酸10％～12％，主要有苹果酸、柠檬酸、酒石酸等。维生素约14种，且含量相当丰富，其中以维生素C的含量最高，研究表明每100g沙棘果中维生素C的含量在100～800mg。现代研究表明，沙棘总黄酮有增加小鼠白细胞溶菌酶、吞噬功能、总补体含量的作用；可促进抗体生成，使血清抗体水平升高；增加血液T细胞比例和脾特异玫瑰花形细胞(SRFC)，同时使Con A激活的淋巴活性增强，低浓度时促进淋巴细胞转化，且明显保护环磷酰胺所致的抗绵羊红细胞溶血素生成减少。沙棘粉能增加小鼠巨噬细胞的吞噬功能，使吞噬百分率明显高于对照组(P＜0.01)；能促进体液免疫，样品半数溶血值比对照组提高35％；能促进淋巴细胞转化，并降低血清胆固醇含量。给小鼠连续20d使用保健饮品-益力淇(主要成分为沙棘原汁和乳酸菌培养液)，在人使用量的1倍、10倍、30倍剂量组能明显增强小鼠迟发型变态反应及增加和外周血T淋巴细胞ANAE阳性率，并可提高小鼠巨噬细胞吞噬功能和脾脏抗体生成细胞数。

[0023] 纳豆、银杏叶和沙棘都是保健珍品。纳豆富含丰富蛋白质，多种维生素，可以保持人体正氮平衡的需求，对慢性疾病患者及中老年人的体力健康恢复可以提供充足的营养，在中医理论中是固正扶本的良药，也是人们日常生活中喜爱食用的水果之一；银杏叶是中国的传统中药，具有活血化瘀、通络止痛、敛肺平喘、化浊降脂的功效，有宣肺活血之功效，中医中有“气血冲和，万病不生”之说法，可助扶正之效；沙棘是药食两用的药材之一，营养丰富，口味酸甜，深受人们喜爱，在中医药理论体系中，沙棘有健脾消食、止咳祛痰的功效，是很好的健脾消食药，脾脏在免疫系统中为外周免疫系统，是淋巴细胞定居的部位，脾虚则会招致外邪入侵，从而导致机体久病不愈或者经常得病。另外，沙棘中的维生素C等成分易被氧化，而银杏叶中含有抗氧化活性成分，组合减少营养成分的散失，纳豆提取物具有抑菌作用，能够在一定程度上保持产品的稳定性和微生物安全性，纳豆提取物还具有调节肠道菌群的作用，对营养成分的吸收等有益。中医对免疫有特定的看法，即扶正固本为原则，补肾、宣肺、健脾为方法，从而气血充盈，邪不可侵，即我们所说的免疫增强。但目前三者配伍而成的保健食品未有出现在市场中，通过对中医理论的深入研究，合理组合配方，可以使三者配伍后的产品可以有效增强机体免疫力，优于市场上单纯补充单一成分或者多种营养素混合而成的保健品，开发成为真正具有中医药理论支持的优秀的保健食品。

[0024] 有益效果：本发明通过采用纳豆冻干粉、银杏叶提取物、沙棘粉为主要原料，并利用植物空心胶囊制备成胶囊剂，三种成分的作用相辅相成，以达到稳定人体内环境的目的，促进人体体液及细胞免疫，清除体内过量自由基，从而有效增强免疫力功能。

具体实施方式

[0025] 以下通过对本发明具体实施方式的描述说明但不限制本发明。其中，下述各实施例选用的银杏叶提取物购买自惠州市百草植物制品有限公司，黄酮类含量为24.3wt％，内酯类含量范围在6.1wt％。

[0026] 实施例1

[0027] 一种用于提高免疫力的组合物，其包括如下重量份数的组分：纳豆冻干粉240份、银杏叶提取物40份、沙棘粉60份、淀粉56份、硬脂酸镁4份。利用上述配方制备含有该组合物的胶囊剂，其制备方法如下：

