一种增强型CIK细胞制剂及其制备方法

摘要

本发明提供了一种免疫增强型CIK细胞制剂及其制备方法。将抗CD3/抗CD226的双特异性抗体同时包被，在CIK细胞培养过程中，使用重组人干扰素‑α2α和重组人干扰素‑α2β以及PHA。

权利要求

1.一种免疫增强型CIK细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一：配包被液：离心管中加入生理盐水，向其中加入Retronectin、抗CD3单抗及抗CD226单抗；

步骤二：CIK细胞诱导培养的方法步骤如下：

1)分离外周血单个核细胞；收集非贴壁细胞，加入重组人干扰素-α2a、重组人干扰素-α

2b和PHA；

2)将步骤1)得到的细胞移入经步骤一所述包被液包被过的CIK细胞培养瓶中，并加入CIK细胞专用培养基；

所述CIK细胞专用培养基是含有浓度为50U/ml-1000U/ml的IL-1α，含有浓度为100U/ml-2000U/ml的IL-2，含有浓度为1ng/ml-200ng/ml的IL-7，含有浓度为1ng/ml-200ng/ml的IL-15，含有浓度为1ng/ml-200ng/ml的IL-21的淋巴细胞培养基；

3)连续培养，离心收集得到免疫增强型CIK细胞。

2.根据权利要求1所述的免疫增强型CIK细胞的制备方法，其特征在于：所述Retronectin的浓度为5-50ug/ml；抗CD3单抗的浓度为50ng/ml-200ng/ml；抗CD226单抗的浓度为50ng/ml-200ng/ml。

3.根据权利要求1所述的免疫增强型CIK细胞的制备方法，其特征在于：所述重组人干扰素-α2a的浓度为：300-2000U/ml；重组人干扰素-α2b的浓度为：300-2000U/ml；PHA的浓度为：10-50μg/ml。

4.根据权利要求1所述的免疫增强型CIK细胞的制备方法，其特征在于：所述淋巴细胞培养基是RPMI-1640培养基。

5.含有权利要求1-4任一所述方法制备得到的CIK细胞的CIK细胞制剂。

6.根据权利要求5所述的CIK细胞制剂，其特征在于：所述CIK细胞制剂还包含人血清白蛋白、胸腺五肽以及生理盐水。

7.根据权利要求6所述的CIK细胞制剂，其特征在于：所述人血清白蛋白的浓度为1-

20g/L，所述胸腺五肽的浓度为10-100μg/ml，所述生理盐水中NaCl的质量分数为0.9％。

说明书

一种增强型CIK细胞制剂及其制备方法

技术领域：

[0001] 本发明属于免疫细胞体外培养领域，尤其是涉及一种免疫增强型CIK细胞制剂及其制备方法。背景技术：

[0002] 目前，随着肿瘤学、免疫学以及细胞分子生物学等相关学科的迅速发展和交叉渗透，各种形式的肿瘤免疫治疗方法正逐渐由试验走向临床应用，而过继性免疫治疗是目前较为常用的一种肿瘤免疫治疗方式，成为现代肿瘤治疗中继手术、放疗、化疗后的第四大治疗模式。过继性免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy，ACI)是通过在体外大量分选扩增高活性的免疫效应细胞，并将其输给患者以增强患者细胞免疫功能的一种行之有效的肿瘤治疗方式。此类免疫细胞的种类包括了细胞因子诱导的杀伤性T细胞(CIK)、肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)、特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或经转基因技术改造后的T淋巴细胞(例如CAR-T细胞)等。在众多的免疫细胞中，CIK细胞因其兼具T淋巴细胞强大的杀瘤活性和非MHC限制性杀瘤特征，在临床上得以广泛应用。

[0003] CIK细胞能通过体外诱导而得以扩增，常规的CIK制备方法是将分离的外周血单个核细胞(PBMC)用IFN-γ预处理24h后，加入CD3mAb，IL-1α和IL-2因子进行刺激诱导，最终获得一定数量的CIK细胞，但最终获得的CIK细胞的增殖倍数和细胞毒活性都不很理想。近年来以此为基础，一些研究人员也尝试使用一些可以刺激细胞生长的细胞因子如IL-12、IL-15、IL-7、IL-24、SCF、FLT3L等，但这些因子的使用多数仅在一定程度上促进细胞的增殖，对细胞毒活性的提高不够理想，尤其在CIK细胞中主要效应细胞是表达CD3+CD56+表面分子的NKT样细胞，兼具有T淋巴细胞和NK细胞的双重特性，因此探索建立能同时提高这两类细胞效应分子的细胞培养体系是十分必要的。
发明内容：

