特异性结合TM4SF5蛋白的新型单克隆抗体及其应用转让专利
申请号 : CN201380052088.5
文献号 : CN104837867B
文献日 : 2018-03-06
发明人 : 金世美 , 金相直 , 闵惠真 , 宋镇明 , 李正源 , 金惠珍 , 安惠美 , 崔仁杓 , 柳知惠
申请人 : 韩国生命工学研究院 , 首尔大学校产学协力团
摘要 :
本发明涉及特异性结合跨膜4L六家族成员5(TM4SF5)蛋白的新型单克隆抗体。更具体地，本发明涉及特异性结合人TM4SF5蛋白的单克隆抗体、编码该单克隆抗体的多核苷酸、包括该核苷酸的表达载体、其中引入该载体的转化体、制备该单克隆抗体的方法、包括该单克隆抗体的组合物、利用该单克隆抗体治疗癌症的方法、抑制癌症肝转移的方法、利用该单克隆抗体诊断癌症的方法和包括该单克隆抗体的癌症诊断试剂盒。
权利要求 :
1.特异性结合人跨膜4L六家族成员5(TM4SF5)蛋白的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括：(a)重链可变区，包括SEQ ID NO：2所示的重链CDR1；SEQ ID NO：3所示的重链CDR2；和SEQ ID NO：4所示的重链CDR3；和轻链可变区，包括SEQ ID NO：6所示的轻链CDR1；SEQ ID NO：7所示的轻链CDR2；和SEQ ID NO：8所示的轻链CDR3；
(b)重链可变区，包括SEQ ID NO：2所示的重链CDR1；SEQ ID NO：3所示的重链CDR2；和SEQ ID NO：12所示的重链CDR3；和轻链可变区，包括SEQ ID NO：14所示的轻链CDR1；SEQ ID NO：15所示的轻链CDR2；和SEQ ID NO：16所示的轻链CDR3；
(c)重链可变区，包括SEQ ID NO：2所示的重链CDR1；SEQ ID NO：3所示的重链CDR2；和SEQ ID NO：20所示的重链CDR3；和轻链可变区，包括SEQ ID NO：14所示的轻链CDR1；SEQ ID NO：15所示的轻链CDR2；和SEQ ID NO：22所示的轻链CDR3；
(d)重链可变区，包括SEQ ID NO：2所示的重链CDR1；SEQ ID NO：3所示的重链CDR2；和SEQ ID NO：26所示的重链CDR3；和轻链可变区，包括SEQ ID NO：14所示的轻链CDR1；SEQ ID NO：15所示的轻链CDR2；和SEQ ID NO：28所示的轻链CDR3；或(e)重链可变区，包括SEQ ID NO：32所示的重链CDR1；SEQ ID NO：33所示的重链CDR2；
和SEQ ID NO：34所示的重链CDR3；和
轻链可变区，包括SEQ ID NO：36所示的轻链CDR1；SEQ ID NO：15所示的轻链CDR2；和SEQ ID NO：37所示的轻链CDR3。
2.权利要求1所述的单克隆抗体，其中
i)(a)的单克隆抗体包括SEQ ID NO：1所示的重链可变区；和SEQ ID NO：5所示的轻链可变区；
ii)(b)的单克隆抗体包括SEQ ID NO：11所示的重链可变区；和SEQ ID NO：13所示的轻链可变区；
iii)(c)的单克隆抗体包括SEQ ID NO：19所示的重链可变区；和SEQ ID NO：21所示的轻链可变区；
iv)(d)的单克隆抗体包括SEQ ID NO：25所示的重链可变区；和SEQ ID NO：27所示的轻链可变区；
v)(e)的单克隆抗体包括SEQ ID NO：31所示的重链可变区；和SEQ ID NO：35所示的轻链可变区。
3.多核苷酸，其编码权利要求1或2所述的单克隆抗体。
4.表达载体，其包括权利要求3所述的多核苷酸。
5.转化体，其包括被引入其中的权利要求4所述的表达载体。
6.组合物，其包括权利要求1或2所述的单克隆抗体。
7.权利要求6所述的组合物，其中所述组合物用于预防或治疗癌症。
8.权利要求6所述的组合物，其中所述组合物用于抑制癌症的肝转移。
9.权利要求6所述的组合物，其中所述组合物用于诊断癌症。
10.权利要求7或权利要求9所述的组合物，其中所述癌症选自食管癌、胃癌、结直肠癌、直肠癌、口腔癌、咽癌、喉癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、骨癌、结缔组织癌、皮肤癌、脑癌、甲状腺癌、白血病、何杰金氏病、软组织肉瘤、淋巴瘤和多发性骨髓瘤血癌。
11.诊断癌症的试剂盒，包括权利要求1或2所述的单克隆抗体。
12.权利要求1或2所述的单克隆抗体用于制备诊断癌症的试剂盒的应用。
13.权利要求1或2所述的单克隆抗体用于制备治疗癌症的药物的应用。
说明书 :