[0028] (a)原辅料准备：取符合质量标准要求的各原辅料备用；

[0029] (b)过筛：将纳豆冻干粉、银杏叶提取物、沙棘粉、淀粉分别过60目筛；

[0030] (c)称量：取经检验合格的配方量的纳豆冻干粉、银杏叶提取物、沙棘粉、淀粉和硬脂酸镁；

[0031] (d)混合：将物料银杏叶提取物与沙棘粉投入HL-800型混合机中混合10min得到物料A；纳豆冻干粉与淀粉投入HL-800型混合机中混合10min得到物料B，然后将混合后的物料A、物料B及硬脂酸镁投入HL-800型混合机中混合15min，得均一混合物；

[0032] (e)充填：领取检验合格的植物空心胶囊(海藻多糖空心胶囊)，将植物空胶囊加入NJP-2000B型胶囊填充机试机，待机器运转正常后加入检验合格的物料，调整剂量杆，使胶囊重量达0.38～0.42g后开始正式灌装，生产过程中，注意观察胶囊外观，每隔15min测试胶囊的重量；

[0033] (f)抛光：充填完毕用YPJ-818型抛光机对胶囊进行抛光，除去胶囊表面的粉末后，放入衬有清洁干燥的塑料袋的桶内；

[0034] (g)内包装：用BS15/500B型变频调幅双头数粒机将胶囊装入固体药用塑料瓶(符合YBB 00122002口服固体药用高密度聚乙烯瓶的质量标准，并进行密封性检查；

[0035] (h)外包装：瓶子上贴好标签，打印生产日期和保质期，装入瓦楞纸箱(符合GB/T 6543的质量标准)；

[0036] (i)检验、入库：成品经检验合格、入库。

[0037] 其中，(a)～(i)项步骤均在GMP车间10万级洁净区进行。经检测，该组合物经提取后的活性成分中，银杏总黄酮和沙棘总黄酮含量占1.7wt％。

[0038] 实施例2

[0039] 一种用于提高免疫力的组合物，其包括如下重量份数的组分：纳豆冻干粉260份、银杏叶提取物28份、沙棘粉80份、淀粉30份、硬脂酸镁2份。利用上述配方制备含有该组合物的胶囊剂，其制备方法如实施例1。经检测，该组合物经提取后的活性成分中，银杏总黄酮和沙棘总黄酮含量占1.67wt％。

[0040] 实施例3

[0041] 一种用于提高免疫力的组合物，其包括如下重量份数的组分：纳豆冻干粉250份、银杏叶提取物30份、沙棘粉60份、淀粉56份、硬脂酸镁4份。利用上述配方制备含有该组合物的胶囊剂，其制备方法如实施例1。经检测，该组合物经提取后的活性成分中，银杏总黄酮和沙棘总黄酮含量占1.47wt％。

[0042] 实施例4

[0043] 一种用于提高免疫力的组合物，其包括如下重量份数的组分：纳豆冻干粉242份、银杏叶提取物35份、沙棘粉70份、淀粉50份、硬脂酸镁3份。利用上述配方制备含有该组合物的胶囊剂，其制备方法如实施例1。经检测，该组合物经提取后的活性成分中，银杏总黄酮和沙棘总黄酮含量占1.71wt％。

[0044] 实施例5

[0045] 一种增强免疫力的组方，其特征在于以质量份计包括纳豆冻干粉250份、银杏叶提取物35份、沙棘粉60份、淀粉51份，硬脂酸镁4份。利用上述配方制备含有该组合物的胶囊剂，其制备方法如实施例1。经检测，该组合物经提取后的活性成分中，银杏总黄酮和沙棘总黄酮含量占1.59wt％。

[0046] 实施例6组合物的毒理学实验。

[0047] 1、实验样品及检测项目：

[0048] 1.1样品：实施例3制备的组合物胶囊，由南京中生生物科技有限公司委托检验，人体推荐剂量为1600mg/人/天，即26.7mg/kg b.wt。

[0049] 1.2试验动物：健康ICR小鼠，南京医科大学实验动物中心提供，清洁级，合格证号：SCXK(苏)2008-0004号；4周龄健康SD大鼠，上海斯莱克实验动物环境设施合格证号：SYXK(苏)2012-0037号。

