分析测定伊贝母中贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷含量的方法

摘要

本发明涉及一种分析测定伊贝母中贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷的方法。该方法采用高效液相色谱-质谱联用技术对贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷三种主要活性成分进行定量测定，经方法学考察试验，确认此方法简便快捷、结果准确、重现性好，是伊贝母中化学成分含量测定的有效手段。

权利要求

1.一种分析测定伊贝母中贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷含量的方法，其特征在于利用高效液相色谱-质谱条件，具体操作按下列步骤进行：a、高效液相色谱条件：色谱柱：赛默飞世尔Hypersil GOLD,C18 100×2.1mm,1.9μm；流动相为A-0.1%甲酸水溶液和B- 甲醇，按时间0min，2.0min，4.5min,4.6min,7.0min,分别按照80%,45%,45%,80%,80%的A-0.1%甲酸水溶液和20%,55%,55%,20%,20%的B-甲醇溶液的体积百分比进行梯度洗脱，流速为 0.2mL/min，柱温为室温，进样量为2μL；

b、质谱条件：离子源电压为 +3000伏特；离子源温度为 300℃；鞘气为30arb；辅助气为

10arb；离子传输毛细管温度为300℃；电喷雾离子源；贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷的选择检测离子分别为m/z 432.233，m/z 430.219和m/z 592.308；

c、对照品溶液的制备：

精密称取贝母素甲0.890mg，贝母素乙 0.918mg，西贝母碱苷1.165mg，分别用甲醇溶解定容至1mL，作为对照品溶液储备液；

d、样品溶液的制备：

温度60℃干燥2小时的伊贝母粉末0.1g，加氨水50μL，再加体积比8:2 的氯仿-甲醇溶液5.0mL，混匀，超声处理25min，称重，放置过夜，称重，加体积比8:2 的氯仿-甲醇溶液补足重量，滤过，弃去滤液，精密吸取续滤液1.0mL，氮气吹干，残渣用甲醇1mL超声2min溶解，过

0.2μm微孔滤膜，得到样品待测液；

e、标准曲线的绘制：

精密移取贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷对照品溶液储备液，并用流动相水∶甲醇=

80:20分别稀释104,2×104,105,2×105,106,2×106,107,2×107倍，得到混标溶液，按色谱条件进行高效液相色谱-质谱分析；以浓度对峰面积进行回归分析，得各组分标准曲线，计算回归方程；

f、含量测定：

精密吸取样品待测液，按色谱条件进行高效液相色谱-质谱分析，并将峰面积代入标准曲线，分别计算贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷的含量。

说明书

分析测定伊贝母中贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷含量的

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种利用高效液相色谱-质谱联用分析测定伊贝母中贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷的方法。

背景技术

[0002] 伊贝母为百合科植物新疆贝母(Fritilaria walujewii Regel.)或伊犁贝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk.)的干燥鳞茎，主要分布在新疆地区，具有清热润肺、化痰止咳、散结之功效，化学及现代药理研究表明，伊贝母的药效成分主要为生物碱，其中西贝母碱苷、贝母素甲、贝母素乙为主要活性生物碱，对止咳化痰具有重要的药理作用。

[0003] 中药活性成分的检测已成为中药质量评价、活性成分开发、开展田间栽培管理的重要前提。长期以来，科技工作者一直致力于研究探索贝母中活性成分检测的新方法，创建伊贝母中贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷的高效、灵敏、快捷的含量测定方法，是化学分析领域的重要研究课题。

[0004] 由于贝母生物碱主要为甾体生物碱，紫外吸收弱，目前有关伊贝母中贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷的含量测定方法主要有毛细管电泳法、薄层色谱扫描法、柱前衍生气相色谱法和液相蒸发光散射器法等。但是，这些方法都存在不少缺点，如毛细管电泳法存在重现性差、线性范围窄和灵敏度较低等缺陷；薄层色谱扫描法测定伊贝母中贝母素甲的含量，操作繁琐，外界因素对测定结果影响较大，特别是显色时间方面难把握，重现性不好；柱前衍生气相色谱法对贝母素甲、贝母素乙进行定量，存在前处理步骤多，排除干扰困难等不足之处；液相蒸发光散射检测器法的灵敏度偏低，导致有效成分含量低的样品无法检测。

[0005] 综上所述，如何建立一种准确性好、灵敏度高、方便快捷的伊贝母中贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷的含量测定方法，从根本上实现伊贝母的药材质量控制和新药研发，是本领域技术人员急需解决的技术难题。

发明内容

[0006] 本发明的目的是涉及一种分析测定伊贝母中贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷的方法。该方法采用高效液相色谱-质谱联用技术对贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷三种主要活性成分进行定量测定，经方法学考察试验，确认此方法简便快捷、结果准确、重现性好，是伊贝母中化学成分含量测定的有效手段。