特异性结合TM4SF5蛋白的新型单克隆抗体及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及特异性结合跨膜4L六家族成员5(TM4SF5)蛋白的新型单克隆抗体，和更具体地涉及特异性结合人TM4SF5蛋白的单克隆抗体、编码该单克隆抗体的多核苷酸、包含该多核苷酸的表达载体、其中引入该表达载体的转化体、制备该单克隆抗体的方法、包含该单克隆抗体的组合物、利用该单克隆抗体治疗癌症的方法、利用该单克隆抗体抑制癌症肝转移的方法、利用该单克隆抗体诊断癌症的方法、和包括该单克隆抗体的癌症诊断试剂盒。
背景技术
[0002] 一般地，跨膜4超家族(TM4SF)蛋白是分子量为约25-50kDa、包括四个跨膜结构域、两个胞外环和两个短胞质尾区的一类疏水蛋白质，也被称为四跨膜超家族蛋白(tetraspanin或tetraspan)。TM4SF蛋白与细胞粘附分子如整合蛋白一起在细胞膜上形成复合物，从而建立庞大的四跨膜超家族蛋白富集的微型结构域(TERM)并贡献于不同的生物学功能，如细胞粘附、增殖、和迁移。
[0003] TM4SF5(跨膜4L六家族成员5或四跨膜L6超家族成员5)是四跨膜超家族蛋白的成员，并且具有这样的结构：包括穿过细胞膜的不溶性蛋白质的四个结构域、存在于胞外的两个环、存在于细胞质的一个环和两个尾。TM4SF5是肿瘤相关抗原L6(TM4SF1)的同系物，并且已知TM4SF5的mRNA在胰腺癌、胃癌、结直肠癌、软组织肉瘤等的细胞中被高度过表达。另外，已公开TM4SF5蛋白在COS7细胞中的人工表达可导致肌动蛋白重整和粘着斑翻转(focal adhesion turnover)，因此表明其涉及细胞迁移(Lee SA等，J Clin Invest 2008，118(4)：1354-66)。另外，TM4SF5蛋白与L6——癌症相关基因——具有高的氨基酸序列同源性，因此据说被怀疑是癌症相关基因，并且还已被报道与癌症发展和进程紧密相关。TM4SF5涉及细胞增殖——通过促进G1/S周期进程经过胞内p27Kip1表达和RhoA GTP酶活性(Kim H等，Biochim Biophys Acta 20101803(8)：975-82)，并且在转化生长因子-β1(TGF-β1)和表皮生长因子受体(EGFR)之间的信号传导途径中的相互通信——上皮-间质转化(EMT)涉及的主要因素——已知诱导TM4SF5的表达，从而引起EMT(Kang M等，Biochem J 2012443(3)：
691-700)。
691-700)。
[0004] 如上所述，随着作为新的癌症诊断的特异性蛋白质和抗癌靶的TM4SF5出现，研究已集中于以TM4SF为靶诊断癌症。另外，关于以TM4SF作为靶的癌症治疗，研究已集中于在不同领域抑制TM4SF5的生物学活性。具体地，已对可抑制TM4SF5活性的化合物进行了研究。例如，在查尔酮化合物中，磺胺-或磺酸基-取代的查尔酮衍生物已被报道抑制TM4SF5的生物学活性(韩国专利号10-0934706)。除抑制TM4SF5的生物学活性的化合物外，还已突出了研究特异性结合TM4SF5的单克隆抗体的重要性。具体地，关于临床研究，可用于通过特异性结合TM4SF5，从而抑制TM4SF5的生物学活性来预防和治疗癌症的单克隆抗体的研发需求升高。
[0005] 公开内容
[0006] 技术问题
[0007] 发明人在尝试寻找可特异性结合人TM4SF5蛋白并有效抑制TM4SF5蛋白的生物学活性如癌转移的单克隆抗体时，研发了来自抗体库的特异性结合人TM4SF5的新型单克隆抗体，并确认该抗体可有效抑制TM4SF5的生物学活性，从而完成本发明。
[0008] 技术方案
[0009] 本发明的一个目的是提供特异性结合跨膜4L六家族成员5(TM4SF5)蛋白的单克隆抗体。
[0010] 本发明的另一目的是提供制备该单克隆抗体的方法。
[0011] 本发明的再一目的是提供编码该单克隆抗体的多核苷酸、包含该多核苷酸的表达载体、和包括引入其中的表达载体的转化体。
[0012] 本发明的再一目的是提供包含该单克隆抗体的组合物。
[0013] 本发明的再一目的是提供包含该单克隆抗体的用于诊断癌症的试剂盒。
[0014] 本发明的再一目的是提供利用该单克隆抗体治疗癌症的方法。
[0015] 本发明的再一目的是提供抑制肝癌转移的方法，该方法包括给予该单克隆抗体至疑患肝癌的对象。
[0016] 本发明的再一目的是提供诊断癌症的方法，该方法包括利用该单克隆抗体，通过抗原-抗体反应，检测分离自疑患癌症的对象的生物学样品中的TM4SF5蛋白。
[0017] 有利效果