[0004] 本发明提供一种新型免疫增强型CIK细胞制剂，具有增殖能力强、杀瘤谱广、杀瘤活性强、非MHC限制性，对多重耐药肿瘤细胞敏感等其它一些效应细胞无法比拟的优点。所述CIK细胞为经由外周血单个核细胞(PBMC)扩增培养成的由细胞因子诱导的杀伤细胞。本发明解决的技术问题是常规CIK扩增方法所得到的CIK细胞增殖倍数和细胞毒活性不够理想的问题，并针对这些问题提供了一种新的用于扩增CIK的方法。

[0005] 本发明提供了一种高效扩增并具有高细胞毒性的免疫增强型CIK细胞制剂及其制备方法，该CIK细胞制剂对细胞毒活性效果的维持更为稳定，同时满足了对细胞高增殖能力的要求，有利于临床应用效果的提高。本发明还进一步提供了一种用于体外培养CIK的细胞制剂。

[0006] 与常规仅单纯向培养体系中添加多种促进细胞生长的细胞因子的CIK细胞培养方法相比较，本发明CIK细胞制剂及其制备方法具有诸多特点。

[0007] 在本发明的一个实施方案中，将抗CD3/抗CD226的双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)同时包被，其中CD3单克隆抗体起到丝裂原活性作用，可通过与T细胞表面CD3分子交联，诱导其活化；作为NK细胞活化受体的CD226主要表达于活化T细胞和NK细胞表面，参与人混合淋巴细胞反应中杀伤性T细胞、NK细胞的活化聚集，引起NK细胞和T细胞表面活化分子CD69的表达升高，细胞因子(IFN-γ)与颗粒酶B(Granzyme B)的表达都明显升高，可以显著提高CIK细胞中NK样T细胞的杀伤活性。

[0008] 在CIK细胞培养过程中，常规加入IFN-γ刺激，PBMC会发生凋亡，影响了细胞的扩增。因此在本发明的另一个实施方案中，选用具有更强刺激免疫细胞的杀伤活性、参与免疫调节的I型干扰素：重组人干扰素-α2α和重组人干扰素-α2β；PHA具有高效的促进免疫细胞增殖的作用，作为T细胞的强刺激剂，促进免疫活性细胞前体向免疫活性细胞转化，有效提高CIK细胞尤其CD3+CD56+细胞的增殖倍数。

[0009] 在本发明的优选实施方案中，将抗CD3/抗CD226的双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)同时包被，同时在CIK细胞培养过程中，使用重组人干扰素-α2α和重组人干扰素-α2β以及PHA。

[0010] 一方面，本发明提供一种免疫增强型CIK细胞的制备方法，包括以下步骤：

[0011] 步骤一：配包被液：离心管中加入生理盐水，向其中加入Retronectin、抗CD3及抗CD226单抗；

[0012] 步骤二：CIK细胞诱导培养的方法步骤如下：

[0013] 1)分离外周血单个核细胞；收集非贴壁细胞，加入重组人干扰素-α2α、重组人干扰素-α2β和PHA；

[0014] 2)将步骤1)得到的细胞移入经Retronectin、抗CD3和抗CD226双特异性抗体包被过的CIK细胞培养瓶中，并加入CIK细胞专用培养基；

[0015] 所述CIK细胞专用培养基是含有浓度为50U/ml-1000U/ml的IL-1α，含有浓度为100U/ml-2000U/ml的IL-2，含有浓度为1ng/ml-200ng/ml的IL-7，含有浓度为1ng/ml-
200ng/ml的IL-15，含有浓度为1ng/ml-200ng/ml的IL-21的淋巴细胞培养基；