[0050] 1.3小鼠急性毒性试验：选择体重18.1～20.5gICR小鼠20只，雌雄各半。受试物剂量为15000mg/kg b.wt，灌胃给予实验动物，观察期14d。

[0051] 1.4鼠伤寒沙门氏菌试验：试验菌株经鉴定基因型符合要求的TA97、TA98、TA100和9
TA102，各菌株过夜培养液细菌浓度均在10个/ml或以上。无菌水称取500mg样品加蒸馏水至10ml，再用灭菌蒸馏水连续做5倍稀释配成所需各浓度。共设5个剂量组、1个溶剂组、1个空白对照组即自发回变组，另设4个阳性对照组(Dexon、NaN3、2-AF和1，8-二羟基蒽醌)采用平板渗入法，共测试两次，每次每个剂量设平行样3个。

[0052] 1.5小鼠骨髓细胞微核试验：选择体重25.0～29.5g健康ICR小鼠50只，雌雄各半，小鼠分雌雄按体重随机分为5组，每组10只。3个受试组剂量分别为2500、5000、10000mg/kg b.wt，阳性对照组(环磷酰胺40mg/kg b.wt)及溶剂对照组(纯净水)。各组均采用30h两次灌胃法，每次灌胃容量为20ml/kg，取股骨骨髓悬于小牛血清中直接涂片、固定、染色，镜检嗜多染红细胞1000个/鼠，计数含微核的细胞数。观察200个嗜多染红细胞同时计数所见到的正染红细胞，计算两者的比率。

[0053] 1.6小鼠睾丸染色体畸变试验：选择体重25.4-29.4g雄性ICR小鼠25只，随机分为5组，每组5只，3个实验组中受试物剂量分别为2500、5000、10000mg/kgb.wt，另设溶剂对照组和环磷酰胺(CP)阳性对照组(40mg/kg b.wt)。各剂量组和溶剂对照组灌胃给予受试物，连续5d，阳性对照组腹腔注射，连续5天。各组动物均于处死前6h腹腔注射秋水仙素4mg/kg，实验第14天杀鼠取睾丸，依次拉开曲细精管，低渗、固定、软化、制片、染色、镜检。

[0054] 1.7 30天喂养试验：

[0055] 1.7.1试验方法：4周龄SD大鼠80只，雌雄各半，分性别按体重分入各组，每组20只。3个实验组中受试物剂量分别为668、1335、2670mg/kg b.wt./d(相当于推荐剂量的25、50、
100倍)，设基础饲料对照组。分别称取147、294和587g拌入灭菌基础鼠饲料，以约每日100g/kg b.wt.的摄食量给予大鼠自由食用上述比例拌制的喂饲料。

[0056] 1.7.2观察指标：生长发育，食物利用率，血红蛋白、血小板、红细胞、白细胞总数及中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞分类，肝、肾、脾、睾丸体比，丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、总蛋白、白蛋白、血糖、尿素氮、肌酐、总胆固醇、甘油三酯、大体解剖和肝、肾、脾、胃、小肠、睾丸、卵巢病理组织学检查。

[0057] 2、结果

[0058] 2.1急性毒性试验：小鼠灌胃后未见明显中毒表现，观察期内无动物死亡。观察期结束时，大体解剖未见明显异常。纳豆银棘胶囊对动物体重增长无明显影响，经口给予动物后未见明显中毒表现，观察期内无动物死亡。雌雄小鼠经口MTD值均大于15000mg/kg b.wt.，根据急性经口毒性分级标准，该样品属无毒级。

[0059] 2.2鼠伤寒沙门氏菌试验结果：

[0060] 表1Ames试验结果

[0061]

[0062]

[0063] 该样品对标准测试菌TA97、TA98、TA100和TA102均未检出明显的诱变活性。

[0064] 2.3小鼠骨髓细胞微核试验结果：

[0065] 表2 组合物胶囊对小鼠骨髓细胞微核试验结果

[0066]

[0067]

[0068] 结果表明，在受试剂量下，未检出该样品对雌雄小鼠骨髓嗜多染红细胞致微核作用。

[0069] 2.4小鼠睾丸染色体畸变试验

[0070] 表3 组合物胶囊对小鼠睾丸染色体畸变试验结果

[0071]