[0018] 根据本发明的TM4SF5-特异性单克隆抗体呈现对人TM4SF5蛋白的强亲和力，并且通过结合TM4SF5的EC2区域有效抑制TM4SF5的生物学活性如诱导癌转移。因此，本发明的TM4SF5-特异性单克隆抗体可有效用于诊断和治疗TM4SF5介导的疾病如肝癌。
[0019] 附图简述
[0020] 图1A是示例用于制备本发明的抗TM4SF5抗体的融合蛋白构建物——即，抗原蛋白质构建物——的结构的图，其由TM4SF5的跨越EC2(胞外环2)的第113至第157残基的氨基酸区域、His-标签、凝血酶裂解位点(TCS)、免疫球蛋白Fc片段和Myc-标签组成；图1B显示在表达和纯化后通过SDS-PAGE确认的抗原蛋白；和图1C显示示例本发明的抗体筛选方法的流程图。
[0021] 图2显示对从HBX库淘选的96个克隆进行的噬菌体ELISA的结果，其中，在其之间，20个克隆呈现对TM4SF5EC2的阳性反应。
[0022] 图3显示选定克隆的序列分析结果和抗体可变区的人种系免疫球蛋白的使用类型。
[0023] 图4显示对具有相互不同序列的克隆#1、#16、#27、#28、#45、#46、#73、#79、#85、#88和#92进行的ELISA的结果。
[0024] 图5显示本发明的抗TM4SF5抗体的抗原结合亲和力的分析结果。图5A和图5B显示对照细胞系(Cp)的FACS分析结果；和图5C和图5D显示TM4SF5表达细胞系(Tp)的FACS分析结果。另外，图5E显示蛋白质印迹分析结果。
[0025] 图6显示通过亲和层析纯化本发明的五种抗体(#1、#27、#79、#88，和#92)的结果，包括通过层析获得的抗体#79、#88和#92的结果和在定量后通过凝胶电泳确认的五种抗体的结果。
[0026] 图7显示通过FACS分析的本发明的抗TM4SF5抗体(#1、#27和#79)对于对照细胞系(Cp)、TM4SF5过表达细胞系(Tp)、T3、T7和T16的抗原结合亲和力的结果。
[0027] 图8显示利用本发明的抗TM4SF5抗体和一种阴性对照抗体(HAV)的免疫细胞化学分析的图像。图8A显示利用阴性对照抗体(HAV)的免疫细胞化学分析的结果；图8B显示利用抗TM4SF5抗体#1的免疫细胞化学分析的结果；图8C显示利用抗TM4SF5抗体#27的免疫细胞化学分析的结果；图8D显示利用抗TM4SF5抗体#79的免疫细胞化学分析的结果；图8E显示利用抗TM4SF5抗体#88的免疫细胞化学分析的结果；和图8F显示利用抗TM4SF5抗体#92的免疫细胞化学分析的结果，其中Tp、T7和T16表示TM4SF5过表达细胞，和Cp表示对照细胞。
[0028] 图9显示利用市售抗人TM4SF5多克隆抗体(Proteintech group 18239-1-AP)的免疫细胞化学分析的结果。
[0029] 图10A至10C显示利用本发明的抗TM4SF5抗体和抗Flag抗体——对照抗体——在Flag-标记的TM4SF5(Flag-TM4SF5)过表达细胞系中进行的联合免疫细胞化学分析的结果。
[0030] 图11A至11B显示本发明的抗TM4SF5抗体对TM4SF5过表达细胞系(Tp)的侵入的影响。
[0031] 图12显示通过抗TM4SF5抗体#1——本发明的代表性抗TM4SF5抗体——改变Huh7肝癌细胞的迁移的结果。
[0032] 图13A至13B显示确认本发明的抗TM4SF5抗体对细胞迁移的影响的伤口愈合试验结果。
[0033] 图14A至14B显示确认本发明的抗TM4SF5抗体对细胞生长的影响的结果。
[0034] 图15A显示利用#1抗TM4SF5抗体——本发明的代表性抗TM4SF5抗体——染色患有CCl4介导的肝纤维化的动物模型的肝组织的结果，和图15B显示通过FACS确认的、在人Chang肝细胞中表达的TM4SF5蛋白是否被识别的图。
[0035] 最佳实施方式
[0036] 一方面，本发明提供特异性结合跨膜4L六家族成员5(TM4SF5)的单克隆抗体。
[0037] 如本文所用，术语“抗体”指代充当特异性识别抗原的受体的蛋白质分子，包括与特定抗原具有免疫反应性的免疫球蛋白分子、和多克隆抗体、单克隆抗体、全抗体和抗体片段。另外，该术语还包括嵌合抗体、人源化抗体、二价或双特异性分子(例如，双特异性抗体)、双抗体、三抗体和四抗体。全抗体具有两个全长轻链和两个全长重链，并且每个轻链通过二硫键连接至重链。全抗体包括IgA、IgD、IgE、IgM和IgG，并且IgG具有IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型。抗体片段指代具有结合抗原的功能的片段，包括Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv等。