一种小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记HRM5及其应用

摘要

本发明公开了与小麦寡分蘖基因Ltn3紧密连锁的分子标记HRM5，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该分子标记与小麦寡分蘖基因Ltn3的遗传距离为0.35cM。检测分析表明，该分子标记能准确跟踪所述小麦寡分蘖基因，预测小麦的分蘖特性，进而方便进行分子设计育种。本发明还公开了一种鉴定小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记的方法，利用本发明所提供的方法能够加强分蘖预测的准确性，提高特异株型育种的成功率，加速实现增加小麦单产的目标。

权利要求

1.一种小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记HRM5，其特征在于，所述分子标记HRM5的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述分子标记与小麦寡分蘖基因Ltn3共定位于小麦2D染色体，且与Ltn3之间的遗传距离为0.35cM；

小麦寡分蘖基因Ltn3显著降低小麦分蘖，LOD值大于5.31。

2.权利要求1所述小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记HRM5的鉴定方法，其特征在于，以待测植株样品的基因组DNA作为模板，用荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果进行基因型分型，将与小麦H461分为同一类型的植株鉴定为含有小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记HRM5的植株；

所述荧光定量PCR引物的上游引物序列如SEQ ID No.2所示，下游引物序列如SEQ ID No.3所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）以待测植株样品的基因组DNA作为模板，用荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR扩增；

（2）荧光定量PCR扩增反应体系：SsoFast EvaGreen超混合液5μL、上游引物和下游引物各300ng、模板DNA 100ng、去离子水加至总量为10μL；其中，所述上游引物序列如SEQ ID No.2所示，所述下游引物序列如SEQ ID No.3所示；

（3）荧光定量PCR程序：95℃预变性5分钟；94℃变性15秒、53℃退火30秒，共50个循环；

熔解曲线范围为65 95℃，每0.2℃读一次数，时间为10秒；

~

（4）利用步骤（3）获得的结果进行基因分型。

4.权利要求1所述分子标记HRM5的荧光定量PCR引物，其特征在于，上游引物序列如SEQ ID No.2所示，下游引物序列如SEQ ID No.3所示。

5.权利要求1所述分子标记HRM5在小麦育种中的应用。

6.权利要求4所述的荧光定量PCR引物在分子标记辅助小麦株型育种中的应用。

说明书

一种小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记HRM5及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及小麦分子育种领域，具体涉及一种小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记HRM5及其应用。

背景技术

[0002] 小麦是我国仅次于水稻的第二大粮食作物，历年种植面积分别占耕地面积的22％～30％，粮食作物总面积的22％～27％，主要分布在河南、河北、山东、山西、陕西、江苏、四川、安徽等省份；总产量为1亿吨以上，约占粮食作物产量的22％，是我国约一半人口的主食，因此高产小麦品种的选育一直是育种家关注的重点。

[0003] 小麦产量性状是复杂的数量性状，受多个数量性状基因位点(Quantitative trait locus,QTL)控制，具有遗传力低、受环境影响大、选择难度高的特性，所以在选育过程中，传统的育种方法存在时间长、消费大、成本高、成果小的问题。分子标记辅助育种是一种采用与特定性状相关联的分子标记作为辅助手段进行育种的有效方法，具有不受环境条件限制、在植物发育的整个生长时期均可检测、选择效率高等优势。

[0004] 小麦产量由三个主要因素构成，即产量＝穗数×穗粒数×粒重。分蘖是影响小麦穗数进而影响小麦产量的重要农艺性状之一，同时又是单子叶植物的一种特殊的分枝现象，具有重要的研究意义。

