气相色谱-质谱法测定水生动物中19种氯代酚及其钠盐的方法

摘要

本发明公开了用气相色谱?质谱联用仪测定水生动物肌肉中19种氯代酚及其钠盐的方法，该方法选用硫酸溶液将样品消解，氯代酚游离，再通过二氯甲烷提取，稀NaOH溶液直一步提纯为钠盐，磷酸解钠，二氯甲烷?正己烷溶液再提纯，浓缩衍生后，用EI离子源轰击的气相色谱?质谱联用仪在相同条件下测定标准工作液系列和样品检测液，以样品检测液被测物与标准工作液被测物的保留时间和目标物的特征离子丰度相同或相近进行定性，用标准曲线内标法进行定量；该方法测定品检测液被测物准确性和精密度好，19种氯酚检出限在0.2 μg/kg~1.0 μg/kg之间，加标回收率符合污染物分析要求，在70%以上。

权利要求

1.气相色谱-质谱法测定水生动物中19种氯代酚及其钠盐的方法，其特征在于步骤如下：

(1)待测水生动物样品切碎后均质，称取5.00g置于样品管中，加入浓度为150ng/mL的氘代2，4，6-三溴苯酚100μL，再加入质量百分浓度50％的硫酸溶液30mL，在40℃恒温水浴摇床中摇荡6～12小时；

(2)水浴后取出样品管，冷却至室温，加入10mL二氯甲烷，摇荡后静置分层，将有机相吸入离心管，离心管中加入质量百分浓度4％NaOH 10mL，摇荡后静置分层，弃去有机相，然后用磷酸溶液调节pH至6.2，再加入体积比1:1的二氯甲烷-正己烷溶液10mL，摇荡后静置分层，弃去水相；

(3)有机相用饱和无水硫酸钠脱水后弃去水相，氮吹仪60℃下，将有机相浓缩至0.38～

0.42mL，加入浓度为500ng/mL的氘代4-氯-3-甲基酚10μL，硅烷化衍生剂40μL，正己烷定容到0.5mL，在40℃下衍生30min，冷却至室温得到样品检测液，所述硅烷化衍生剂由N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷按体积比99:1配制；

(4)用正己烷配制含有2-氯酚5.0ng、3-氯酚5.0ng、4-氯酚5.0ng、2,3-二氯酚5.0ng、2,

4-二氯酚5.0ng、2,5-二氯酚+3,5-二氯酚5.0ng、2,6-二氯酚5.0ng、3,4-二氯酚5.0ng、2,4,

6-三氯酚5.0ng、2,4,5-三氯酚5.0ng、2,3,4-三氯酚5.0ng、2,3,5-三氯酚5.0ng、2,3,6-三氯酚5.0ng、3,4,5-三氯酚5.0ng、2,3,5,6-四氯酚5.0ng、2,3,4,6-四氯酚5.0ng、2,3,4,5-四氯酚5.0ng和五氯酚5.0ng的标准工作液0.5mL，标准工作液内含有氘代4-氯-3-甲基酚

5.00ng，氘代2，4，6-三溴苯酚15.0ng，硅烷化衍生试剂40μL，标准工作液在40℃下衍生

30min，冷却至室温，其中2,5-二氯酚与3,5-二氯酚的质量比1:1；

(5)用气相色谱-质谱联用仪测定样品检测液和标准工作液，测定条件都为EI离子源：

230℃，DB-5MS石英毛细管柱：60m×0.25mm×0.25μm，起始温度80℃，保持1min，传输线温度：250℃，电子能量：70eV，进样口温度：250℃，载气：氦气，纯度≥99.999％，流速1.0mL/min，进样量：2.0μL，溶剂延迟：10.0min，测定方式为离子监测方式，定性监测离子：一氯酚

185、187、200，二氯酚93、219、234，三氯酚253、255、268，四氯酚287、289、304，五氯酚321、

323、325、338，氘代4-氯-3-甲基酚201、203、216，氘代2，4，6-三溴苯酚389、391、406，定量离子：一氯酚185，二氯酚219，三氯酚253，四氯酚289，五氯酚323，氘代4-氯-3-甲基酚201，氘代2，4，6-三溴苯酚389；

