一种增强体外培养间充质干细胞生物抗氧化功能的细胞外基质生物材料、制备方法及其应用

摘要

本发明提供一种增强体外培养间充质干细胞生物抗氧化功能的细胞外基质生物材料、制备方法及其应用，该细胞外基质生物材料的制备步骤如下：脐带间充质干细胞培养在完全培养基中，密度≥90%时，加入完全培养液培养7-10天，每3天换液一次，之后加入脱细胞液，构建成细胞外基质生物材料。本发明的细胞外基质生物材料能够增强体外培养间充质干细胞生物抗氧化功能。

权利要求

1.一种增强体外培养间充质干细胞生物抗氧化功能的细胞外基质生物材料，其特征在于由以下步骤制备而成：脐带间充质干细胞培养在完全培养基中，密度≥ 90% 时，加入完全培养液培养7-10 天，每3 天换液一次，之后加入脱细胞液，构建成细胞外基质生物材料；

所述完全培养基组分为α-MEM 和胎牛血清，它们的体积比为（4-9）:1，并且含有抗生素，抗生素的含量为10~200 U/mL；

所述完全培养液中含有抗坏血酸100-200uM。

2.根据权利要求1 所述的一种增强体外培养间充质干细胞生物抗氧化功能的细胞外基质生物材料，其特征在于：所述脱细胞液由pH值为7.4的磷酸盐缓冲液配制，含有TritonX-100 0.5~5% 体积比和氨水10-40mM。

3.根据权利要求1 所述的一种增强体外培养间充质干细胞生物抗氧化功能的细胞外基质生物材料，其特征在于：所述脐带间充质干细胞取自人源、猪源、鼠源或兔源。

4.一种增强体外培养间充质干细胞生物抗氧化功能的细胞外基质生物材料的制备方法，其特征在于制备步骤如下：脐带间充质干细胞培养在完全培养基中，密度≥ 90% 时，加入完全培养液培养7-10 天，每3 天换液一次，之后加入脱细胞液，构建成细胞外基质生物材料；

所述完全培养基组分为α-MEM 和胎牛血清，它们的体积比为（4-9）:1，并且含有抗生素，抗生素的含量为10~200 U/mL；所述完全培养液中含有抗坏血酸100-200uM。

说明书

一种增强体外培养间充质干细胞生物抗氧化功能的细胞外基

质生物材料、制备方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种增强体外培养间充质干细胞生物抗氧化功能的细胞外基质生物材料、制备方法及其应用。

背景技术

[0002] 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种负责组织再生和修复的成体干细胞，最初发现于骨髓中，由于其再生和免疫调节的潜能，已在各大领域引起广泛的关注。人类脐带间充质干细胞，尤其是来源于Wharton's jelly（脐带中包绕两条脐动脉和一条脐静脉黏蛋白样结缔组织）被认为是细胞治疗和再生医学中理想的种子细胞。脐带是一种胚胎外组织，因此脐带间充质干细胞具备胚胎干细胞和成体干细胞的双重特性，其自我更新及多向分化潜能明显优于骨髓间充质干细胞。

[0003] 有越来越多的证据表明，活性氧(ROS)对细胞增殖、分化、死亡、基质环境的稳态、氧化还原信号机制等是必不可少的，但细胞异常水平的ROS会导致DNA、蛋白质、脂类不可逆转的损害，最终细胞走向衰老和死亡的命运。

[0004] 尽管MSCs在再生医学中的应用得到广泛关注，但其在体外扩增和体内移植过程中却不可避免的暴露于相当大的氧化应激之下，造成ROS（如过氧化氢、羟基自由基、超氧化物阴离子自由基）超标。体外长期培养的MSCs内H2O2水平增加，导致细胞衰老和增殖抑制。骨性关节炎和类风湿关节炎患者体内软骨细胞或中性粒细胞和巨噬细胞产生异常水平的ROS，影响MSCs的再生潜力。研究表明，ROS的累积是由于接触炎症细胞因子引起，从而抑制干细胞的细胞增殖和多向分化潜能。