[0005] 小麦分蘖遗传研究总体进展相对缓慢，现阶段国内外工作主要围绕分蘖基因QTL的分子标记定位及其遗传效应开展。部分分蘖突变体由单基因控制，因而一些学者将其作为质量性状来研究(Richards RA.A tiller inhibition gene in wheat and its affect on plant growth.Austr J Agric Res.1988,39:749-757；Duggan BL,Richards RA,Tsuyuzaki H.Environmental effects on the expression of the tiller inhibition(tin)gene in wheat.Funct Plant Biol,2002,29:45–53)。同时，也有很多学者将分蘖作为多基因控制的数量性状来研究(Shaha MM,Gilla KS,Baenziger PS,Yen Y,Kaepplerc SM,Ariyarathne HM.Molecular mapping of loci for agronomic traits on chromosome 3A of bread wheat.Crop Sci.1999,39:1728-1732；谢玥，龙海，侯永翠，郑有良.小麦寡分蘖材料H461分蘖性状的遗传分析.麦类作物学报.2006,26:21-23；王岩.小麦永久F2群体构建及株高和分蘖特性的QTL定位.山东农业大学硕士学位论文,2009；温明星.望水白多分蘖、矮秆突变体的鉴定及相关QTL定位.南京农业大学硕士学位论文,2010；Jinpeng Zhang,Jun Wu,Weihua Liu,Xiang Lu,Xinming Yang,Ainong Gao,Xiuquan Li,Yuqing Lu,Lihui Li.Genetic mapping of a fertile tiller inhibition gene,ftin,in wheat.Mol Breeding.2013,31:441-449)。迄今为止，已报道的分蘖相关主效基因QTL位于1A，2A，3A，6A染色体，微效基因位于5A，3B，7B，1D、5D染色体，其中仅1A和3A上的tin基因研究较深入，完成了精细定位工作。

[0006] 小麦材料H461相对于小麦品种川农16(国审品种)具有寡分蘖、多穗粒数、多小穗数、高千粒重和高穗粒重等特性(侯永翠，郑有良，蒲至恩，魏育明，李伟.穗数型小麦新品种川农16与大穗型寡分蘖品系H461遗传差异研究初报.四川农业大学学报.2003,21:94-9)。同时，小麦品种川麦107和分蘖数显著高于H461。因此，利用H461和川麦107构建遗传研究群体，进一步验证小麦H461的寡分蘖特性，定位控制分蘖基因，寻找紧密连锁的分子标记，促进分蘖基因的图位克隆，同时为小麦特异分蘖材料的创制及株型育种提供新基因资源，进一步利用分子标记辅助选择，将增强分蘖预测的准确性，提高株型育种效率，加速实现增加小麦单产的目标。

[0007] 分子标记辅助选择，不依赖于表现型选择，即不受环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。高分辨熔解曲线(High Resolution Melting,HRM)技术近年来国际上兴起的一种SNP及突变研究工具。这种检测方法具有操作简便、特异性好、高通量、快速、检测成本低、结果准确等优势，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。因此，筛选出与分蘖基因紧密连锁的，且适用于荧光定量PCR平台HRM技术的分子标记，不仅能对小麦分蘖基因进行选择，有效调控小麦分蘖发生，塑造合理的分蘖发生群体，同时提高了选择通量、速度和准确性，解决了大规模推广应用的技术瓶颈，对规模化改良小麦育种群体质量和产量具有重要意义。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于提供与小麦H461寡分蘖基因Ltn3紧密连锁的分子标记。

[0009] 本发明的另一目的在于提供所述分子标记的荧光定量PCR引物。

[0010] 本发明的第三个目的在于提供上述寡分蘖基因Ltn3紧密连锁的分子标记的应用。

[0011] 本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

[0012] 本发明的新寡分蘖基因Ltn3来自小麦H461，该基因位于小麦2D染色体。Ltn3能显著降低小麦分蘖，LOD值大于5.31，解释约12％的表型变异。

[0013] 本发明所提供的分子标记HRM5的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

[0014] 本发明所述分子标记与小麦寡分蘖基因Ltn3共定位于小麦2D染色体，且与Ltn3之间的遗传距离为0.35cM。

[0015] 本发明还提供了一种鉴定小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记的方法，以待测植株样品的基因组DNA作为模板，用荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果进行基因型分型，将与H461分为同一类型的植株鉴定为含有小麦寡分蘖基因Ltn3的植株。

[0016] 可选的，所述方法包括以下步骤：

[0017] (1)以待测植株样品的基因组DNA作为模板，用荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR扩增：

[0018] (2)荧光定量PCR扩增反应体系：SsoFast EvaGreen超混合液5μL、上游引物和下游引物各300ng、模板DNA 100ng、Dnaes/RNase-free去离子水加至总量为10μL；

[0019] (3)荧光定量PCR程序：95℃预变性5min；94℃变性15s、53℃退火30s，共50个循环；熔解曲线范围为65～95℃，每0.2℃读一次数，时间为10s；

