本发明公开了一种基于金属离子调控核酸外切酶III剪切作用的DNA比色逻辑门构建方法，属于分子计算机技术领域。含有T‑T或者C‑C错配碱基的双链DNA不能被核酸外切酶III剪切；当存在Hg2+或者Ag+时，通过T‑Hg2+‑T或者C‑Ag+‑C作用形成3′端完全匹配的双链DNA可被核酸外切酶III剪切，释放出的单链DNA与DNA信号探针1或者DNA信号探针2杂交，导致G‑四链体结构的形成或者解体。据此，以Hg2+和Ag+为输入信号，通过DNA信号探针进行逻辑操作，构建了多种DNA比色逻辑门。
1.基于金属离子调控核酸外切酶III剪切作用的DNA比色逻辑门构建方法，其特征在于所述构建方法包括以下步骤：
（1）双链DNA模板的构建：DNA 1和DNA 2、DNA 3和DNA 4、DNA 5和DNA 6、DNA 7和DNA 8、DNA 9和DNA 10、DNA 11和DNA 12分别在缓冲溶液1中混合，形成含有T-T或者C-C错配碱基的双链DNA模板，退火杂交后，于4 °C保存备用；
其中所述DNA 1的3’端与DNA 2的5’端完全互补形成T-T错配碱基的双链DNA模板，且DNA2在3’端具有突出的碱基；所述DNA 3的3’端与DNA 4的5’端完全互补形成C-C错配碱基的双链DNA模板，且DNA 4在3’端具有突出的碱基；所述DNA 5的3’端与DNA 6的5’端完全互补形成TTCC-TTCC错配碱基的双链DNA模板，且DNA 6在3’端具有突出的碱基；所述DNA 7的
3’端与DNA 8的5’端完全互补形成C-C错配碱基的双链DNA模板，且DNA 8在3’端具有突出的碱基；所述DNA 9的3’端与DNA 10的5’端完全互补形成T-T错配碱基的双链DNA模板，且DNA
10在3’端具有突出的碱基；所述DNA 11的3’端与DNA 12的5’端完全互补形成C-C错配碱基的双链DNA模板，且DNA 12在3’端具有突出的碱基；
（2）制备信号探针；富含G碱基的序列G1和G2在缓冲溶液2中混合，退火杂交后形成信号探针1；富含G碱基的序列G3和G4以及另外一条序列S在缓冲溶液2中混合，退火杂交后形成信号探针2；
（3）G-四链体结构的形成与解体：取10 μL Hg2+或者Ag+溶液与20 μL步骤（1）中制备的双链DNA模板溶液反应30分钟，通过T-Hg2+-T或者C-Ag+-C作用形成3′端完全匹配的双链DNA；加入10 μL 600 U/mL的核酸外切酶III溶液反应30分钟，核酸外切酶III将金属离子调控的双链DNA剪切为DNA碎片和一条完整的DNA单链；再加入20 μL步骤（2）中制备的信号探针1或者信号探针2，在37 °C水浴中孵育1小时，信号探针1与剪切出的单链DNA杂交形成G-四链体结构，或者信号探针2与剪切出的单链DNA杂交破坏了信号探针2的G-四链体结构；
（4）显色反应：向步骤（3）制备的G-四链体溶液中加入含10 μL 2μM氯化血红素的HEPES缓冲溶液，室温下反应1小时，形成G-四链体-血红素结构；加入15 μL 3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺-过氧化氢溶液，在G-四链体-血红素的催化作用下，3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺被氧化，溶液颜色由无色变成蓝色，反应4分钟后，用200 μL 2 M的硫酸终止反应，溶液变为黄色，采用紫外光谱测量吸光度值；
（5）DNA逻辑门的构建：取对应的双链DNA模版，以Hg2+和Ag+为输入，通过T-Hg2+-T或者C-Ag+-C作用形成3′端完全匹配的双链DNA，核酸外切酶III剪切双链DNA形成的单链DNA与信号探针1杂交形成G-四链体结构，进而与氯化血红素结合后形成G-四链体-血红素结构，催化3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺显色，构建了OR、AND、INHIBIT和XOR逻辑门；取对应的双链DNA模版，以Hg2+和Ag+为输入，通过T-Hg2+-T或者C-Ag+-C作用形成完全匹配的双链DNA，核酸外切酶III剪切双链DNA形成的单链DNA，与信号探针2中的序列S优先杂交，破坏了信号探针
2的G-四链体结构，使其不能与氯化血红素结合，无法催化3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺的显色反应，溶液为无色，构建了NOR逻辑门；