Fab具有由轻链、重链可变区、轻链恒定区和第一重链恒定区(CH1结构域)组成的结构，并且其包括一个抗原结合位点。Fab'与Fab的区别在于其具有铰链区，该铰链区包括重链CH1结构域的C端的至少一个半胱氨酸残基。F(ab’)2抗体通过Fab'的铰链区的半胱氨酸残基之间的二硫键形成。Fv(可变片段)指代最小抗体片段，其仅具有重链可变区和轻链可变区。双链Fv(dsFv)具有这样的结构：其中重链可变区通过二硫键连接至轻链可变区，单链Fv(scFv)具有这样的结构：其中重链可变区通过肽连接体共价连接至轻链可变区。这些抗体片段可利用蛋白酶获得(例如，Fab片段可通过用木瓜蛋白酶裂解全抗体而获得，而F(ab’)2片段可通过用胃蛋白酶裂解全抗体而获得)，优选通过基因重组技术。
[0038] 如本文所用，术语“单克隆抗体”指代由基本上相同的抗体克隆获得的、显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力的抗体分子。
[0039] 一般地，免疫球蛋白具有重链和轻链，并且重链和轻链均包括恒定区和可变区(‘区’也被称为‘结构域’)。轻链和重链可变区包括三个互补性决定区(在下文中，“CDR”)和四个框架区(FR)。CDR主要用于结合抗原表位。各链的CDR一般被称为CDR1、CDR2、和CDR3——自N端开始顺序，并且也通过具体CDR所在的链来区分。
[0040] 同时，单克隆抗体，以其在人体的应用为目的，可以是抗原性减少的嵌合或人源化抗体的形式，如上所述。
[0041] 如本文所用，术语“嵌合抗体”指代通过DNA重组技术在小鼠抗体可变区和人抗体恒定区之间获得的重组形式的抗体。嵌合抗体与小鼠抗体相比具有显著提高的免疫应答，因此可被临床使用。
[0042] 如本文所用，术语“人源化抗体”指代以这样的形式制备的抗体：其中小鼠单克隆抗体的CDR序列的部分或全部被嫁接至人抗体。例如，人源化抗体可通过如下获得：首先通过在小鼠单克隆抗体的CDR和人抗体来源的FR之间进行重组制备人源化可变区，然后在所得物和适当人抗体的恒定区之间重组，但不限于此。另外，考虑到仅小鼠源CDR的移植会降低人源化抗体的亲和力，将可影响CDR的三维结构的FR氨基酸残基用小鼠抗体的氨基酸替代，以提高人源化抗体的亲和力，但不限于此。
[0043] 如本文所用，术语“特异性结合跨膜4L六家族成员5(TM4SF5)蛋白的单克隆抗体”指代可结合TM4SF5蛋白并抑制TM4SF5蛋白的生物学活性的抗体，并且在本发明中可与术语“抗TM4SF5抗体”互换使用。特异性结合TM4SF5蛋白的单克隆抗体非限制地包括可结合TM4SF5从而抑制TM4SF5蛋白的生物学活性的任何单克隆抗体。另外，如上所述，单克隆抗体的形式可包括全抗体和抗体片段，并且可以是嵌合或人源化抗体，但不限于此。本发明的单克隆抗体可特异性结合TM4SF5的胞外环2或胞外结构域2(EC2)，并抑制通过TM4SF5进行的信号传导，并随后抑制其生物学活性如EMT诱导，因此可有效用于预防和治疗疾病如TM4SF5介导的癌症。另外，TM4SF5的过表达已被报道是癌症的特异性现象，因此可特异性结合TM4SF5的本发明抗体在诊断癌症时提供高敏感性和特异性，因此可有效用于癌症诊断。
[0044] 在本发明的实施方式中，利用融合蛋白作为抗原蛋白(图1)构建本发明的特异性结合TM4SF5的单克隆抗体，该融合蛋白包括TM4SF5EC2区，即，TM4SF5的跨越第113至第157残基的氨基酸区域。
[0045] 特异性结合TM4SF5蛋白的单克隆抗体可优选地是这样的单克隆抗体：其包括：
[0046] 重链可变区，其包括SEQ ID NO：2所示的重链CDR1、SEQ ID NO：3所示的重链CDR2、和SEQ ID NO：4所示的重链CDR3；和轻链可变区，其包括SEQ ID NO：6所示的轻链CDR1、SEQ ID NO：7所示的轻链CDR2、和SEQ ID NO：8所示的轻链CDR3，并且更优选地，这样的单克隆抗体：包括SEQ ID NO：1所示的重链可变区和SEQ ID NO：5所示的轻链可变区，但不限于此。
[0047] 在本发明的实施方式中，包括SEQ ID NO：1所示的重链可变区；和SEQ ID NO：5所示的轻链可变区的单克隆抗体被命名为单克隆抗体#1。
[0048] 编码单克隆抗体的多核苷酸可包括SEQ ID NO：9所示的编码重链可变区的多核苷酸序列、和SEQ ID NO：10所示的编码轻链可变区的多核苷酸序列，但不限于此。