[0072] a：断裂、断片、易位、微小体等。

[0073] 结果表明，在受试剂量下，未检出该样品对雄性小鼠睾丸初级精母细胞染色体的诱变活性。

[0074] 2.5 30天喂养试验

[0075] 以835mg/kg剂量(相当于推荐剂量的50倍)的组合物胶囊掺入基础饲料中喂养大鼠30d，作为试验组，结果显示：试验组动物活动、生长正常；体重与对照组比较无显著性差异(p＞0.05)；雄性高剂量组肝脏绝对重量和肝/体比均升高，与对照组相比差异具极显著性(p＜0.01)，但血生化指标及病理组织学检查均未见明显异常；雌雄各剂量组的血液学指标检测值、生化指标检测值均在正常波动范围内；高剂量组雌雄大鼠病理组织学检查未显示与组合物胶囊明显有关的病理改变。

[0076] 在本实验条件下，该样品30天喂养试验高剂量组雌性大鼠实际摄入剂量分别为3142mg/kg，相当于推荐剂量的117倍。

[0077] 综上所述，本发明制备的组合物胶囊的检测结果如下：

[0078] 急性毒性试验：本发明实施例3制备的组合物胶囊对两种性别的小鼠经口急性毒性(MTD)均大于15000mg/kg.BW，根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)急性毒性分级标准，本样品属无毒级。

[0079] Ames试验：结果为阴性；小鼠骨髓细胞微核试验：结果为阴性；小鼠睾丸染色体畸变试验：结果为阴性。

[0080] 实施例7组合物增强免疫力功能动物实验报告。

[0081] 选择实施例3制备的组合物胶囊，评价其增强动物免疫力功能的效果，同时增设3组对照例，即为对照1、对照2和对照3，其中，对照1的组合物胶囊与实施例3制备的胶囊的区别仅在于对照1不含有纳豆冻干粉，对照2的组合物胶囊与实施例3制备的胶囊的区别仅在于对照2不含银杏叶提取物，对照3的组合物胶囊与实施例3制备的胶囊的区别仅在于对照3不含沙棘粉。

[0082] 1、材料与方法

[0083] 1.1样品：实施例3制备的组合物胶囊、对照1、对照2和对照3的组合物胶囊，分别作为受试组，硬胶囊内容物为浅棕黄色粉末。

[0084] 1.2实验动物：选用上海斯莱克实验动物有限责任公司提供的18～22g健康雌性清洁级ICR小鼠(动物证号：SCXK(沪)2012-0002号)。

[0085] 1.3剂量选择：成人每日推荐摄入量为1600mg，相当于26.67mg/kg BW/d，实验设人体推荐量的10倍，即每日267mg/kg BW作为试验组，对照1、对照2、对照3剂量与试验组一致(人体推荐量的10倍)，溶剂空白对照组以等容积纯净水灌胃(记为空白组)，连续灌胃30d后测各项免疫指标。所有动物处理日常饮食外，按照上述剂量分别喂食组合物胶囊或空白纯净水。

[0086] 1.4实验方法：

[0087] 1.4.1二硝基氟苯诱导小鼠迟发性变态反应(DTH)

[0088] 连续灌胃25d后，小鼠腹部去毛，1％二硝基氟苯(DNFB)丙酮麻油溶液50ul涂抹致敏。致敏后5d，小鼠右耳均匀涂抹1％DNFB丙酮麻油溶液20ul进行攻击，左耳涂抹丙酮麻油溶液作对照，攻击后24h处死小鼠，剪下左右耳壳，于同一部位取直径8mm的耳片称重，左右耳片重量之差作为肿胀度。同时取小鼠的胸腺及脾脏，以每10g小鼠的脾重(mg)和胸腺重(mg)作为脾脏/体重比值和胸腺/体重比值。