其中，DNA 1、DNA 2和DNA 3、DNA 4与信号探针1构建OR逻辑门；DNA 5、DNA 6与信号探针1构建AND逻辑门；DNA 1、DNA 2和DNA 7、DNA 8与信号探针1构建INHIBIT逻辑门；DNA 9、DNA 10和DNA 11、DNA 12与信号探针1构建XOR逻辑门；DNA 1、DNA 2和DNA 3、DNA 4与信号探针2构建NOR逻辑门。
2.根据权利要求1所述的基于金属离子调控核酸外切酶III剪切作用的DNA比色逻辑门构建方法，其特征在于步骤（1）中，所述的缓冲溶液1为浓度20 mM、pH 7.4、且含50 mM NaAc和10 mM Mg(Ac)2的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述的基于金属离子调控核酸外切酶III剪切作用的DNA比色逻辑门构建方法，其特征在于步骤（2）中，所述的缓冲溶液2为25 mM、pH 8.0、含20 mM KCl、200 mM NaCl和1% DMSO的HEPES-NH4OH缓冲溶液。
4.根据权利要求1所述的基于金属离子调控核酸外切酶III剪切作用的DNA比色逻辑门构建方法，其特征在于步骤（4）中，所述的HEPES缓冲溶液为浓度25 mM、pH 7.4、含20 mM KCl，200 mM NaCl，0.025% (w/v) Triton X-100和1% (v/v) DMSO的缓冲溶液。
5.根据权利要求1所述的基于金属离子调控核酸外切酶III剪切作用的DNA比色逻辑门构建方法，其特征在于步骤（4）中，所述的15 μL 3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺-过氧化氢溶液为7.5 μL 3 mg/mL 3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺和7.5 μL 1 M过氧化氢。
6.根据权利要求1所述的基于金属离子调控核酸外切酶III剪切作用的DNA比色逻辑门构建方法，其特征在于步骤（3）中，所述的Hg2+和Ag+溶液的浓度均为5 μM。
基于金属离子调控核酸外切酶III剪切作用的DNA比色逻辑门
构建方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种基于金属离子调控核酸外切酶III剪切作用的DNA比色逻辑门构建方法，属于分子计算机技术领域。
背景技术
[0002] 基于硅晶体的计算机通过接收布尔输入信号，产生相应的电子输出信号执行布尔逻辑操作。与之相类似，分子计算包括很多用不同的自底向上的方法对生物分子或者化学分子进行设计的计算，成为计算机技术的另一个热门研究领域。研究者一直致力于可以在分子水平上执行逻辑操作能力的生物和化学系统的研究。DNA逻辑器件可以通过核酸分子之间的杂交反应进行构建，通过立足点控制的链取代反应来构建，通过信标分子探针来构建，通过适配体结合来构建，通过脱氧和酶功能反应来构建，使得DNA作为逻辑门构建的材料，受到越来越多的关注。
[0003] 近年来，核酸分子与金属离子之间的相互作用研究越来越引起研究者的关注。银离子（Ag+）可以特异性地结合双链DNA中胞嘧啶（C）与胞嘧啶的错配碱基对，从而形成稳定的C-Ag+-C碱基对；汞离子（Hg2+）可以结合两个胸腺嘧啶（T），从而形成稳定的T-Hg2+-T碱基对。这种特殊性能对于很多方面的应用有很大的潜能，其中包括，通过构建分子器件来进行金属离子的检测，调控DNA的功能，甚至还包括逻辑门构建方面的应用。Willner等人通过富含C碱基和富含T碱基的序列功能化CdSe/ZnS量子点，采用光学方法对Ag+和Hg2+进行检测，构建了三个逻辑门。Park等人构建了通过金属离子Ag+和Hg2+调控错配位点聚合酶活性的分子逻辑门系统。Zhu等人基于Ag+和Hg2+激活连接酶活性，通过聚合酶辅助的荧光放大信号构建了一系列逻辑门。Hsing等人在含有不同数量错配碱基T-T的双链DNA上研究核酸外切酶III（Exo III）的活性，证实了Exo III的剪切活性可以通过形成T-Hg2+-T来控制。Zhou等人基于Hg2+引发立足DNA的杂交结合Exo III辅助信号放大，构建了一个对Hg2+进行检测的条状生物传感器。但是，上述金属离子的检测方法以及逻辑门的构建方法都需要进行多步操作，而且还要用到高端的仪器设备，这些对于原位检测来说并不适用，对于构建灵敏和完整的逻辑体系还远远不够。因此，构建更加灵敏、简单、快速、选择性好的逻辑体系具有重要意义。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种基于金属离子调控核酸外切酶III剪切作用的DNA比色逻辑门构建方法，它具有方法简单、快速和选择性好的优点。