[0020] (4)利用步骤(3)获得的结果进行基因分型。

[0021] 其中，所述待鉴定植株的DNA取自小麦样品三叶期的叶片。

[0022] 本发明还提供了所述分子标记的荧光定量PCR引物，其中，上游引物序列如SEQ ID No.2所示，下游引物序列如SEQ ID No.3所示。

[0023] 本发明还提供了所述分子标记HRM5在小麦育种中的应用。

[0024] 本发明还提供了所述分子标记HRM5在制备转基因植物中的应用，其中，所述基因为寡分蘖基因Ltn3。

[0025] 本发明还提供了本分发明所述方法在小麦育种改良中的应用。

[0026] 本方还提供了所述的荧光定量PCR引物在分子标记辅助小麦株型育种中的应用。

[0027] 在本发明中，小麦寡分蘖基因Ltn3及分子标记HRM5是通过以下方法获得的：

[0028] (1)利用寡分蘖小麦H461作为母本，以小麦川农16为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，采用单粒传法获得含有223个株系的F8代RIL群体，随机选择188个株系构成遗传作图群体。

[0029] (2)用CTAB法提取所述的遗传作图群体的各株系的DNA，选取wheatgenomics(http://wheatgenomics.plantpath.ksu.edu/)上公布的覆盖六倍体小麦A、B、D基因组的90K SNP芯片，以亲本H461和川农16的DNA为模版，进行基因分型，获得所述RIL群体的基因型资料。亲本H461的带型记为A，亲本川农16的带型记为B。F8群体株系带型来源于H461的记为A，来源于川农16的记为B，杂合型为H。

[0030] (3)小麦成熟期田间鉴定所述F8群体植株的分蘖数。

[0031] (4)利用JoinMap4.0作图软件将获得的所述RIL群体基因型资料构建小麦分子连锁图谱，寻找最优的标记数和标记顺序，确定后续使用的连锁群。利用软件MapQTL 6.0的区间作图模型(Interval Mapping)和多QTL作图模型(Multiple QTL Model)，并结合F8群体分蘖表型数据将寡分蘖基因Ltn 3定位于2DL染色体上一个3.49cM的区段内。

[0032] (5)获取该区段内的SNP探针序列，通过在IWGSC小麦中国春的基因组测序数据，获得目标区段更多的序列信息，电子延长SNP探针序列两端对应的序列，并进行序列分析，初步筛选用于后续荧光定量PCR引物设计的目标区域。

[0033] (6)设计荧光定量PCR引物，用于后续筛选。利用Beacon Designer 7.0软件设计荧光定量PCR引物10对(见表1)。荧光定量PCR引物设计标准：引物长度18～25bp，扩增产物长度65～100bp，退火温度60℃，GC含量在40％～60％之间，SNP差异位点产物退火温度差异大于0.2℃。

[0034] 表1 10对SSR引物序列及扩增片段长度

[0035]

[0036] (7)高分辨熔解曲线(HRM)分析

[0037] a)亲本之间多态性分子标记的筛选：选取上述设计的10对引物，以亲本H461和CN16的DNA为模版，进行PCR扩增，共获得1对效果良好的荧光定量PCR分子标记引物，命名为HRM5-F/R(核苷酸序列如SEQ ID No.2和3所示)。扩增产物为具有多肽性的分子标记HRM5，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示

[0038] b)F8群体的HRM分析：用上述步骤获得的具有多态性的分子标记HRM5的PCR引物，扩增亲本H461、CN16和F8群体植株的DNA，进行基因型鉴定，获得分子标记数据。亲本H461的类型记为A，扩增片段大小长72bp，单碱基差异位点为C。亲本CN16的类型记为B，扩增片段长72bp，单碱基差异位点为T。F8群体株系类型来源于H461的记为A，来源于CN16的记为B。

[0039] c)连锁图谱的密化：根据分子标记HRM5的鉴定数据，结合90KSNP芯片的基因分型数据，作图软件JoinMap 4.0构建遗传高密度图谱。利用软件MapQTL 6.0的区间作图模型(Interval Mapping)和多QTL作图模型(Multiple QTL Model)，并结合F8群体分蘖表型数据定位寡分蘖基因Ltn3，计算寡分蘖基因Ltn3的位置和分子标记之间的遗传距离，发现分子标记HRM5与小麦寡分蘖基因Ltn3共定位于小麦2D染色体，且与Ltn3之间的遗传距离为0.35cM，LOD值大于5.31，解释表型变异约12％。

[0040] 有益效果：

[0041] 本发明首次公开了来自小麦H461的寡分蘖基因Ltn3，位于小麦2D染色体，显著降低了小麦分蘖。该基因在小麦株型(调控分蘖)育种中具有较高的利用价值。