[0005] ROS生成和消除之间的平衡对细胞生存、增殖、分化至关重要。超氧化物歧化酶(SOD),包括含有铜、锌(SOD1和 SOD2)和锰(SOD2)的同功酶，保护MSCs免受超氧化物阴离子催化生成的H2O2的活性氧损害。氧化应激可以消除SOD2引起的人类滑膜起源的间充质干细胞的软骨分化能力下降和基质金属蛋白酶的表达增加。此外，SOD产生的H2O2被过氧化氢酶（catalase）所中和，先前的大量研究表明，提高MSCs内的catalase活性有利于缓解H2O2诱导的细胞凋亡。

[0006] MSC起源的细胞外基质(ECM)组分包含 I型和III型胶原蛋白，纤连蛋白、层粘连蛋白，可以充当体外培养系统的微环境，促进MSC扩增、指引MSC向特定方向分化。脱细胞的ECM不仅可以模拟体内干细胞细胞外微环境，还可调节生长因子和激素的生物学行为。这种运用脱细胞的ECM的培养方法可防止细胞复制衰老，增强终末分化细胞的再分化能力，如软骨细胞和髓核细胞。最近的研究表明，脱细胞的ECM能改善骨髓间充质干细胞抵抗H2O2诱导的氧化应激和细胞周期停滞。然而， ECM对脐带间充质干细胞内抗氧化系统的影响却鲜有人知。

发明内容

[0007] 解决的技术问题：针对现有的MSCs在体外扩增和体内移植过程中不可避免的暴露于相当大的氧化应激之下，造成ROS超标的缺点，本发明提供一种增强体外培养间充质干细胞生物抗氧化功能的细胞外基质生物材料、制备方法及其应用，通过脐带间充质干细胞分泌基质制备细胞外基质生物材料，不仅具有多种蛋白质成分的特征，而且能用于间充质干细胞的体外扩增，具有生物相容性好、增殖效率高、显著降低细胞内活性氧含量的优点。

[0008] 技术方案：

[0009] 本发明的检测内容包括（：1）细胞外基质生物材料对UC-MSCs增殖能力的影响；（2）细胞外基质生物材料对UC-MSCs内ROS和H2O2 表达的影响；（3）细胞外基质生物材料对UC-MSCs内SOD-2表达的影响；（4）细胞外基质生物材料对UC-MSCs内Catalase活性的影响。

[0010] 上述所述的内容通过以下步骤实现：

[0011] （A）脐带间充质干细胞（umbilical cord-derived mesenchymal stem cells ，UC-MSCs)培养在完全培养基中（完全培养基组分为α-MEM和胎牛血清，它们的体积比为（4-9）:1，并且含有抗生素，抗生素的含量为10~200 U/mL），密度≥90%时，加入含有抗坏血酸(100-200uM)的完全培养液培养7-10天，每3天换液一次，之后加入脱细胞液（由pH值为7.4 的磷酸盐缓冲液配制，含有Triton X-100 0.5~5% 体积比和氨水10-40mM），构建成细胞外基质生物材料；

[0012] （B）UC-MSCs分别培养在普通的孔板（TCPS板）和底部铺有细胞外基质生物材料的孔板（ECM板）中，在不同的时间点检测孔板中DNA含量，二乙酸荧光素（FDA）染色记录不同时间点的细胞数量及形态变化；

[0013] （C）检测TCPS板和ECM板上UC-MSCs内ROS和H2O2含量；

[0014] （D）检测TCPS板和ECM板上UC-MSCs内SOD-2含量和Catalase活性。

[0015] 所述UC-MSCs取自人源、猪源、鼠源或兔源。

[0016] 所述细胞外基质生物材料可应用于包括细胞移植治疗和再生医学等领域。

[0017] 上述所述的内容具体分析步骤如下：

[0018] （1）FDA染色、DNA定量检测分析细胞外基质生物材料对UC-MSCs增殖能力的影响。

[0019] （2）DCF-DA荧光定量法检测细胞内ROS水平。

[0020] （3）H2O2检测试剂盒检测细胞内H2O2水平。

[0021] （4）Western bort检测细胞内SOD-2含量。

[0022] （5）Catalase活性检测试剂盒检测细胞内Catalase活性水平。

[0023] H2O2是ROS主要成分之一，在细胞增殖中起着双重作用。低水平的H2O2 (<10μM)刺激成纤维细胞生长，而细胞暴露于高浓度的H2O2 (>400μM)则会快速凋亡。本发明的方案表明，细胞外基质生物材料培养细胞的细胞内H2O2水平下降，是支持细胞体外生存和快速增殖的一个重要原因。此外，超氧化物阴离子以剂量依赖的方式影响细胞增殖，低水平的超氧化物阴离子刺激细胞增殖，浓度增加则会抑制细胞生长。