[0049] 特异性结合TM4SF5蛋白的单克隆抗体可优选是这样的单克隆抗体：其包括：重链可变区，包括SEQ ID NO：2所示的重链CDR1、SEQ ID NO：3所示的重链CDR2、和SEQ ID NO：12所示的重链CDR3；和轻链可变区，包括SEQ ID NO：14所示的轻链CDR1、SEQ ID NO：15所示的轻链CDR2、和SEQ ID NO：16所示的轻链CDR3，和更优选地，这样的单克隆抗体：其包括SEQ ID NO：11所示的重链可变区、和SEQ ID NO：13所示的轻链可变区，但不限于此。
[0050] 在本发明的实施方式中，包括SEQ ID NO：11所示的重链可变区；和SEQ ID NO：13所示的轻链可变区的单克隆抗体被命名为单克隆抗体#27。
[0051] 编码单克隆抗体的多核苷酸可包括SEQ ID NO：17所示的编码重链可变区的多核苷酸序列、和SEQ ID NO：18所示的编码轻链可变区的多核苷酸序列，但不限于此。
[0052] 另外，特异性结合TM4SF5蛋白的单克隆抗体可优选是这样的单克隆抗体：其包括：重链可变区，包括SEQ ID NO：2所示的重链CDR1、SEQ ID NO：3所示的重链CDR2、和SEQ ID NO：20所示的重链CDR3；和轻链可变区，包括SEQ ID NO：14所示的轻链CDR1、SEQ ID NO：15所示的轻链CDR2、和SEQ ID NO：22所示的轻链CDR3，和更优选地，这样的单克隆抗体：其包括SEQ ID NO：19所示的重链可变区、和SEQ ID NO：21所示的轻链可变区，但不限于此。
[0053] 在本发明的实施方式中，包括SEQ ID NO：19所示的重链可变区；和SEQ ID NO：21所示的轻链可变区的单克隆抗体被命名为单克隆抗体#79。
[0054] 编码单克隆抗体的多核苷酸可包括SEQ ID NO：23所示的编码重链可变区的多核苷酸序列、和SEQ ID NO：24所示的编码轻链可变区的多核苷酸序列，但不限于此。
[0055] 另外，特异性结合TM4SF5蛋白的单克隆抗体可优选是这样的单克隆抗体：其包括：重链可变区，包括SEQ ID NO：2所示的重链CDR1；SEQ ID NO：3所示的重链CDR2；和SEQ ID NO：26所示的重链CDR3；和轻链可变区，包括SEQ ID NO：14所示的轻链CDR1；SEQ ID NO：15所示的轻链CDR2；和SEQ ID NO：28所示的轻链CDR3，和更优选地，这样的单克隆抗体：其包括SEQ ID NO：25所示的重链可变区；和SEQ ID NO：27所示的轻链可变区，但不限于此。
[0056] 在本发明的实施方式中，包括SEQ ID NO：25所示的重链可变区；和SEQ ID NO：27所示的轻链可变区的单克隆抗体被命名为单克隆抗体#88。
[0057] 编码单克隆抗体的多核苷酸可包括SEQ ID NO：29所示的编码重链可变区的多核苷酸序列、和SEQ ID NO：30所示的编码轻链可变区的多核苷酸序列，但不限于此。
[0058] 另外，特异性结合TM4SF5蛋白的单克隆抗体可优选是这样的单克隆抗体：其包括：重链可变区，包括SEQ ID NO：32所示的重链CDR1、SEQ ID NO：33所示的重链CDR2、和SEQ ID NO：34所示的重链CDR3；和轻链可变区，包括SEQ ID NO：36所示的轻链CDR1、SEQ ID NO：15所示的轻链CDR2、和SEQ ID NO：37所示的轻链CDR3，和更优选地，这样的单克隆抗体：其包括SEQ ID NO：31所示的重链可变区；和SEQ ID NO：35所示的轻链可变区，但不限于此。
[0059] 在本发明的实施方式中，包括SEQ ID NO：31所示的重链可变区；和SEQ ID NO：35所示的轻链可变区的单克隆抗体被命名为单克隆抗体#92。
[0060] 编码单克隆抗体的多核苷酸可包括SEQ ID NO：38所示的编码重链可变区的多核苷酸序列、和SEQ ID NO：39所示的编码轻链可变区的多核苷酸序列，但不限于此。
[0061] 另外，在本发明的单克隆抗体包括恒定区时，该单克隆抗体可包括IgG-、IgA-、IgD-、IgE-、和IgM-衍生的恒定区、其组合或其杂合体。
[0062] 如本文所用，术语“组合”指代在编码相同来源的单链免疫球蛋白恒定区的多肽和不同来源的单链多肽之间形成连接，以形成二聚体或多聚体。例如，二聚体或多聚体可由选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM恒定区的两个或更多个恒定区形成。
[0063] 如本文所用，术语“杂合体”指代在单链免疫球蛋白重链恒定区中存在编码不同来源的两个或更多个免疫球蛋白重链恒定区的序列。例如，结构域杂合体可由选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的CH1、CH2、CH3和CH4的一至四个结构域组成。
