抗TUBA抗体在白塞病诊断中的应用

摘要

本发明涉及使用蛋白TUBA作为抗原，检测白塞病患者外周血中针对Tubulin的抗体，从而实现对白塞病患者的诊断。具体为以常规方法表达TUBA蛋白，建立检测抗TUBA抗体的定性或定量方法及配套试剂盒。

权利要求

1.TUBA抗原在制备诊断血管炎性疾病的临床诊断试剂或检测物中的应用，所述TUBA的序列如SEQ ID NO.1所示；所述血管炎性疾病选自白塞病。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：以常规方法制备TUBA抗原，建立检测抗TUBA抗体的定量方法及配套试剂盒；所述定量方法为：

1)包板：以pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释TUBA，浓度10μg/ml，包被96孔板，100μl/孔，4℃包板过夜；

2)洗板：含0.05％Tween20的PBS，即PBS-T，洗板4次，每次5分钟；

3)封闭：加入3％BSA-PBS，300μl/孔，37℃封闭3.5小时；

4)洗板：以0.05％PBS-T洗板4次，每次5分钟；

5)一抗孵育：加入病人及健康对照血清，100μl/孔，血清以含1％BSA的PBS-T1∶400稀释，37℃孵育1小时；

6)洗板：PBS-T洗板6次，每次5分钟；

7)二抗孵育：加入以含1％BSA的PBS-T1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG，37℃孵育30分钟，洗板4次；

8)显色：加入OPD显色液，100μl/孔，避光反应10分钟；

9)终止：以2mol/L硫酸终止反应，450nm读取OD值；

10)对照及结果计算：所有样品均做复孔，每板均设阳性对照、阴性对照：分别以健康人抗TUBA抗体均值+2标准偏差AU值定为阳性阈值，AU值＝[OD肽-OD非特异背景]待测血清/[OD肽-OD非特异背景]标准血清×100，标准血清为阳性标准血清。

3.一种诊断血管炎性疾病的血液诊断试剂，其特征在于：包括TUBA蛋白、HRP-IgG抗体，以及血液诊断试剂中的常规试剂，所述TUBA的序列如SEQ ID NO.1所示；所述血管炎性疾病选自白塞病；所述血液诊断试剂中的常规试剂包括碳酸盐缓冲液、PBST洗液、封闭液、显色液和终止液。

说明书

抗TUBA抗体在白塞病诊断中的应用

1.技术领域

[0001] 本发明涉及使用蛋白TUBA作为抗原，检测白塞病患者外周血中针对Tubulin的抗体，从而实现对白塞病患者的诊断。2.背景技术

[0002] 白塞病(Behcet's disease，BD)是一种全身性、慢性、血管炎性疾病。临床上以口腔溃疡、生殖器溃疡、眼炎及皮肤损害为突出表现。该病常累及神经系统、消化道、肺、肾以及附睾等器官。BD一旦有脏器受累，常反复发作，并可引起失明，白塞脑病，消化道穿孔等严重并发症，甚至引起患者死亡。由于目前血清中尚无理想的特异性的诊断抗体，致使早期不典型白塞病的诊断及早期治疗成为风湿科学界的难题。基于现状，迫切要求找到白塞病的早期特异的生物标记物。3.发明内容

[0003] 针对上述问题，本研究通过Orbitrap质谱分析技术从BD、RA、SSc患者及正常对照者血清中的免疫复合物中共发现300多种蛋白质，去除免疫球蛋白、角蛋白及高丰度蛋白，在BD循环免疫复合物中发现TUBA是BD特异性的自身抗原之一。

[0004] 本发明的目的之一是提供能够有效检测BD的特异性抗原——TUBA。

[0005] 本发明的另一目的是提供了检测针对TUBA的抗体用于检测BD的方法。

[0006] 本发明所用术语“TUBA”的氨基酸序列为

[0007] ·1 mrecisihvgqagvqignacwelyclehgiqpdgqmpsdktigggddsfntffsetgagk[0008] ·61 hvpravfvdleptvidevrtgtyrqlfhpeqlitgkedaannyarghytigkeiidlvld[0009] ·121 rirkladqctglqgflvfhsfgggtgsgftsllmerlsvdygkksklefsiypapqvsta[0010] ·181 vvepynsiltthttlehsdcafmvdneaiydicrmldierptytnlnrlisqivssita[0011] ·241 slrfdgalnvdltefqtnlvpyprihfplatyapvisaekayheqltvaeitnacfepan[0012] ·301 qmvkcdprhgkymaccllyrgdvvpkdvnaaiatiktkrtiqfvdwcptgfkvginyqpp[0013] ·361 tvvpggdlakvqravcmlsnttavaeawarldhkfdlmyakrafvhwyvgegmeegefse[0014] ·421 aredmaalekdyeevgadsadgedegeey(SEQ ID NO.1)