(6)以样品检测液被测物与标准工作液被测物的保留时间和目标物的特征离子丰度相同或相近进行定性，被测物色谱峰的保留时间和标准物相比，保留时间变化在±0.08min以内，被测物定性特征离子丰度与标准物相比，在色谱-质谱允许误差内；以氘代4-氯-3-甲基酚为一氯酚和二氯酚的内标物，以氘代2，4，6-三溴苯酚为三氯酚、四氯酚和五氯酚的内标物，以标准工作液中被测物峰面积和内标物质峰面积的比值为纵坐标，标准工作液中被测物浓度为横坐标绘制标准曲线，内标法定量，由仪器工作站自动计算样品检测液被测物的含量。

说明书

气相色谱-质谱法测定水生动物中19种氯代酚及其钠盐的

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及氯酚的测定方法，具体涉及气相色谱-质谱法测定水生动物中19种氯代酚及其钠盐的方法。

背景技术

[0002] 氯酚类化合物(Chlorophenols, CPs)是芳香族化合物中用途广、毒性大、污染较为严重的一类化合物。目前世界上将近有15000种CPs被用作杀虫剂、有机溶剂和药物。氯代苯酚（氯代酚）普遍存在于炼油、炼焦、石化、塑胶、煤气和纸浆等工业废水和生活污水中，CPs是一类化学性质相对稳定的化合物, 能够在环境中相对持久地存在, 并可通过食物链累积， 增加了其污染的危害程度，被水生动物食用累积后常以钠盐形式存在。研究普遍关注的CPs主要包括2, 4-二氯酚(2, 4-dichlorophenol,2, 4-DCP) 、2, 4, 6-三氯酚(2, 4, 6-trichlorophenol, 2,4, 6-TCP)和五氯酚(pentachlorophenol, PCP) , 美国环保局(US EPA)和中国国家环保部都将CPs列入优先管理的毒性污染物。目前测定氯酚的方法有液相色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法和免疫试剂法等。液相色谱法如公开号为CN102768245的发明专利申请；气相色谱法如SC/T 3030-2006《水产品中五氯苯酚及其钠盐残留量的测定 气相色谱法》；气相色谱-质谱法如GB 29708-2013《食品安全国家标准 动物性食品中五氯酚钠残留量的测定 气相色谱-质谱法》。上述各测定法仍是个别氯代酚的测定方法，对同时测定19种氯酚及其钠盐未见报道。

发明内容

[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一种气相色谱-质谱法测定水生动物体中19种氯代酚及其钠盐的方法，该方法测定精密度好，回收率达到污染物分析要求。

[0004] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：气相色谱-质谱法测定水生动物中19种氯代酚及其钠盐的方法，步骤如下：

[0005] （1）待测水生动物样品切碎后均质，称取5.00 g置于样品管中，加入浓度为150 ng/mL的氘代2，4，6-三溴苯酚（2,4,6-TBP-d2）100 μL，再加入质量百分浓度50%的硫酸溶液30 mL，在40℃恒温水浴摇床中摇荡6～12小时；

[0006] （2）水浴后取出样品管，冷却至室温，加入10 mL二氯甲烷，摇荡后静置分层，将有机相吸入离心管，离心管中加入质量百分浓度4 % NaOH10 mL，摇荡后静置分层，弃去有机相，然后用磷酸溶液调节pH至6.2，再加入体积比1：1的二氯甲烷-正己烷溶液10 mL，摇荡后静置分层，弃去水相；

[0007] （3）有机相用饱和无水硫酸钠脱水后弃去水相，氮吹仪60 ℃下，将有机相浓缩至0.38～0.42mL，加入浓度为500 ng/ mL的氘代4-氯-3-甲基酚（PCMC-d2）10 μL，硅烷化衍生剂40 μL ，正己烷定容到0.5 mL，在40℃下衍生30 min，冷却至室温得到样品检测液，所述硅烷化衍生剂由N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)与三甲基氯硅烷(TMCS)按体积比99：1配制；