[0024] 增强抗氧化能力引起UC-MSCs中ROS水平下降，临床治疗方面有着广泛的应用。骨性关节炎中软骨细胞的SOD-2活性受损不仅导致其氧化损伤，还能加快骨性关节炎的发病进程。

[0025] MSCs广泛应用于细胞移植治疗和组织工程的研发，然而病理条件下超标的ROS产生的炎症细胞因子改变了MSCs的某些特性，影响其生存。因此在体内移植的过程中，防止细胞氧化应激损伤和提高细胞存活率显得尤为重要。先前的研究证明细胞培养在源自滑膜细胞或骨髓细胞的脱细胞ECM显著降低ROS水平，这样阐明ECM调控细胞内抗氧化防御的潜在分子机制将变得很有意义。

[0026] 有益效果：本发明提供的一种增强体外培养间充质干细胞生物抗氧化功能的细胞外基质生物材料、制备方法及其应用，MSCs在该细胞外基质生物材料中培养比在TCPS板上培养的细胞内抗氧化活性的酶表达水平更高，尤其是SOD-2和Catalase；SOD-2和Catalase活性增强导致ROS和H2O2水平减少，因此细胞外基质生物材料能够增强体外培养间充质干细胞生物抗氧化功能。

附图说明

[0027] 图1为FDA染色记录不同时间点TCPS板和ECM板上UC-MSCs的增殖情况图。

[0028] 图2为DNA定量检测分析不同时间点TCPS板和ECM板上UC-MSCs的增殖情况图。

[0029] 图3为TCPS板和ECM板上UC-MSCs内ROS和H2O2含量变化图。

[0030] 图4为TCPS板和ECM板上UC-MSCs内SOD-2含量变化图。

[0031] 图5为TCPS板和ECM板上UC-MSCs内Catalase活性变化图。

具体实施方式

[0032] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。

[0033] 实施例1

[0034] 具体实验步骤如下：

[0035] （1）人源UC-MSCs在37℃、5%CO2 培育箱中培养于175cm2培养瓶中，每三天换一次液，其中培养基各组分的体积比为89%的α-MEM，10%的胎牛血清，1%的青霉素、链霉素；

[0036] （2）当细胞密度≥90%时用0.25% trypsin-EDTA消化细胞，按5000/cm2密度接种于预处理的多种规格的孔板中培养，直到达到90%融合，加入100μM 抗坏血酸继续培养8天，三天换液一次，其中接种方法为TCPS板用0.2%明胶在37℃环境下孵育1小时，接着用1%戊二醛和1M乙醇胺在室温下孵育30分钟，多种规格的板分为12孔板用于FDA染色、DNA定量检测，6孔板用于ROS、H2O2、Catalase含量测定，75cm2培养瓶用于SOD-2蛋白分析；

[0037] （3）8天后为了获得游离的细胞外基质生物材料，培养细胞加入脱细胞混合液，于37℃环境下孵育5分钟，其中脱细胞混合液由pH值为7.4 的磷酸盐缓冲液配制，含有0.5%Triton X-100和20mM氨水；

[0038] （4）将脱细胞的细胞外基质生物材料用PBS 清洗3次，最后一次用含有1X双抗的PBS清洗并保留在孔板中，4℃存储在无菌环境中备用。

[0039] （5）UC-MSCs以5000/cm2密度分别接种在TCPS板和ECM板中，于37℃、5%CO2环境下培养。

[0040] 检测项目和方法如下：

[0041] 1、细胞外基质生物材料对UC-MSCs增殖能力、胞内ROS、H2O2水平的影响。

[0042] A. 细胞外基质生物材料对UC-MSCs增殖能力的影响。

[0043] 细胞生存能力采用FDA染色评估，分别于第1，3，5，7天用FDA染色，细胞被PBS清洗一次后用5μg/ml FDA染液在37℃避光孵育 10分钟，PBS洗涤一次后，用Olympus IX51 倒置显微镜拍照，其中FDA用丙酮配成1000X储存浓度，使用时用培养液稀释；