[0089] 连续灌胃30d后，无菌取脾，制成单个细胞悬液(细胞浓度为3×106个ml)。将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，一孔加75μl ConA液，另一孔作为对照，置5％CO2，37℃CO2培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔吸去上清0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT溶液(5mg/m1)50μl/孔，继续培养。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙酮，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3孔(200μl/孔)作为平行样，用酶标仪以570nm波长测定光密度值。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力。

[0090] 1.4.2抗体生成细胞(PFC)检测(琼脂糖平板法)

[0091] 连续灌胃27d后，每鼠腹腔注射2％(v/v)压积SRBC 0.2ml致敏。免疫4d后，将小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，制成单细胞悬液，惊醒溶液空斑试验。计数溶血空斑数，用空斑数/106脾细胞来表示抗体生成细胞数。

[0092] 1.4.3血清溶血素测定：半数溶血值(HC50)测定法

[0093] 连续灌胃27d后，每鼠腹腔注射2％(v/v)压积SRBC 0.2ml致敏。免疫4d后，小鼠摘眼球采血，取血清测溶血反应，另设不加血清(以SA缓冲液代替)的对照管为比色空白，于540nm分别测定各管光密度值。按下式计算各鼠的样品HC50：

[0094]

[0095] 1.4.4小鼠碳廓清试验

[0096] 连续灌胃30d后小鼠每10g体重尾静脉注射1∶7(v/v)稀释的印度墨汁0.1ml，注入后立即计时，并分别于2、10min从内眦静脉丛取血20μl，加到2ml 0.1％碳酸钠中，测OD600nm。并取肝、脾称重，按公式a＝K1/3×体重/(肝重+脾重)求小鼠吞噬指数a值(K＝(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)。

[0097] 1.4.5小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(滴片法)

[0098] 连续灌胃27d后，每鼠腹腔注射2％(v/v)压积SRBC 0.2ml，激活小鼠巨噬细胞。5d后，颈椎脱臼法处死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hanks液4mL/只，吸取腹腔洗液与等量的1％鸡红细胞混匀。吸取1mL混合液，加入玻片的琼脂圈内，放置孵箱内37℃孵育20min。孵育结束后用生理盐水将未贴壁细胞冲掉，于甲醇液中固定1min，Giemsa液染色15min。用40×显微镜计数吞噬率和吞噬指数(吞噬率为每100个巨噬细胞中，吞噬鸡红细胞的巨噬细胞所占的百分率；吞噬指数为平均每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的各鼠)。并据此判定巨噬细胞的吞噬能力。

[0099] 1.4.6NK细胞活性测定

[0100] 连续灌胃30d后，无菌取脾，制成单个细胞悬液(细胞浓度为2×107个/mL)，作为效应细胞。取靶细胞(YAC-1细胞)和效应细胞各100μl(效靶比50∶1)，加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5％Triton各100μl；上述各项均设三个重复孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以
1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μl置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，反应10min，每孔加入1mol/L的HCl 30μl，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。按下式计算NK细胞活性：

[0101]

[0102] 2、实验结果

[0103] 2.1样品对试验前后动物体重的影响

[0104] 由表4、表5和表6可见，实验前后受试物试验组小鼠体重和增重分别与空白组、对照组相比无统计学显著性差异(p＞0.05)。

[0105] 表4 各组小鼠的初始体重

[0106]

[0107] 受试组试验组与空白组和对照组小鼠初始体重经ANOVA得P值均大于0.05。

[0108] 表5 试验终末各组小鼠的体重

[0109]

[0110] 受试物试验组与空白组和对照组小鼠终末体重经ANOVA得P值均大于0.05。

[0111] 表6 样品对小鼠体重增加的影响

[0112]

[0113] 受试物试验组与空白组和对照组小鼠体重增加经ANOVA得P值均大于0.05。

[0114] 2.2样品对脏器/体重比值的影响

[0115] 由表7可见，受试物试验组小鼠胸腺/体比值、脾/体比值与空白组和对照组相比无统计学显著性差异(P＞0.05)。

[0116] 表7 组合物胶囊对小鼠脏器(mg)/体重(10g)比值 的影响

[0117]