[0064] 同时，也可以是IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4重链恒定区——即，IgG亚型——的组合或杂合体。组合和杂合体同上述。
[0065] 另外，在特异性结合TM4SF5的单克隆抗体包括轻链恒定区时，该轻链恒定区可以具有拉姆达(λ)或卡帕(κ)轻链来源，但不限于此。
[0066] 如本文所用，术语“跨膜4L六家族成员5(TM4SF5)蛋白”指代属于跨膜4超家族(TM4SF)的一类蛋白质，跨膜4超家族是穿过细胞膜四次的膜受体组，介导与细胞发育、激活、生长和迁移的调控相关的信号传导途径。TM4SF5蛋白具有由下列组成的结构：穿过膜的四个跨膜结构域、两个胞外环、一个胞内胞质环、和两个尾区，其中，在两个胞外环中，第二外环(胞外环2；EC2)长于第一外环(胞外环1；EC1)，并且与其他分子的相互作用所涉及的主要氨基酸残基存在于EC2中。TM4SF5蛋白的类型不被具体限制，但优选是人TM4SF5蛋白。另外，TM4SF5蛋白包括野生型和突变型TM4SF5蛋白，但不限于此。天然型TM4SF5蛋白一般指代包括野生型TM4SF5蛋白的氨基酸序列的多肽，野生型TM4SF5蛋白一般指代在天然存在的TM4SF5蛋白中发现的氨基酸序列。TM4SF5蛋白上的信息可从已知的数据库获得，包括国家卫生研究院(National Institutes of Health)的GenBank，并且可以是，例如，GenBank登录号NP_003954(基因ID：9032)，但不限于此。在癌症中，TM4SF5蛋白诱导涉及癌症发生、侵入或转移的上皮-间质转化(EMT)，并且造成细胞的接触抑制丧失，从而导致多层生长(Lee SA等，J Clin Invest 2008，118(4)：1354-66)。另外，TM4SF5蛋白与整合蛋白α5在胞内相互作用，从而激活FAK/c-Src/STAT3的信号传导过程，并且造成血管内皮生长因子(VEGF)——血管生成中的重要因子——表达和分泌，从而导致血管内皮细胞的血管生成(Choi S等，Blood 2009113(8)：1845-55)。因此，任何可抑制TM4SF5的功能的物质可呈现抗癌效果(韩国专利号10-0934706)，因此本发明的特异性结合TM4SF5蛋白的单克隆抗体可有效用于预防和治疗癌症。
[0067] 在本发明的实施方式中，构建了特异性结合TM4SF5的单克隆抗体#1、#27、#79、#88和#92。上述五种不同的单克隆抗体显示具有的结合亲和力远强于市售TM4SF5多克隆抗体(图5和图7至10)。另外，本发明的抗体显示显著减少TM4SF5过表达肝癌细胞系的细胞侵入和细胞迁移，并且抗体#1——本发明的代表性抗体——显示使固有地表达TM4SF5的Huh7细胞的细胞迁移减少约45％(图11至13)。另外，本发明的抗体显示在无血清的情况下使细胞生长减少约30％至约50％(图14)。此外，抗体#27——本发明的代表性抗体——显示有效染色由于诱导性肝纤维化而表达TM4SF5的小鼠肝组织，从而能够有效检测TM4SF5蛋白。另外，在通过用TGF-β处理人Chang肝细胞诱导TM4SF5蛋白表达时，抗体#27显示有效检测TM4SF5蛋白的存在(图15)。
[0068] 另一方面，本发明提供制备上述单克隆抗体的方法。
[0069] 利用常规单克隆抗体生产技术可容易制备本发明的单克隆抗体。例如，制备单克隆抗体的方法可通过利用从免疫化动物获得的B淋巴细胞产生杂交瘤来进行(Koeher和Milstein，1976，Nature，256：495)，或可利用噬菌体展示技术进行，但不限于此。
[0070] 利用噬菌体展示的抗体库是在不制备杂交瘤的情况下在具有直接得自B淋巴细胞的抗体基因的噬菌体表面上表达抗体的方法。与通过B-细胞永生化进行的单克隆抗体生产相关的多种现有困难可通过噬菌体展示方法克服。常规噬菌体展示方法包括：1)将具有随机序列的寡核苷酸插入相应于噬菌体外壳蛋白pIII(或pIV)的N端的区域；2)表达部分天然型外壳蛋白和具有随机序列的寡核苷酸编码的多肽之间的融合蛋白；3)处理可结合具有随机序列的寡核苷酸编码的多肽的受体材料；4)在低pH条件下或利用具有结合竞争力的分子洗脱结合于受体的肽-噬菌体颗粒；5)在宿主细胞中扩增通过淘选洗脱的噬菌体；6)重复上述步骤，获得期望量的噬菌体；和7)从通过淘选选择的噬菌体克隆的DNA序列中确定活性肽的序列。