[0005] 本发明是这样实现的，一种基于金属离子调控核酸外切酶III剪切作用的DNA比色逻辑门构建方法，其特征在于包括以下步骤：
[0006] （1）双链DNA模板的构建：DNA 1和DNA 2、DNA 3和DNA 4、DNA 5和DNA 6、DNA 7和DNA 8、DNA 9和DNA 10、DNA 11和DNA 12分别在缓冲溶液1中混合，形成含有T-T或者C-C错配碱基的双链DNA模板，退火杂交后，于4 °C保存备用；
[0007] （2）制备信号探针；富含G碱基的序列G1和G2在缓冲溶液2中混合，退火杂交后形成信号探针1；富含G碱基的序列G3和G4以及另外一条序列S在缓冲溶液2中混合，退火杂交后形成信号探针2；
[0008] （3）G-四链体结构的形成与解体：取10 μL Hg2+或者Ag+溶液与20 μL步骤（1）中制备的双链DNA模板溶液反应30分钟，通过T-Hg2+-T或者C-Ag+-C作用形成3′端完全匹配的双链DNA；加入10 μL 600 U/mL的核酸外切酶III溶液反应30分钟，核酸外切酶III将金属离子调控的双链DNA剪切为DNA碎片和一条完整的DNA单链；再加入20 μL步骤（2）中制备的信号探针1或者信号探针2，在37 °C水浴中孵育1小时，信号探针1与剪切出的单链DNA杂交形成G-四链体结构，或者信号探针2与剪切出的单链DNA杂交破坏了信号探针2的G-四链体结构；
[0009] （4）显色反应：向步骤（3）制备的G-四链体溶液中加入含10 μL 2μM氯化血红素的HEPES缓冲溶液，室温下反应1小时，形成G-四链体-血红素结构；加入15 μL 3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺-过氧化氢溶液，在G-四链体-血红素的催化作用下，3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺被氧化，溶液颜色由无色变成蓝色，反应4分钟后，用200 μL 2 M的硫酸终止反应，溶液变为黄色，采用紫外光谱测量吸光度值；
[0010] （5）DNA逻辑门的构建：取对应的双链DNA模版，以Hg2+和Ag+为输入，通过T-Hg2+-T或者C-Ag+-C作用形成3′端完全匹配的双链DNA，核酸外切酶III剪切双链DNA形成的单链DNA与信号探针1杂交形成G-四链体结构，进而与氯化血红素结合后形成G-四链体-血红素结构，催化3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺显色，构建了OR、AND、INHIBIT和XOR逻辑门；取对应的双链DNA模版，以Hg2+和Ag+为输入，通过T-Hg2+-T或者C-Ag+-C作用形成完全匹配的双链DNA，核酸外切酶III剪切双链DNA形成的单链DNA，与信号探针2中的序列S优先杂交，破坏了信号探针2的G-四链体结构，使其不能与氯化血红素结合，无法催化3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺的显色反应，溶液为无色，构建了NOR逻辑门。
[0011] 作为优选，上述步骤中，步骤（1）和（3）中，所述的缓冲溶液1为浓度20 mM、pH 7.4、且含50 mM NaAc和10 mM Mg(Ac)2的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液。
[0012] 作为优选，步骤（2）中，所述的缓冲溶液2为25 mM、pH 8.0、含20 mM KCl、200 mM NaCl和1% DMSO的HEPES-NH4OH缓冲溶液。
[0013] 作为优选，步骤（4）中，所述的HEPES缓冲溶液为浓度25 mM、pH 7.4、含20 mM KCl，200 mM NaCl，0.025% (w/v) Triton X-100和1% (v/v) DMSO的缓冲溶液。