[0118] 受试物试验组与空白组和对照组小鼠脾脏/体重比值及胸腺/体重比值经ANOVA得P值均大于0.05。

[0119] 2.3细胞免疫功能实验：二硝基氟苯(DNFB)诱导的小鼠迟发性变态反应(DTH)[0120] 由表8可见，受试物试验组小鼠耳廓肿胀度均高于空白组、对照1、对照2和对照3组，方差分析及两两比较显示，试验组小鼠耳肿胀度与溶剂对照组相比有显著统计学差异(p＜0.01)，该项实验结果呈阳性。

[0121] 表8 组合物胶囊对小鼠耳廓迟发性变态反应的影响

[0122]

[0123]

[0124] 2.4细胞免疫功能实验：ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT法)[0125] 由表9可见，受试物试验组光密度差值均高于溶剂对照组，结果经方差分析及两两比较统计学处理，受试物试验组小鼠的光密度差值与空白组和对照组相比均无统计学显著性差异(P＞0.05)，该项实验结果阴性。

[0126] 表9 组合物胶囊对小鼠脾淋巴细胞转化的影响

[0127]

[0128] 2.5体液免疫功能实验：抗体生成细胞(PFC)检测(琼脂糖平板法)

[0129] 由表10可见，结果经方差分析及两两比较统计学处理，受试物试验组小鼠的溶血空斑数与空白组和对照组相比，有统计学显著性差异(P＜0.05)，该项实验结果阳性。

[0130] 表10 组合物胶囊对小鼠脾抗体生成细胞量的影响

[0131]

[0132] 2.6体液免疫功能实验：血清溶血素实验

[0133] 由表11可见，结果经方差分析及两两比较统计学处理，受试物试验组小鼠血清半数溶血值(HC50)与空白组和对照组相比，均无统计学显著性差异(P＞0.05)，该项实验结果阴性。

[0134] 表11 组合物胶囊对血清溶血素水平的影响

[0135]

[0136] 2.7单核-巨噬细胞功能实验：小鼠碳廓清实验。

[0137] 由表12可见，受试物各剂量组小鼠吞噬指数a均高于空白组、对照1、对照2和对照3，方差分析及两两比较显示，试验组小鼠的吞噬指数a与溶剂对照组相比有统计学显著性差异(P＜0.01，P＜0.05)，该项实验结果阳性。

[0138] 表12 组合物胶囊对小鼠碳廓清的影响

[0139]

[0140] 2.8单核-巨噬细胞功能实验：小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。

[0141] 由表13可见，结果经方差分析及两两比较统计学处理，受试物各剂量组小鼠的单核-巨噬细胞吞噬百分率及吞噬指数与空白组和对照组相比，均无统计学显著性差异(P＞0.05)，该项实验结果阴性。

[0142] 表13 组合物胶囊对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响

[0143]

[0144] 2.9NK细胞活性测定

[0145] 由表14可见，受试物各剂量组小鼠的NK细胞活性均高于溶剂空白组合对照1、对照2和对照3的值，方差分析及两两比较显示，试验组小鼠NK细胞活性与空白组和对照组相比有统计学显著性差异(P＜0.01)，该项实验结果阳性。

[0146] 表14 组合物胶囊对小鼠NK细胞活性的影响

[0147]

[0148] 3、小结：

[0149] 经口给予小鼠不同剂量的组合物胶囊30d，对小鼠体重增长、胸腺/体比值、脾/体比值均无影响。细胞免疫功能实验中ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验为阴性。二硝基氟苯诱导小鼠迟发性变态反应实验为阳性。体液免疫功能实验中抗体生成细胞检测实验为阳性，血清溶血素测定实验为阴性。单核-巨噬细胞吞噬功能实验中小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验为阴性，小鼠碳粒廓清实验为阳性。NK细胞活性测定实验为阳性。

[0150] 综上所述，根据保健食品增强免疫力功能评价标准，本发明制备的组合物胶囊具有增强免疫力的功能，且按照本发明配比制备组合物胶囊时，当纳豆冻干粉、银杏叶提取物和沙棘粉均存时效果最优，通过三者的合理配伍，可以有助于实现达到稳定人体内环境的目的，促进人体体液及细胞免疫，清除体内过量自由基，从而有效增强免疫力功能。