[0007] 本发明所述的一种分析测定伊贝母中贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷含量的方法，利用高效液相色谱-质谱条件，具体操作按下列步骤进行：

[0008] a、高效液相色谱条件：色谱柱：赛默飞世尔Hypersil GOLD,C18 100×2.1mm,1.9μm；流动相体积百分比为A-0.1％甲酸水溶液，B-甲醇，按时间0min，2.0min，4.5min,4.6min,7.0min,分别用浓度为80％,45％,45％,80％,80％的0.1％甲酸水溶液和浓度为20％,
55％,55％,20％,20％的甲醇溶液进行梯度洗脱，流速为0.2mL/min，柱温为室温，进样量为
2μL；

[0009] b、质谱条件：离子源电压为+3000伏特；离子源温度为300℃；鞘气为30arb；辅助气为10arb；离子传输毛细管温度为300℃；电喷雾离子源，贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷的选择检测离子分别为m/z 432.233，m/z 430.219和m/z 592.308；

[0010] c、对照品溶液的制备：

[0011] 精密称取贝母素甲0.890mg，贝母素乙0.918mg，西贝母碱苷1.165mg，分别用甲醇溶解定容至1mL，作为对照品溶液储备液；

[0012] d、样品溶液的制备：

[0013] 温度60℃干燥2小时的伊贝母粉末0.1g，加氨水50μL，再加体积比8:2的氯仿-甲醇溶液5.0mL，混匀，超声处理25min，称重，放置过夜，称重，加体积比8:2的氯仿-甲醇溶液补足重量，滤过，弃去滤液，精密吸取续滤液1.0mL，氮气吹干，残渣用甲醇1mL超声2min溶解，过0.2μm微孔滤膜，得到样品待测液；

[0014] e、标准曲线的绘制：

[0015] 精密移取贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷对照品溶液储备液，并用流动相水∶甲醇＝80:20分别稀释104,2×104,105,2×105,106,2×106,107,2×107倍，得到混标溶液，按色谱条件进行高效液相色谱-质谱分析；以浓度对峰面积进行回归分析，得各组分标准曲线，计算回归方程；

[0016] f、含量测定：

[0017] 精密吸取样品待测液，按色谱条件进行高效液相色谱-质谱分析，并将峰面积带入标准曲线，分别计算贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷的含量。

[0018] 本发明所述分析测定伊贝母中贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷的方法，该方法利用高效液相色谱-质谱联用，具体操作按下列步骤进行：

[0019] 仪器条件：

[0020] 高效液相色谱条件：

[0021] 色谱柱：赛默飞世尔Hypersil GOLD,C18 100×2.1mm,1.9μm，流动相：A-0.1％甲酸水溶液，B-甲醇；洗脱程序表1：

[0022] 表1

[0023]

[0024] 流速：0.2mL/min，柱温：室温，进样量：2μL；

[0025] 质谱条件：离子源电压：+3000v，离子源温度：300℃，鞘气：30arb，辅助气：10arb，离子传输毛细管温度：300℃，离子源类型：电喷雾离子源；

[0026] 表2

[0027]

[0028] 对照品溶液的制备：

[0029] 精密称取贝母素甲0.89mg，贝母素乙0.918mg，西贝母碱苷1.165mg，分别用甲醇溶解定容至1mL，作为对照品溶液储备液；

[0030] 样品溶液的制备：

[0031] 温度60℃干燥2小时的伊贝母粉末0.1g，加氨水50μL，体积比8:2的氯仿-甲醇溶液5.0mL，混匀，超声处理25min，称重，放置过夜，称重，体积比8:2的氯仿-甲醇溶液补足重量，滤过，弃去滤液，精密吸取续滤液1.0mL，氮气吹干，残渣用甲醇1mL超声2min溶解，过0.2μm微孔滤膜，得到样品待测液；

[0032] 标准曲线的绘制：

[0033] 精密移取贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷对照品溶液储备液，并用流动相水：甲醇＝80:20分别稀释104,2×104,105,2×105,106,2×106,107,2×107倍，得到混标溶液；按色谱条件进行高效液相色谱-质谱分析；以浓度对峰面积进行回归分析，得各组分标准曲线，计算回归方程；

[0034] 精密度试验：同一样品连续进样6针，测得峰面积RSD 1.21％-2.24％，相对保留时间RSD 0.14％-0.23％；

[0035] 重复性试验：

[0036] 取伊贝母药材粉末约0.1g，共6份，精密称定，按温度60℃干燥2小时的伊贝母粉末0.1g，加氨水50μL，体积比8:2的氯仿-甲醇溶液5.0mL，混匀，超声处理25min，称重，放置过夜，称重，体积比8:2的氯仿-甲醇溶液补足重量，滤过，弃去滤液，精密吸取续滤液1.0mL，氮气吹干，残渣用甲醇1mL超声2min溶解，过0.2μm微孔滤膜，得到样品待测液；然后将得到的样品待测液提取并分析，结果表3：