[0016] 3)连续培养，离心收集得到免疫增强型CIK细胞。

[0017] 优选地，本发明提供的免疫增强型CIK细胞的制备方法包括以下步骤：

[0018] 步骤一：配包被液：离心管中加入生理盐水，向其中加入Retronectin、抗CD3及抗CD226单抗。其中所述Retronectin的优选浓度为5-50ug/ml；所述抗CD3的使用优选浓度为50ng/ml-200ng/ml；所述抗CD226的使用浓度优选为50ng/ml-200ng/ml。

[0019] 步骤二：进一步CIK细胞诱导培养的方法步骤为：

[0020] 1)取离体肝素抗凝外周血，加于人淋巴细胞分离液上，分离出外周血单个核细胞(PBMC)；

[0021] 2)收集非贴壁细胞，采用淋巴细胞培养基调整细胞浓度，加入重组人干扰素-α2α、重组人干扰素-α2β和PHA，于培养箱培养；

[0022] 其中：所述的重组人干扰素-α2α的优选浓度为：300-2000U/ml；所述的重组人干扰素-α2β的优选浓度为：300-2000U/ml；所述的PHA的优选浓度为：10-50μg/ml；

[0023] 3)将细胞移入经Retronectin、抗CD3和抗CD226双特异性抗体包被过的CIK细胞培养瓶中，并加入CIK细胞专用培养基；

[0024] 其中所述CIK细胞专用培养基是含有浓度为50U/ml-1000U/ml的IL-1α，含有浓度为100U/ml-2000U/ml的IL-2，含有浓度为1ng/ml-200ng/ml的IL-7，含有浓度为1ng/ml-200ng/ml的IL-15，含有浓度为1ng/ml-200ng/ml的IL-21的淋巴细胞培养基；所述淋巴细胞培养基优选是RPMI-1640培养基；

[0025] 4)培养2-7天后，添加含有IL-2的淋巴细胞培养基，并控制细胞密度在(1-3)X106/ml，其中：所述IL-2的优选浓度为100U/ml-2000U/ml；

[0026] 5)连续培养，离心收集得到免疫增强型CIK细胞。

[0027] 另一方面，本发明提供了一种CIK细胞制剂，所述CIK细胞制剂是由本发明所述用于扩增免疫增强型CIK细胞的方法制备的CIK细胞制剂。优选地，本发明CIK细胞制剂还包含人血清白蛋白、胸腺五肽以及生理盐水。更优选地，所述本发明CIK细胞制剂中人血清白蛋白的浓度为1-20g/L、胸腺五肽的浓度为10-100μg/ml，生理盐水中NaCl的质量分数为0.9％。所述CIK细胞制剂的制备方法一般是将CIK细胞重悬于含有人血清白蛋白以及胸腺五肽的生理盐水中。

[0028] 再一方面，本发明提供了一种CIK细胞专用培养基，其特征在于其是含有浓度为50U/ml-1000U/ml的IL-1α，浓度为100U/ml-2000U/ml的IL-2，浓度为1ng/ml-200ng/ml的IL-7，浓度为1ng/ml-200ng/ml的IL-15，浓度为1ng/ml-200ng/ml的IL-21的RPMI-1640培养基。

[0029] 在本发明优选的免疫增强型CIK细胞的制备方法实施方案中，包括以下步骤：

[0030] 步骤一：配包被液：在离心管中加入生理盐水，其中加入Retronectin、抗CD3及抗CD226单抗；

[0031] 其中：所述Retronectin的优选浓度为5-50ug/ml；所述抗CD3的使用优选浓度为50ng/ml-200ng/ml；所述抗CD226的使用浓度优选为50ng/ml-200ng/ml。

[0032] 步骤二：将包被液加入培养瓶，平放，混匀，避光，过夜；

[0033] 步骤三：进一步CIK细胞诱导培养的方法为：

[0034] 1)应用淋巴细胞分离液分离出PBMC，进行CIK细胞培养：取离体肝素抗凝外周血，加于等量人淋巴细胞分离液上，分离出外周血单个核细胞(PBMC)，用淋巴细胞培养基调整细胞浓度为(4-6)X106/ml，置于培养箱培养；

[0035] 2)收集非贴壁细胞，采用淋巴细胞培养基调整细胞浓度为(1-2)X106/ml，并加入重组人干扰素-α2α、重组人干扰素-α2β和PHA于37℃5％CO2饱和湿度条件下培养箱培养；