[0008] （4）用正己烷配制含有2-氯酚（2-MCP）、3-氯酚（3-MCP）、4-氯酚（4-MCP）、2,3-二氯酚（2,3-DCP）、2,4-二氯酚（2,4-DCP）、质量比1:1的2,5-二氯酚（2,5-DCP）+3,5-二氯酚（3,5-DCP）、2,6-二氯酚（2,6-DCP）、3,4-二氯酚（3,5-DCP）、2,4,6-三氯酚（2,4,6-TCP）、2,4,5-三氯酚（2,4,5-TCP）、2,3,4-三氯酚（2,3,4-TCP）、2,3,5-三氯酚（2,3,5-TCP）、2,3,6-三氯酚（2,3,6-TCP）、3,4,5-三氯酚（3,4,5-TCP）、2,3,5,6-四氯酚（2,3,5,6-TeCP）、2,3,4,6-四氯酚（2,3,4,6-TeCP）、2,3,4,5-四氯酚（2,3,4,5-TeCP）和五氯酚（PCP）的标准工作液
0.5mL，标准工作液内含有氘代4-氯-3-甲基酚5.00ng，氘代2，4，6-三溴苯酚15.0ng，硅烷化衍生试剂40 μL，标准工作液内各氯代酚的含量都为1.0 ng或3.0 ng或5.0 ng或10.0 ng或
15.0 ng或35 ng，标准工作液在40℃下衍生30 min，冷却至室温；

[0009] （5）用气相色谱-质谱联用仪测定样品检测液和标准工作液，测定条件都为EI离子源：230℃，DB-5MS石英毛细管柱：60m×0.25mm×0.25μm，起始温度80℃，保持1min，传输线温度：250 ℃，电子能量：70eV，进样口温度：250 ℃，载气：氦气，纯度≥99.999 %，流速1.0 mL/min，进样量：2.0 μL，溶剂延迟：10.0 min，测定方式为离子（SIM）监测方式，定性监测离子：一氯酚185、187、200，二氯酚93、219、234，三氯酚253、255、268，四氯酚287、289、304，五氯酚321、323、325、338，氘代4-氯-3-甲基酚201、203、216，氘代2，4，6-三溴苯酚389、391、406，定量离子：一氯酚185，二氯酚219，三氯酚253，四氯酚289，五氯酚323，氘代4-氯-3-甲基酚201，氘代2，4，6-三溴苯酚389；确定了测定氯代酚的监测离子，使仪器测定时目标物灵敏度高而杂峰干扰降为最低；

[0010] （6）以样品检测液被测物与标准工作液被测物的保留时间和目标物的特征离子丰度进行定性，被测物色谱峰的保留时间和标准物相比，保留时间变化在±0.08min以内，被测物定性特征离子的相对丰度与标准物相比，在色谱-质谱允许误差内；以氘代4-氯-3-甲基酚为一氯酚和二氯酚的内标物，以氘代2，4，6-三溴苯酚为三氯酚、四氯酚和五氯酚的内标物，以标准工作液中被测物峰面积和内标物质峰面积的比值为纵坐标，标准工作液中被测物浓度为横坐标绘制标准曲线，内标法定量，由仪器工作站自动计算样品检测液被测物的含量。

[0011] 与现有技术相比，本发明的优点在于：用气相色谱-质谱联用仪测定水生动物肌肉中19种氯代酚及其钠盐的方法，该方法选用硫酸溶液将样品消解，氯代酚游离，再通过二氯甲烷提取，稀NaOH溶液直一步提纯为钠盐，磷酸解钠，二氯甲烷-正己烷溶液再提纯，浓缩衍生后，用EI离子源轰击的气相色谱-质谱联用仪在相同条件下测定标准工作液系列和样品检测液，以样品检测液被测物与标准工作液被测物的保留时间和目标物的特征离子丰度相同或相近进行定性，用标准曲线内标法进行定量；该方法测定品检测液被测物准确性和精密度好，19种氯酚检出限在0.2 μg/kg~1.0 μg/kg之间，加标回收率符合污染物分析要求，在70%以上。