[0044] 细胞增殖由DNA定量检测分析评估，使用Quant-iTTM PicoGreen®dsDNA分析试剂盒。分别在第1，3，5，7天用胰酶消化细胞，将DNA样品收集在1.5ml EP管中，高速离心后去除上清液，每组收集4管。每管加入200μL木瓜蛋白酶溶解缓冲液(溶解在PBS中的终浓度为125μg /ml)，60℃水浴4小时，让细胞充分裂解。相同数量的溶解产物和反应试剂添加到96孔板中，室温避光孵育5分钟，用SynergyMx多功能酶标仪在485/520 nm(激发波长/发射波长)下测定样品的荧光强度，每组设置6个复孔。

[0045] 检测结果如图1和图2所示，细胞外基质生物材料明显提高UC-MSCs的增殖能力。FDA染色表明培养在ECM上的干细胞形态呈现出纺锤型，各个时间点细胞数量明显多于TCPS组（Scale bar = 100 μm）； ECM板上各个时间点DNA含量显著多于TCPS板。

[0046] B. 细胞外基质生物材料对UC-MSCs内ROS和H2O2含量变化的影响。

[0047] DCF-DA荧光定量法检测细胞内ROS水平。每管至少收集2×105个细胞，在10μM 2′,7′二氯荧光素二乙酸(DCF-DA)中37ºC避光水浴30分钟。使用Cytomics FC500流式细胞分析仪测量荧光强度。

[0048] 细胞内H2O2水平的检测运用Amplex® Red Hydrogen Peroxide检测试剂盒。培养在TCPS板和ECM板上的细胞用细胞裂解液裂解后提取上清液，裂解产物与反应试剂混合后孵育30分钟。用SynergyMx多功能酶标仪在530/590 nm (激发波长/发射波长)测定样品的荧光强度。

[0049] 检测结果如图3所示，ECM板上UC-MSCs内ROS和H2O2含量显著低于TCPS板。

[0050] 2、细胞外基质生物材料对UC-MSCs内SOD-2含量及Catalase活性变化的影响。

[0051] A. 细胞外基质生物材料对UC-MSCs内SOD-2含量变化的影响

[0052] 75cm2培养瓶培养的细胞外基质生物材料细胞用胰酶消化后转移到1.5ml EP管中，高速离心后去除上清液，每管加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液100ul冰上裂解30分钟，高速离心后取上清液，使用BCA蛋白定量试剂盒(碧云天)测定蛋白浓度。等量提取的蛋白在10%聚丙烯酰胺凝胶中变性和分离，然后由电泳转移到硝酸纤维素膜上，膜在PBS稀释过的SOD-2，α-tubulin抗体中4℃过夜孵育，接着膜在稀释的辣根过氧化物酶中继续孵育1小时，加入化学发光试剂盒后曝光显影，使用ImageJ软件对目标蛋白量化。

[0053] 检测结果如图4所示，细胞外基质生物材料明显增加UC-MSCs内SOD-2含量。

[0054] B. 细胞外基质生物材料对UC-MSCs内Catalase活性的影响

[0055] 细胞内Catalase活性水平的检测运用商用Catalase活性检测试剂盒。培养在TCPS板和ECM板上的细胞用细胞裂解液裂解后提取蛋白上清液，总蛋白使用BCA蛋白定量试剂盒测定，每组等量的蛋白样品与试剂盒中的比色反应底物溶液混合后室温孵育15分钟，尽快用酶标仪测定样品在520 nm处的吸光度。

[0056] 检测结果如图5所示，细胞外基质生物材料明显提高UC-MSCs内Catalase活性水平。

[0057] 综上实验表明，细胞外基质生物材料能明显提高UC-MSCs的增殖能力，降低UC-MSCs内ROS和H2O2含量，增加UC-MSCs内SOD-2含量，提高UC-MSCs内Catalase活性水平，有效预防干细胞氧化应激损害，在细胞移植治疗和再生医学等领域着广泛的应用前景。