[0036] 其中：所述的重组人干扰素-α2α的浓度：300-2000U/ml；所述的重组人干扰素-α2β的浓度：300-2000U/ml；所述的PHA的浓度：10-50μg/ml；

[0037] 3)将细胞移入经Retronectin、抗CD3和抗CD226双特异性抗体包被过的CIK细胞专用培养瓶中，并加入CIK细胞专用培养基；

[0038] 其中：所述Retronectin的优选浓度为5-50ug/ml；所述抗CD3的使用优选浓度为50ng/ml-200ng/ml；所述抗CD226的使用浓度优选为50ng/ml-200ng/ml。CIK细胞专用培养基是含有浓度为50U/ml-1000U/ml的IL-1α，浓度为100U/ml-2000U/ml的IL-2，浓度为1ng/ml-200ng/ml的IL-7，浓度为1ng/ml-200ng/ml的IL-15，浓度为1ng/ml-200ng/ml的IL-21的RPMI-1640培养基；

[0039] 4)培养3-5天后，添加含有IL-2的淋巴细胞培养基，并控制细胞密度在(1-3)X106/ml，其中：所述IL-2的浓度为100U/ml-2000U/ml；

[0040] 5)连续培养14-21天后，离心收集得到免疫增强型CIK细胞。

[0041] 附图简要说明：

[0042] 附图1和附图2是CIK细胞免疫表型流式细胞检测结果。

[0043] 附图3是细胞培养上清IFN-γ浓度的测定的检测结果。

[0044] 附图4是CIK细胞对肺腺癌耐药细胞的杀伤作用检测结果。

具体实施方式

[0045] 下述实施例中所使用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。其中PHA：购自美国sigma公司，货号L2769；Retronectin：购自日本Takara公司，货号T100B。

[0046] 实施例1免疫增强型CIK细胞的制备

[0047] 免疫增强型CIK细胞的制备包括以下步骤：

[0048] 1)应用淋巴细胞分离液分离出PBMC，进行CIK细胞培养：取离体肝素抗凝外周血50ml，加于等量人淋巴细胞分离液上，分离出外周血单个核细胞(PBMC)，用淋巴细胞培养基调整细胞浓度为5X106/ml，置于37℃5％CO2培养箱培养2h；

[0049] 2)收集非贴壁细胞，采用淋巴细胞培养基调整细胞浓度为1.5X106/ml，并加入重组人干扰素-α2α、重组人干扰素-α2β和PHA于37℃5％CO2饱和湿度条件下培养箱培养24h；

[0050] 其中：所述的重组人干扰素-α2α的浓度为：1000U/ml；所述的重组人干扰素-α2β的浓度为：1000U/ml；所述的PHA的浓度为：20μg/ml；

[0051] 3)将细胞移入经经Retronectin、抗CD3和抗CD226双特异性抗体包被过的CIK细胞专用培养瓶中，并加入CIK细胞专用培养基；

[0052] 其中：所述Retronectin的使用浓度为30ug/ml；所述抗CD3的使用浓度为100ng/ml；所述抗CD226的使用浓度为100ng/ml；所述CIK细胞专用培养基是含有IL-1α浓度为500U/ml，IL-2浓度为500U/ml，IL-7的浓度为100ng/ml，IL-15的浓度为100ng/ml，IL-21的浓度为100ng/ml的RPMI-1640培养基。

[0053] 4)培养3天后，添加含有IL-2的淋巴细胞培养基，并控制细胞密度在(1-3)X106/ml，其中：所述IL-2的浓度为100U/ml-2000U/ml；

[0054] 5)连续培养15天后，离心收集得到免疫增强型CIK细胞。

[0055] 实施例2常规方法CIK细胞的制备

[0056] 包括以下步骤：常规的CIK制备方法是将分离的外周血单个核细胞(PBMC)后，加入CD3mAb，IL-1α和IL-2因子进行刺激诱导，最终获得一定数量的CIK细胞。

[0057] 1)应用淋巴细胞分离液分离出PBMC，进行CIK细胞培养：取离体肝素抗凝外周血50ml，加于等量人淋巴细胞分离液上，分离出外周血单个核细胞(PBMC)，用淋巴细胞培养基
6
调整细胞浓度为5X10/ml，置于37℃5％CO2培养箱培养2h；