[0014] 作为优选，步骤（4）中，所述的15 μL 3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺-过氧化氢溶液为7.5 μL 3 mg/mL 3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺和7.5 μL 1 M过氧化氢。
[0015] 作为优选，步骤（1）和（2）中，所述的DNA的最终浓度均为0.5 μM。
[0016] 作为优选，步骤（3）中，所述的Hg2+和Ag+溶液的浓度均为5 μM。
[0017] 本发明的技术效果是：本发明结合金属离子Hg2+或者Ag+通过T-Hg2+-T或者C-Ag+-C作用将含有T-T或者C-C错配碱基的双链DNA形成完全匹配的双链DNA、核酸外切酶III可以剪切3′端完全匹配的双链DNA、以及G-四链体-血红素对3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺的催2+ +
化显色特性，以Hg 和Ag 为输入信号，通过DNA信号探针进行逻辑操作，构建了多种DNA比色逻辑门，本发明构建的逻辑门对金属离子Hg2+和Ag+具有良好的选择性。
附图说明
[0018] 图1是基于Hg2+引发Exo III活性的（A）YES和（B）NOT逻辑门原理图。
[0019] 图2是（A）以Hg2+和Ag+为输入的OR逻辑门原理图，（B）OR逻辑门四种输入状态的紫外光谱，（C）OR逻辑门的柱状图，（D）OR逻辑门的真值表和照片。
[0020] 图3是（A）以Hg2+和Ag+为输入的AND逻辑门原理图，（B）AND逻辑门四种输入状态的紫外光谱，（C）AND逻辑门的柱状图，（D）AND逻辑门的真值表和照片。
[0021] 图4是（A）以Hg2+和Ag+为输入的INHIBIT逻辑门原理图，（B）INHIBIT逻辑门四种输入状态的紫外光谱，（C）INHIBIT逻辑门的柱状图，（D）INHIBIT逻辑门真值表和照片。
[0022] 图5是（A）以Hg2+和Ag+为输入的XOR逻辑门原理图，（B）INHIBIT逻辑门四种输入状态的紫外光谱，（C）XOR逻辑门的柱状图，（D）XOR逻辑门的真值表和照片。
[0023] 图6是（A）以Hg2+和Ag+为输入的NOR逻辑门原理图，（B）NOR逻辑门四种输入状态的紫外光谱，（C）NOR逻辑门的柱状图，（D）NOR逻辑门的真值表和照片。
具体实施方式
[0024] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，本发明并不限于此；
[0025] 实施例1
[0026] OR逻辑门的构建
[0027] DNA逻辑门构建的基本原理如图1所示。将20 μL DNA 1和2杂交溶液与20 μL DNA 3和4杂交溶液混合，配制一式4份溶液。向以上溶液中加入20 μL水为（0,0）状态，加入10 μL Ag（+ 5 μM）为（0,1）状态，加入10 μL Hg2+（5 μM）为（1,0）状态，同时加入10 μL Hg2+（5 μM）和
10 μL Ag+（5 μM）为（1,1）状态。向每个样品中加入10 μL Exo Ш，在37 °C孵育30分钟。然后，向每个样品中加入20 μL信号探针1形成G-四链体，再加入含10 μL 2μM氯化血红素的HEPES缓冲溶液，室温下反应1 h，形成G-四链体-血红素复合物。最后，向每个样品中加入15 μL TMB-H2O2溶液，G-四链体-血红素催化TMB显色，反应4分钟后加入200 μL 2 M的硫酸终止催化反应。采用紫外-可见光谱对构建的逻辑门进行表征，结果如图2所示。只有（0, 0）状态的吸光度低于0.04，因此输出值为0，溶液为无色；（0,1），（1,0）和(1,1) 状态的吸光度都大于0.04，因此输出值均为1，且溶液均呈黄色。结果表明，按照本发明方法成功构建了OR逻辑门。
[0028] 实施例2
[0029] AND逻辑门的构建
[0030] 将20 μL DNA 5和6杂交，配制一式4份溶液。向以上溶液中加入20 μL水为（0,0）状+ 2+态；加入10 μL Ag（5 μM）为（0,1）状态，加入10 μL Hg（5 μM）为（1,0）状态，同时加入10 μL Hg2+（5 μM）和10 μL Ag+（5 μM）为（1,1）状态。向每个样品中加入10 μL Exo Ш，在37 °C孵育30分钟。然后，向每个样品中加入20 μL信号探针1形成G-四链体，再加入含10 μL 2μM氯化血红素的HEPES缓冲溶液，室温下反应1 h，形成G-四链体-血红素复合物。最后，向每个样品中加入15 μL TMB-H2O2溶液，G-四链体-血红素催化TMB显色，反应4分钟后加入200 μL