附图说明

[0012] 图1为实施例1氯代酚标准工作液的总离子流色谱图。

具体实施方式

[0013] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

[0014] 实施例1

[0015] 用正己烷配制含有2-MCP、3-MCP、4-MCP、2,3-DCP、2,4-DCP、质量比1:1的2,5-DCP+3,5-DCP、2,6-DCP、3,5-DCP、、2,4,6-TCP、2,4,5-TCP、2,3,4-TCP、2,3,5-TCP、2,3,6-TCP、3,
4,5-TCP、2,3,5,6-TeCP、2,3,4,6-TeCP、2,3,4,5-TeCP和PCP的标准工作液0.5mL，标准工作液内加有氘代4-氯-3-甲基酚5.0ng，氘代2，4，6-三溴苯酚15.0ng，硅烷化衍生试剂（BSTFA：
TMCS体积比99：1配制，以下同）40 μL，标准工作液内各氯代酚的含量都为5.0ng（其中2,5-DCP+3,5-DCP也为5.0ng），标准工作液在40℃下衍生30 min，冷却至室温；用气相色谱-质谱联用仪测定标准工作液，测定条件为EI离子源：230℃，DB-5MS石英毛细管柱：60m×0.25mm×0.25μm，起始温度80℃，保持1min，传输线温度：250 ℃，电子能量：70eV，进样口温度：250 ℃，载气：氦气，纯度≥99.999 %，流速1.0 mL/min，进样量：2.0 μL，溶剂延迟：10.0 min，测定方式为SIM监测方式，定性监测离子：一氯酚185、187、200，二氯酚93、219、234，三氯酚
253、255、268，四氯酚287、289、304，五氯酚321、323、325、338，氘代4-氯-3-甲基酚201、203、
216，氘代2，4，6-三溴苯酚389、391、406，定量离子：一氯酚185，二氯酚219，三氯酚253，四氯酚289，五氯酚323，氘代4-氯-3-甲基酚201，氘代2，4，6-三溴苯酚389，得到如图1所示的总离子流色谱图，其中各序号色谱峰的保留时间和所代表的氯代酚如下：1、 10.96min 2-CP；
2、 11.15min 3-CP；3、 11.47min 4-CP；4.、 13.07min PCMC-d2；5、 13.63min 2,5-DCP+3,
5-DCP ；6、13.78min 2,6-DCP；7、 14.03min 2,4-DCP；8、14.60min2,3-DCP；9、14.77min 3,
4-DCP；10、16.85min 2,4,6-TCP；11、17.24min 2,3,5-TCP；12、17.41 min 2,4,5-TCP；13、
17.74min 2,3,6-TCP；14、18.41min 3,4,5-TCP；15、18.95min 2,3,4-TCP；16、21.72min 2,
3,5,6-TeCP；17、22.02min 2,3,4,6-TeCP；18、22.60min 2,3,4,5-TeCP；19、23.90min 2,4,
6-TBP-d2；20、24.98min PCP。各氯代酚的浓度（X）与该化合物峰面积和内标物峰面积之比（Y）均呈良好的线性相关，各氯代酚浓度与峰面积的线性方程及相关系数如表1所示:

[0016] 表1：标准工作液中各氯代酚浓度与峰面积的线性方程及相关系数

[0017]