[0042] 本发明首次公开了基于荧光定量PCR平台精确检测小麦H461新寡分蘖基因Ltn3的分子标记HRM5，且为共显性标记，检测准确高效、扩增方便稳定。

[0043] 本发明公开的分子标记HRM5与寡分蘖基因Ltn3极显著相关，呈现共分离标记特征，用于分子标记辅助选择的准确性高，提高适应不同环境的小麦特定分蘖品种的选择鉴定效率，且成功率高。

附图说明

[0044] 图1为小麦H461寡分蘖基因Ltn3在2D染色体上的位置及与本发明分子标记HRM5之间的连锁遗传图谱。

[0045] 图2为用荧光定量PCR引物对川农16、H461、川麦107及绵麦37三叶期的叶片DNA做基因型分型的结果。

[0046] 图3为H461×川麦107的F7RIL群体后代用荧光定量PCR引物做基因型分型的结果。

具体实施方式

[0047] 下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

[0048] 实施例1

[0049] 本实施例用于说明小麦寡分蘖基因Ltn3及分子标记HRM5的获得方法：

[0050] (1)利用寡分蘖小麦H461作为母本，以小麦川农16为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，采用单粒传法获得含有223个株系的F8代RIL群体，随机选择188个株系构成遗传作图群体。

[0051] (2)用CTAB法提取所述的遗传作图群体的各株系的DNA，选取wheatgenomics(http://wheatgenomics.plantpath.ksu.edu/)上公布的覆盖六倍体小麦A、B、D基因组的90K SNP芯片，以亲本H461和川农16的DNA为模版，进行基因分型，获得所述RIL群体的基因型资料。亲本H461的带型记为A，亲本川农16的带型记为B。F8群体株系带型来源于H461的记为A，来源于川农16的记为B，杂合型为H。

[0052] (3)小麦成熟期田间鉴定所述F8群体植株的分蘖数。

[0053] (4)利用JoinMap4.0作图软件将获得的所述RIL群体基因型资料构建小麦分子连锁图谱，寻找最优的标记数和标记顺序，确定后续使用的连锁群。利用软件MapQTL 6.0的区间作图模型(Interval Mapping)和多QTL作图模型(Multiple QTL Model)，并结合F8群体分蘖表型数据将寡分蘖基因Ltn3定位于2DL染色体上一个3.49cM的区段内。

[0054] (5)获取该区段内的SNP探针序列，通过在IWGSC小麦中国春的基因组测序数据，获得目标区段更多的序列信息，电子延长SNP探针序列两端对应的序列，并进行序列分析，初步筛选用于后续荧光定量PCR引物设计的目标区域。

[0055] (6)设计荧光定量PCR引物，用于后续筛选。利用Beacon Designer 7.0软件设计荧光定量PCR引物10对(如表1所示)。荧光定量PCR引物设计标准：引物长度18～25bp，扩增产物长度65～100bp，退火温度60℃，GC含量在40％～60％之间，SNP差异位点产物退火温度差异大于0.2℃。

[0056] (7)高分辨熔解曲线(HRM)分析

[0057] a)亲本之间多态性分子标记的筛选：选取上述设计的10对引物，以亲本H461和CN16的DNA为模版，进行PCR扩增，共获得1对效果良好的荧光定量PCR分子标记。

[0058] b)F8群体的HRM分析：以上述步骤获得的具有多态性的分子标记HRM5，扩增亲本H461、CN16和F8群体植株的DNA，进行基因型鉴定，获得分子标记数据。亲本H461的类型记为A，扩增片段大小长72bp，单碱基差异位点为‘C’。亲本CN16的类型记为B，扩增片段长72bp，单碱基差异位点为‘T’。F8群体株系类型来源于H461的记为A，来源于CN16的记为B。

[0059] c)连锁图谱的密化：根据分子标记HRM5的鉴定数据，结合90KSNP芯片的基因分型数据，作图软件JoinMap 4.0构建遗传高密度图谱。利用软件MapQTL 6.0的区间作图模型(Interval Mapping)和多QTL作图模型(Multiple QTL Model)，并结合F8群体分蘖表型数据定位寡分蘖基因Ltn3，计算寡分蘖基因Ltn3的位置和分子标记之间的遗传距离，发现分子标记HRM5与小麦寡分蘖基因Ltn3共定位于小麦2D染色体，且与Ltn3之间的遗传距离为0.35cM，LOD值大于5.31，解释表型变异约12％，图1为小麦H461寡分蘖基因Ltn3在2D染色体上的位置及与本发明分子标记HRM5之间的连锁遗传图谱。