2 M的硫酸终止催化反应。采用采用紫外-可见光谱对构建的逻辑门进行表征，结果如图3所示。（0,0），（0,1）和（1,0）状态的吸光度低于0.04，因此输出值均为0，溶液均为无色；只有（1,1）状态的紫外吸收的吸光度大于0.04，因此输出值为1，且溶液为黄色。结果表明，按照本发明方法成功构建了AND逻辑门。
[0031] 实施例3
[0032] INHIBIT逻辑门的构建
[0033] 将20 μL DNA 1和2杂交溶液与20 μL DNA 7和8杂交溶液混合，配制一式4份溶液。向以上溶液中加入20 μL水为（0,0）状态，加入10 μL Ag+（5 μM）为（0,1）状态，加入10 μL Hg2（+ 5 μM）为（1,0）状态，同时加入10 μL Hg2+（5 μM）和10 μL Ag+（5 μM）为（1,1）状态。向每个样品中加入10 μL Exo Ш，在37 °C孵育30分钟。然后，向每个样品中加入20 μL信号探针
1形成G-四链体，再加入含10 μL 2μM氯化血红素的HEPES缓冲溶液，室温下反应1 h，形成G-四链体-血红素复合物。最后，向每个样品中加入15 μL TMB-H2O2溶液，G-四链体-血红素催化TMB显色，反应4分钟后加入200 μL 2 M的硫酸终止催化反应。采用紫外-可见光谱对构建的逻辑门进行表征，结果如图4所示。（0,0），（0,1）和（1,1）状态的吸光度均低于0.04，因此输出值均为0，溶液均为无色；只有（1,0）状态的吸光度大于0.04，因此输出值为1，溶液为黄色。结果表明，按照本发明方法成功构建了INHIBIT逻辑门。
[0034] 实施例4
[0035] XOR逻辑门的构建
[0036] 将20 μL DNA 9和10杂交溶液与20 μL DNA 11和12杂交溶液混合，配制一式4份溶液。向以上溶液中加入20 μL水为（0,0）状态，加入10 μL Ag+（5 μM）为（0,1）状态，加入10 μL Hg2+（5 μM）为（1,0）状态，同时加入10 μL Hg2+（5 μM）和10 μL Ag+（5 μM）为（1,1）状态。向每个样品中加入10 μL Exo Ш，在37 °C孵育30分钟。然后，向每个样品中加入20 μL信号探针1形成G-四链体，再加入含10 μL 2μM氯化血红素的HEPES缓冲溶液，室温下反应1 h，形成G-四链体-血红素复合物。最后，向每个样品中加入15 μL TMB-H2O2溶液，G-四链体-血红素催化TMB显色，反应4分钟后加入200 μL 2 M的硫酸终止催化反应。采用紫外-可见光谱对构建的逻辑门进行表征，结果如图5所示。（0,0）和（1,1）状态的吸光度均低于0.04，因此输出值均为0，溶液均为无色，（0,1）和（1,0）状态的吸光度均大于0.04，因此输出值为1，溶液均为黄色。结果表明，按照本发明方法成功构建了XOR逻辑门。
[0037] 实施例5
[0038] NOR逻辑门的构建
[0039] 将20 μL DNA 1和2杂交溶液与20 μL DNA 3和4杂交溶液混合，配制一式4份溶液。向以上溶液中加入20 μL水为（0,0）状态，加入10 μL Ag+（5 μM）为（0,1）状态，加入10 μL Hg2（+ 5 μM）为（1,0）状态，同时加入10 μL Hg2+（5 μM）和10 μL Ag+（5 μM）为（1,1）状态。向每个样品中加入10 μL Exo Ш，在37 °C孵育30分钟，Exo Ш剪切双链DNA为DNA碎片以及一条完整的单链DNA。然后，向每个样品中加入20 μL信号探针2，Exo Ш剪切双链DNA出来的一条完整的单链DNA与信号探针2中的序列S优先杂交，破坏了信号探针2的G-四链体结构，使其不能与氯化血红素结合。向每个样品中加入15 μL TMB-H2O2溶液，反应4分钟后加入200 μL
2 M的硫酸终止催化反应。采用紫外-可见光谱对构建的逻辑门进行表征，结果如图6所示。
（0,1）（1,0）和（1,1）状态的吸光度均低于0.04，因此输出值均为0，溶液均为无色；只有（0,
0）状态的吸光度大于0.04，因此输出值为1，溶液为黄色。结果表明，按照本发明方法成功构建了NOR逻辑门。