[0037] 表3

[0038]

[0039] 稳定性试验：

[0040] 取上述“重复性试验”中1-6任意一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8h进样，测定其中贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷的含量，并计算RSD值分别为0.9％，0.8％，0.4％；

[0041] 加样回收率：

[0042] 取已知含量的伊贝母药材粉末约0.1g，共6份，精密称定，等量分别精密加入贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷对照样品，按温度60℃干燥2小时的伊贝母粉末0.1g，加氨水50μL，体积比8:2的氯仿-甲醇溶液5.0mL，混匀，超声处理25min，称重，放置过夜，称重，体积比8:2的氯仿-甲醇溶液补足重量，滤过，弃去滤液，精密吸取续滤液1.0mL，氮气吹干，残渣用甲醇1mL超声2min溶解，过0.2μm微孔滤膜，得到样品待测液，提取并分析，得贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷的平均回收率分别为96.9％，99.2％，99.4％，RSD分别为1.5％，
2.14％，1.13％；

[0043] 样品含量测定：

[0044] 精密吸取样品待测液，按色谱条件进行高效液相色谱-质谱分析，并将峰面积带入标准曲线，分别计算贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷的含量。附图说明：

[0045] 图1为本发明实施例中样品的色谱图，其中峰1为伊贝母有效成分贝母素乙，峰2为伊贝母有效成分贝母素甲，峰3为伊贝母有效成分西贝母碱苷。

具体实施方式

[0046] 实施例

[0047] 对未知三年龄伊贝母中贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷的含量分析：

[0048] 供试样品于2014年4月采自新疆维吾尔自治区伊犁哈萨克自治州巩留县莫合乡农技站伊贝母种植示范基地，样品采回后按本发明提供的测定方法进行贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷的含量测定：

[0049] 仪器与试剂：

[0050] 高效液相色谱仪(型号：安捷伦1290)；质谱仪(型号：赛默飞世尔TSQ QUANTUM ULTRA)；超声波清洗器(型号：HU20500B)；氮吹仪(型号：Inc N-EVAPTM111)；万分之一电子天平(型号：梅特勒AM100)；

[0051] 甲酸、甲醇、氨水、氯仿均为色谱纯试剂、贝母素甲对照品(中国食品药品检定研究院)、贝母素乙对照品(中国食品药品检定研究院)、西贝母碱苷对照品(中国食品药品检定研究院)；

[0052] 仪器条件：

[0053] 高效液相色谱仪条件：

[0054] 色谱柱：赛默飞世尔Hypersil GOLD,C18 100×2.1mm,1.9μm；流动相：A-0.1％甲酸水溶液，B-甲醇；梯度洗脱：

[0055]

[0056] 流速：0.2mL/min；柱温：室温；进样量：2μL；

[0057] 质谱仪条件：

[0058] 离子源电压：+3000v；离子源温度：300℃；鞘气：30arb；辅助气：10arb；离子传输毛细管温度：300℃；离子源类型：电喷雾离子源；

[0059]

[0060] 对照品溶液的制备：

[0061] 精密称取贝母素甲0.89mg，贝母素乙0.918mg，西贝母碱苷1.165mg，分别用甲醇溶解定容至1mL，作为对照品溶液储备液；

[0062] 样品溶液的制备：

[0063] 温度60℃干燥2小时的贝母粉末0.1g，加氨水50μL，体积比8:2的氯仿-甲醇溶液5.0mL，混匀，超声处理25min，称重，放置过夜，称重，加体积比8:2的氯仿-甲醇溶液补足重量，滤过，弃去滤液，精密吸取续滤液1.0mL，氮气吹干，残渣用甲醇1mL超声2min溶解，过0.2μm微孔滤膜，制得样品待测液；

[0064] 标准曲线绘制：

[0065] 精密移取贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷对照品溶液储备液，并用流动相水:甲醇＝80:20分别稀释104,2×104,105,2×105,106,2×106,107,2×107倍，得到混标溶液；按色谱条件进行高效液相色谱-质谱分析；以浓度对峰面积进行回归分析，得各组分标准曲线，计算回归方程，贝母素甲：Y＝5468.2+182948X，R2＝0.9993，n＝8；贝母素乙：Y＝15768.2+202911X，R2＝0.9982，n＝8；西贝母碱苷：Y＝92849.6+196200X，R2＝0.9988，n＝8；

[0066] 样品测定：

[0067] 精密吸取样品待测液上液相色谱仪检测，测得贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱苷的峰面积，带入上述标准曲线，计算得出该样品的贝母素甲含量为20.692ug/g，贝母素乙含量为413.455ug/g，西贝母碱苷含量为3.41mg/g。