[0018] 从表1可以看出各氯代酚相关系数均可达到0.999以上。

[0019] 实施例2

[0020] 以取自宁波象山西沪港一网箱养殖大黄鱼为实验样品，实验鱼去皮取肌肉，并切成小块后绞肉机绞碎成鱼糜，称取5.00 g 于样品管中，浓度为150 ng/mL的2,4,6-TBP-d2（内标物1）100 μL，再加入质量百分浓度50%的硫酸溶液30 mL，在40℃恒温水浴摇床中摇荡6～12小时，水浴后取出样品管，冷却至室温，加入10 mL二氯甲烷，摇荡后静置分层，将有机相吸入离心管，离心管中加入质量百分浓度4 % NaOH10 mL，摇荡后静置分层，弃去有机相，然后用磷酸溶液调节pH至6.2，再加入体积比1：1的二氯甲烷-正己烷溶液10 mL，摇荡后静置分层，弃去水相，有机相用饱和无水硫酸钠脱水后弃去水相，氮吹仪60 ℃下，将有机相浓缩至0.38～0.42mL，加入浓度为500 ng/ mL的PCMC-d2（内标物2）10 μL，并向管中加入各个氯代酚浓度均为100 ng/mL(由于2,5-DCP和3,5-DCP二峰完全重合，所以标准溶液中2,5-DCP和3,5-DCP总量为100 ng/mL)的混合标准工作液100 μL，制成各种氯代酚浓度均为2.00 μg /kg的测试样品，加入硅烷化衍生剂40 μL ，正己烷定容到0.5 mL，在40℃下衍生30 min，冷却至室温得到加标样品检测液。同时称取5.00 g大黄鱼鱼糜于另一样品管中，操作方法同上，但不加混合标准工作液，得到样品检测液。用实施例1相同条件下气相色谱-质谱联用仪测定加标样品检测液和样品检测液，以样品检测液被测物与实施例1标准工作液被测物的保留时间和目标物的特征离子丰度相同或相近进行定性；以氘代4-氯-3-甲基酚为一氯酚和二氯酚的内标物，以氘代2，4，6-三溴苯酚为三氯酚、四氯酚和五氯酚的内标物，以标准工作液中被测物峰面积和内标物质峰面积的比值为纵坐标，标准工作液中被测物浓度为横坐标绘制标准曲线，内标法定量，由仪器工作站自动计算样品检测液被测物的含量；加标样品检测液测定结果依次为1、10.98min 2-MCP 1.62 μg/kg；2、11.18min 3-MCP 1.72 μg/kg；3、11.50min 4-CP 4-MCP 1.60 μg /kg；4、13.69min 2,5-DCP+3,5-DCP 1.58 μg/kg；
5、13.85min 2,6-DCP 1.65 μg/kg；6、14.05min 2,4-DCP 1.78 μg/kg；7、14.61min 2,3-DCP 1.77 μg/kg；8、14.79min 3,4-DCP 1.80 μg/kg；9、16.81min 2,4,6-DCP1.78μg/kg；
10、17.24min 2,3,5-TCP 1.77μg/kg；11、17.42min 2,4,5-TCP 1.80μg/kg；12、17.75min 
2,3,6-TCP1.88μg/kg；13、18.41min 3,4,5-TCP 1.82μg/kg；14、18.94min 2,3,4-TCP 1.83μg/kg；15、21.71min 2,3,5,6-TeCP 1.97μg/kg；16、22.0min 2,3,4,6-TeCP 3.20μg/kg；
17、22.59min 2,3,4,5-TeCP 2.03μg/kg；18、24.97min PCP 1.93μg/kg。样品检测液测定结果22.0min 2,3,4,6-TeCP 1.28μg/kg，说明大黄鱼中含有2,3,4,6-TeCP或其纳盐。

[0021] 实施例3

[0022] 与实施例2的样品检测液和检测方法相同，只是大黄鱼用宁海长街一滩涂养殖缢蛏替代为实验样品，缢蛏去壳后取软体部，切碎并用绞肉机绞成糜状，样品未检测到氯代苯酚。

[0023] 实施例4

[0024] 与实施例2的样品检测液和检测方法相同，只是大黄鱼用余姚临山海域捕获物的鲈鱼替代为实验样品，样品检测结果：1、10.97min 2-MCP 1.13 μg/kg；2、13.65min 2,5-DCP+3,5-DCP 0.65 μg/kg；3、14.02min 2,4-DCP 0.37 μg/kg；4、16.86min 2,4,6-DCP 0.78μg/kg；5、18.95min 2,3,4-TCP 0.36μg/kg；6、22.03min 2,3,4,6-TeCP 3.79μg/kg；7、
24.99min PCP1.19μg/kg；其它氯代酚未检出。

[0025] 用上述实施例的方法，只要沉积物和土壤中存在上述实施例1中19种氯代酚，含量在0.2 μg/kg~1.0 μg/kg以上，都可以检测出。