[0071] 优选地，制备本发明单克隆抗体的方法可通过噬菌体展示方法进行。本领域技术人员可容易参考公知的噬菌体展示技术进行上述步骤中的每一个，该噬菌体展示技术例如公开于Barbas等(METHODS:A Companion to Methods in Enzymology 2:119,1991and J.Virol.2001Jul；75(14):6692-9)和Winter等(Ann.Rev.Immunol.12:433,1994)。用于构建抗体库的噬菌体的实例包括丝状噬菌体，如fd、M13、f1、If1、Ike、Zj/Z、Ff、Xf、Pf1和Pf3，但不限于此。而且，用于在丝状噬菌体表面上表达异种基因的载体的实例包括噬菌体载体，如fUSE5、fAFF1、fd-CAT1或fdtetDOG，或噬菌粒载体，如pHEN1、pComb3、pComb8或pSEX，但不限于此。进一步，用于提供成功再感染重组噬菌体所需的野生型外壳蛋白的辅助噬菌体的实例包括M13K07和VSCM13，但不限于此。
[0072] 编码杂交瘤来源的单克隆抗体或噬菌体展示克隆的多核苷酸可容易利用常规程序来分离和测序，例如，可使用这样的寡核苷酸引物：其被设计以由杂交瘤或噬菌体模板DNA特异性地扩增目标重链和轻链区域。在分离多核苷酸后，可将其插入表达载体，然后将该表达载体转化到适当的宿主细胞中，并可从转化的宿主细胞(即，转化体)获得期望的单克隆抗体。因此，制备人单克隆抗体的方法可包括扩增包含编码人单克隆抗体的多核苷酸的表达载体，但不限于此。
[0073] 另一方面，本发明提供编码单克隆抗体的多核苷酸、包含该多核苷酸的表达载体、和其中引入该表达载体的转化体。
[0074] 单克隆抗体同上述。
[0075] 包含编码根据本发明所述的单克隆抗体的多核苷酸的表达载体可包括——虽然不具体限于此——能够在真核或原核细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体，该真核或原核细胞包括哺乳动物细胞(例如，人-、猴-、兔-、大鼠-、仓鼠-、小鼠细胞等)、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞和细菌细胞(例如，大肠杆菌(E.coli))；和优选地，包含至少一个选择性标记物并且可操作地连接至适当的启动子使得多核苷酸可在给定宿主细胞中表达的载体。例如，载体可包括被引入噬菌体-、质粒-、粘粒-、微型染色体-，病毒-或逆转录病毒载体等的多核苷酸。
[0076] 包含编码该多核苷酸的多核苷酸的表达载体可以是具有单克隆抗体的重链或轻链的表达载体，或包含编码单克隆抗体的重链和轻链的多核苷酸的表达载体。
[0077] 其中引入本发明的表达载体的转化体可包括——虽然不限于此——通过引入表达载体而转化的细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌属(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；真菌细胞，如酵母细胞，包括毕赤酵母(Pichia pastoris)；昆虫细胞，如果蝇(Drosophila)或夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞；动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、SP2/0(小鼠骨髓瘤)、人淋巴母细胞、COS、小鼠骨髓瘤(NSO)、293T、Bowes黑素瘤细胞、HT-1080、幼年仓鼠肾(BHK)细胞、人胚胎肾(HEK)细胞、PERC.6(人视网膜细胞)、及类似物；和植物细胞。
[0078] 如本文所用，术语“引入”指代将包含编码单克隆抗体的多核苷酸的载体递送到宿主细胞中的方法。这种引入可通过本领域已知的不同方法进行，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、微注射、脂质体融合、脂转染和原生质体融合。另外，转染指代利用病毒颗粒通过感染将期望的材料递送到细胞中。另外，载体可通过基因轰击被引入宿主细胞。在本发明中，术语“引入”可与术语“转染”互换使用。
[0079] 另一方面，本发明提供包含单克隆抗体的组合物。组合物可以是药物组合物或诊断组合物的形式。
[0080] 该组合物可以是药物组合物或用于预防或治疗癌症的组合物。
[0081] 本发明的单克隆抗体特异性结合TM4SF5，有效阻断TM4SF5介导的信号，和抑制TM4SF5的生物学活性，从而其可涉及癌症的预防和治疗。TM4SF5和单克隆抗体同上述。