[0015] 或被上述序列所包涵的任何氨基酸序列片段。

[0016] 我们在对BD自身抗原的研究中发现了TUBA是BD的特异性自身抗原。进一步研究发现，多数BD患者体内存在高滴度的针对该序列的自身抗体，命名为抗TUBA抗体，该抗体可通过一些较为简便的免疫学检测方法(如：间接酶联免疫吸附法)检测出来，并且对BD的诊断具有很好的敏感性和特异性。

[0017] 本发明目是提供有效检测BD特异性自身抗体的检测方法，并应用于BD的诊断。基于以上研究，本发明人将重组人TUBA做为抗原，用ELISA的方法检测BD、RA、SLE、SSc、RAU、大动脉炎、ANCA相关血管炎患者以及健康对照血清中的抗TUBA抗体，从而达到通过血清学的方法诊断BD的目的，为BD临床诊断提供客观的实验室依据。

[0018] 本发明的重组蛋白及其类似物可通过酶联免疫吸附法对BD患者进行检测，其检测方法为本领域技术人员所熟知的。同时，检测的TUBA抗体类型可为IgG型、IgA型、IgM型或其它类型的免疫球蛋白。

[0019] 本发明所述的重组人TUBA蛋白可以用本领域人员所熟知的原核蛋白表达或真核蛋白表达方法得到，或者采用商业化的方法合成纯化获得。4.附图说明

[0020] 图1 TUBA SDS-PAGE电泳结果图。M：蛋白Marker：Lane1∶100mM咪唑洗脱结果；Lane2，3∶100mM咪唑结果；Lane4∶60mM咪唑洗脱结果，可见58kD处有明显的蛋白条带。

[0021] 图2抗TUBA抗体在疾病组和健康对照组中的水平，其中系统性红斑狼疮(SLE)，系统性硬化症(SSc)、类风湿关节炎(RA)，复发性口腔溃疡(RAU)，大动脉炎(TA)，白塞病(BD)、健康对照(HC)、AASV(抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关性系统血管炎)。

[0022] 图3抗TUBA抗体水平与白塞病患者临床表现和疾病活动指标的关系。抗TUBA抗体水平与白塞病患者的红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、伯明翰血管炎活动评分(BVAS)呈显著正相关。

具体实施方式

[0023] 为了更清楚地理解本发明，现参照下例实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明的具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照试剂盒及仪器制造商所建议的条件。

[0024] 实施例1：抗TUBA抗体的检测及其对白塞病的诊断以及白塞病疾病特点的相关性研究

[0025] 一、病例及对照样本入选标准

[0026] BD患者及其他风湿性疾病患者均为2009年1月至2012年12月在北京大学人民医院风湿免疫科住院的病人，入选患者均符合各自疾病的国际诊断或分类标准。其中BD患者44例，包括男性28例，女性16例，平均年龄40.49±15.2岁，平均病程11.47±12.27年；其中，合并口腔溃疡患者41例，外阴溃疡28例，肠道受累2例，合并眼炎14例，静脉血栓1例，结节红斑10例，关节炎11例。其他风湿性疾病患者220例，男性46，女性154例，平均年龄45±18.7岁，其中包括系统性红斑狼疮(SLE)51例，系统性硬化症(SSc)患者51例、类风湿关节炎(RA)患者40例，复发性口腔溃疡(RAU)32例，大动脉炎(TA)患者13例，ANCA相关血管炎25例，健康对照59例。健康对照均来自我院健康查体者。各组血清均来源于临床检验的剩余标本。BD患者的临床资料采集如下：

[0027] 1)临床资料：包括性别、年龄、病程、是否存在口腔溃疡、外阴溃疡、结节红斑、眼部受累、深静脉血栓形成等。

[0028] 2)实验室指标：

[0029] ①血沉(ESR)：魏式法检测，正常值≤20mm/h；

[0030] ②C反应蛋白(CRP)：免疫比浊法检测，＞10mg/L认为异常；

[0031] ③IgM类风湿因子(RF)：免疫比浊法检测，＞20IU/mL认为异常；

[0032] ④抗核抗体：间接免疫荧光法(德国欧蒙)半定量检测，滴度＞1∶40判定为阳性；

[0033] ⑤免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)采用美国贝克曼公司蛋白分析仪测定。

[0034] 3)采用伯明翰血管炎活动评分(BVAS)对白塞病的活动性进行评价，如表1所示。

[0035] 表1 伯明翰系统性血管炎活动性评分(BVAS)

[0036]

[0037] 说明：以上为新近四周内，由血管炎所致的新近表现或加重。

[0038] 各项评分总分最高63分，大于15分表示病情活动。

[0039] 二、实验方案

[0040] TUBA原核表达SDS-PAGE电泳结果：

[0041] 对TUBA(SEQ ID NO.1)原核表达纯化，表达蛋白SDS-PAGE胶体电泳结果如图1所示。(相关技术参见：《分子克隆实验指南(第三版)》(下册，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔 著，黄培堂等译)第15章，1217页至1265页)