[0060] 实施例2

[0061] 1.1DNA的提取

[0062] 试验材料选取H461、川农16(CN16)、川麦107(CM107)及绵麦37(MM37)，其中川农16、川麦107和绵麦37为多分蘖品种，H461为寡分蘖品种。采用CTAB法提取小麦样品三叶期的叶片DNA。

[0063] 1.2检测小麦寡分蘖基因Ltn3的引物的筛选

[0064] 1.2.1引物设计

[0065] (1)获取该区段内的SNP探针序列，通过在IWGS小麦中国春的基因组测序数据，获得目标区段更多的序列信息，电子延长SNP探针序列两端对应的序列，并进行序列分析，初步筛选用于后续荧光定量PCR引物设计的目标区域。

[0066] (2)设计荧光定量PCR引物，用于后续筛选。设计荧光定量PCR引物。荧光定量PCR引物设计标准：引物长度18～25bp，扩增产物长度65～100bp，退火温度60℃，GC含量在40％～60％之间，SNP差异位点产物退火温度差异大于0.2℃。

[0067] 1.2.2荧光定量PCR平台测试引物及其亲本间的差异性

[0068] (1)提取川农16、H461、川麦107及绵麦37三叶期的叶片DNA。

[0069] (2)以步骤(1)所得的DNA作为模板，本发明所述HRM5-F(SEQ ID No.2所示的序列)和HRM5-R(SEQ ID No.3所示的序列)为引物进行荧光定量PCR扩增。

[0070] (3)荧光定量PCR扩增反应体系：SsoFast EvaGreen超混合液5μL、上下游引物各300ng、模板DNA 100ng、Dnaes/RNase-free去离子水加至总量为10μL。

[0071] (4)荧光定量PCR程序：95℃预变性5min；94℃变性15s、53℃退火30s，共50个循环；熔解曲线范围为65～95℃，每0.2℃读一次数，时间为10s。

[0072] (5)以步骤(4)所得结果文件，导入BioRadPrecisionMelt软件进行基因分型，结果如图2。在绘制熔解曲线过程中，根据碱基对A＝T，C≡G解链的温度不同，BioRadPrecisionMelt将样本分为两种类型。H461为类型A，川农16/绵麦37/川麦107为类型B。

[0073] 1.3群体检测过程中引物序列HRM5-F/R的适用性

[0074] (1)以H461为母本，川麦107为父本杂交得到F1，F1自交获得F2，通过单粒传法加代至F7代RIL验证群体。提取群体中各株系三叶期的叶片DNA。

[0075] (2)以步骤(1)所得的DNA作为模板，利用本发明所提供的引物进行荧光定量PCR扩增，荧光染料为SsoFast EvaGreen。

[0076] (3)荧光定量PCR扩增反应体系：5μL SsoFast EvaGreen超混合液、上下游引物各300ng、100ng模板DNA、Dnaes/RNase-free去离子水加至总量为10μL。

[0077] (4)荧光定量PCR程序：95℃预变性5min；94℃变性15s、53℃退火30s，共50个循环；熔解曲线范围为65～95℃，每0.2℃读一次数，时间为10s。

[0078] (5)以步骤(4)所得结果文件，导入BioRadPrecisionMelt软件进行基因分型，结果如图3。随机抽检96株株系，38株能扩增出与H461相同类型的片段，为含有寡分蘖基因Ltn3的植株，预测株系植株在成熟后分蘖数较低。58株能扩增出与川农16、川麦107相同的B型片段，为不含有寡分蘖基因Ltin3的植株，预测这些植株在成熟后分蘖数较高。

[0079] (6)小麦成熟期间田间鉴定该96个F7植株的分蘖数，结果见表2，寡分蘖基因Ltn3的分子标记HRM5预测遗传群体分蘖能力的结果。与H461类型相同的植株平均分蘖数为2.47个，显著低于与川农16、川麦107类型的植株分蘖数(平均9.64)。实际结果与预期结果一致，说明本发明的寡分蘖基因Ltn3确实有显著降低分蘖数的作用；同时本发明的分子标记HRM5可以用与跟踪鉴定寡分蘖基因Ltn3。

[0080] 表2

[0081]

[0082]

[0083]

[0084] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。