[0058] 2)收集非贴壁细胞，采用淋巴细胞培养基调整细胞浓度为1.5X106/ml，并加入IFN-γ，于37℃5％CO2饱和湿度条件下培养箱培养24h；所述IFN-γ的浓度为1000U/ml；

[0059] 3)将细胞加入CD3mAb，IL-1α和IL-2因子进行刺激诱导；

[0060] 其中：所述CD3mAb的使用浓度为100ng/ml；CIK细胞培养基是含有IL-1α浓度为500U/ml，含有的IL-2浓度为500U/ml的无血清培养基GT-T551；

[0061] 4)培养3天后，添加含有IL-2的无血清培养基GT-T551，并控制细胞密度在(1-3)X106/ml，其中：所述IL-2的浓度为100U/ml-2000U/ml；

[0062] 5)连续培养15天后，离心收集得到CIK细胞。

[0063] 实施例3免疫增强型CIK细胞制剂的制备

[0064] 将实施例1制备得到的CIK细胞重悬于含有10g/L人血清白蛋白以及浓度为50ug/ml胸腺五肽的质量分数为0.9％生理盐水中，制得免疫增强型CIK细胞制剂。

[0065] 实施例4CIK细胞免疫表型的检测

[0066] 将根据实施例1或2制备的CIK细胞分别取培养第1天和第14天的100ul浓度为106/ml的CIK细胞悬液，分别加入检测用鼠抗人CD3-PerCP-Cy5.5\CD4-FITC\CD8-PE\CD56-APC抗体及同型对照IgG1单抗各5ul，4℃避光孵育30min，经PBS缓冲液洗涤2次后，悬浮细胞在500ul缓冲液PBS中，进行流式细胞检测如图1、图2所示。

[0067] 实施例5细胞培养上清IFN-γ浓度的测定

[0068] 取对数生长期人肝癌细胞系HepG2以5X103细胞/孔铺96孔板，第二天加入实施例2常规方法制备的CIK细胞或实施例1本发明方法制备的以抗CD3和抗CD226双特异性抗体制备的增强型CIK细胞，以效靶比2∶1、10∶1和50∶1的浓度共同孵育48h，收集上清液后用Human IFN-gamma Quantikine ELISA Kit(美国RD公司，产品目录号：DIF50)检测CIK细胞IFN-γ的分泌水平，检测结果如图3所示。

[0069] 结果显示：本发明增强型CIK细胞与四种不同的靶细胞共同培养72小时后，检测细胞培养上清液，均伴有IFN-γ的分泌量明显增高，且由本发明制备的增强型CIK细胞与常规方法制备的CIK相比较，IFN-γ的分泌量显著增高且差异具有显著性(P＜0.05)。

[0070] 实施例6CIK细胞对肺腺癌耐药细胞的杀伤作用检测

[0071] 以CIK细胞为效应细胞，以人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP作为靶细胞，检测对比本发明增强型CIK细胞与常规CIK细胞的杀伤作用。

[0072] 分别取对数生长期的肿瘤细胞，以5X103细胞/孔铺96孔板，第二天加入实施例2常规方法制备的CIK细胞或实施例1本发明方法制备的以抗CD3和抗CD226双特异性抗体制备的增强型CIK细胞，以效靶比2∶1、10∶1和50∶1的浓度共同孵育72h，每个浓度设3个平行孔；弃上清液，PBS洗涤2次后，加入Cell counting Kit CCK-8细胞计数试剂盒中应用液继续培养4h，96孔细胞培养板放入酶标仪中检测在450nm处吸光度OD值，按下列公式计算细胞杀伤率：

[0073] 杀伤率(％)＝[1-(实验组OD值)/CIK对照OD值+靶细胞对照OD值]X100％；实验同时设单纯CIK细胞对照组、靶细胞对照组和空白组。

[0074] 细胞毒作用的检测：对各实验组采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

[0075] 结果如图4所示，表明无论是在2∶1、10∶1和50∶1的不同效靶比条件下，还是在同一个效靶比浓度下，本发明增强型CIK细胞对A549/DDP靶细胞的杀伤作用均大于单纯CIK组。