[0042] ELISA方法检测BD血清中抗TUBA抗体的水平

[0043] 1)包板：以含碳酸盐缓冲液(PH 9.6)稀释TUBA，浓度10μg/ml，包被96孔板，100μl/孔，4℃包板过夜；

[0044] 2)洗板：含0.05％Tween 20的PBS(PBS-T)洗板4次，每次5分钟；

[0045] 3)封闭：加入3％BSA-PBS，300μl/孔，37℃封闭3.5小时；

[0046] 4)洗板：以0.05％PBS-T洗板4次，每次5分钟；

[0047] 5)一抗孵育：加入病人及健康对照血清，100μl/孔，血清以含1％BSA的PBS-T 1∶400稀释，37℃孵育1小时；

[0048] 6)洗板：PBS-T洗板6次，每次5分钟；

[0049] 7)二抗孵育：加入以含1％BSA的PBS-T 1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(中杉金桥公司)，37℃孵育30分钟，洗板4次；

[0050] 8)显色：加入OPD显色液，100μl/孔，避光反应10分钟；

[0051] 9)终止：以2mol/L硫酸终止反应，450nm读取OD值；

[0052] 10)对照及结果计算：所有样品均做复孔，每板均设阳性对照、阴性对照；分别以健康人抗TUBA抗体均值+2标准偏差AU值定为阳性阈值。

[0053] AU值＝[OD肽-OD非特异背景]待测血清/[OD肽-OD非特异背景]标准血清×100，标准血清为阳性标准血清。

[0054] 三、实验数据分析：

[0055] 采用SPSS 13.0统计软件，组间率的比较采用χ2检验，正态分布的剂量资料以均数±标准偏差表示，组间比较采用t检验。两变量之间相关性分析采用Spearman相关性分析。p＜0.05表示差异具有统计学意义。

[0056] 四、实验结果：

[0057] 抗TUBA抗体水平在BD及其他结缔组织病的水平比较：

[0058] 应用ELISA方法检测TUBA抗体在BD、RA、SLE、SSc、RAU、大动脉炎、ANCA相关血管炎患者以及健康对照的水平(AU值表示)，独立样本的t检验结果提示BD患者抗TUBA抗体水平明显高于健康对照组(72.80±37.5vs35.13±17.67，t＝6.114，p＜0.001)。SLE、SSc患者抗TUBA抗体水平明显亦高于健康对照组(50.54±29.7vs35.13±17.67，t＝3.095，p＝0.003)；(73.68±40.95vs 35.13±17.67，t＝6395，p＜0001)。RA、RAU、大动脉炎、ANCA相关血管炎患者血清抗TUBA抗体与健康对照未得出统计学差异。如图2所示。

[0059] 抗TUBA抗体水平在BD及其他结缔组织病阳性率比较：

[0060] 以健康人抗TUBA抗体均值≠2标准偏差AU值定为阳性阈值(AU：70.67)，由此算出BD患者Tubulin-α-1抗体的阳性率为56.8％，在SLE为27.5％、SSc为27.5％、RA为7.5％、RAU为3.11％、大动脉炎为23.1％、AASV为4.0％、健康对照组为3.39％。抗TUBA抗体对于诊断BD的敏感性为56.8％，特异性为82.7％(如表2所示)。

[0061] 表2. 抗TUBA抗体在不同疾病中的阳性率

[0062]

[0063] 抗TUBA抗体水平在BD临床表现及疾病活动指标相关性分析；

[0064] 抗TUBA抗体阳性患者发生深静脉血栓以及皮肤结节红斑的阳性率明显高于抗TUBA抗体阴性组，二者之间有显着性差异(p＜0.05)如图3所示。相关性分析提示，抗TUBA抗体水平与ESR、CRP、BVAS里正相关。如表3所示。可以看出抗TUBA抗体阳性患者发生深静脉血栓以及皮肤结节红斑的阳性率明显高于抗TUBA抗体阴性组。

[0065] 表3 抗TUBA阳性及阴性组BD患者系统受累比较

[0066]

[0067]

[0068] 综上所述，通过检测BD与HC和其他一系列相关疾病对照血清中的抗TUBA抗体水平，可以发现，抗TUBA抗体水平在BD患者中明显高于其他各对照组，根据健康对照中抗TUBA抗体水平确定阳性阈值后，可以发现抗TUBA抗体对于诊断BD的敏感性为56.8％，特异性为82.7％，可以提高临床对BD诊断的效率，是一种较好的BD体外诊断生物标记物。同时，在BD中抗TUBA抗体水平与BD患者的疾病活动程度(BVAS)和炎症程度(ESR和CRP)都呈显著正相关，提示抗TUBA抗体水平越高，BD患者病情越重，另一方面，BD患者中抗TUBA抗体水平也显著高于其他各对照组，这两方面说明，抗TUBA抗体与BD具有很好的相关性。而在其他对照组中，抗TUBA抗体阳性率很低，同时也未能发现与病情存在显著相关性，更突出了抗TUBA抗体用于特异性诊断BD的重要性和价值。