[0082] 如本文所用，术语“癌症”指代任何类型的可表达TM4SF5蛋白的癌症，并且可包括但不限于，例如，食管癌、胃癌、结直肠癌、直肠癌、口腔癌、咽癌、喉癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、骨癌、结缔组织癌、皮肤癌、脑癌、甲状腺癌、白血病、何杰金氏病、软组织肉瘤、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和血癌。
[0083] 如本文所用，术语“预防”可指代可通过给予组合物抑制或延迟癌症进展的所有类型的行为，和术语“治疗”可指代可通过给予组合物恢复或有益地改变癌症症状的所有行为。
[0084] 药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体。
[0085] 如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指代不对有机体造成刺激也不抑制被给予化合物的生物学活性和特性的载体或稀释剂。用于配制本发明组合物的溶液形式的药学上可接受的载体的实例可包括盐水溶液、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水溶液、白蛋白注射溶液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇、及其两种或更多种的混合物，并且必要时，还可包含其他常规添加剂，如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。另外，组合物可进一步包含稀释剂、分散剂、表面活性剂、合和润滑剂，从而将其配制成可注射制剂，如水溶液、悬浮液和乳液、丸剂、胶囊、颗粒剂或片剂。
[0086] 药物组合物可以是各种口服或胃肠外制剂的形式。药物组合物利用常规稀释剂或赋形剂来配制，包括填充剂、膨胀剂、粘合、润湿剂、崩解剂和表面活性剂。口服给予的固体制剂包括片剂、丸剂、粉末、颗粒剂、胶囊等。这些固体制剂通过如下制备：混合至少一种化合物与至少一种赋形剂，例如，淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等。除简单赋形剂外，还可使用润滑剂如硬脂酸镁和滑石。另外，口服给予的液体制剂可包括悬浮液、内用溶液、乳液、糖浆等。除常用的简单稀释剂如水和液体石蜡外，还可包括各种赋形剂，例如，润湿剂、甜味剂、调味剂、防腐剂等。胃肠外给予的制剂包括无菌水溶液、无水溶剂、悬浮剂、乳液、冻干剂、栓剂。丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射酯如油酸乙酯等可用作无水溶剂和悬浮剂。栓剂的基质可包括witepsol、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂精脂、甘油化明胶等。
[0087] 药物组合物可被制备成选自片剂、丸剂、粉末、颗粒剂、胶囊、悬浮液、内用溶液、乳液、糖浆、无菌水溶液、无水溶液、悬浮液、冻干制剂和栓剂的任一种制剂。
[0088] 本发明的组合物可以药学有效量给予。
[0089] 如本文所用，术语“药学有效量”指代在适用于任何医学治疗的合理效益/风险比下足以治疗疾病的量。组合物的有效剂量水平可根据下列确定：对象类型、疾病严重程度、对象性别和年龄、癌症类型、药物活性、药物敏感性、给药持续时间、给药途径、排泄率、治疗长度、与组合物联合使用的药物、以及医学领域的其他公知因素。本发明的组合物可被单独或组合其他治疗剂，与常规治疗剂相继或同时给予。组合物可以单剂型或多剂型给予。基于全部上述因素，给予可呈现最大效果而不导致副作用的最小量的组合物是非常重要的，并且剂量可容易被本领域技术人员确定。
[0090] 另外，组合物可以是抑制肝癌转移的药物组合物。
[0091] 如本文所用，术语“转移”指代癌细胞迁移至身体不同部位以及癌细胞随后定居和增殖。本发明的抗TM4SF5单克隆抗体有效抑制肝癌细胞的迁移，因此包含该单克隆抗体的组合物可用于抑制癌细胞的肝转移。
[0092] 在本发明的实施方式中，本发明的抗TM4SF5抗体#1、#27、#79、#88和#92显示特异性结合TM4SF5(图5、7、8和10)，显著减少TM4SF5-过表达肝癌细胞的透孔和细胞运动(图11至13)，并且减少在无血清情况下肝癌细胞的增殖(图14)，因此确认包含本发明抗体的药物组合物可有效用于预防和治疗癌症。
[0093] 另外，该组合物可以是诊断癌症的组合物。
[0094] 与TM4SF5的表达存在或表达水平相关的疾病或TM4SF5介导的疾病可通过利用包含特异性结合TM4SF5的单克隆抗体的组合物检测TM4SF5来诊断，具体地，TM4SF5可用于癌症诊断是因为其在不同类型的癌症如结直肠癌、肝癌、和胰腺癌中过表达。
[0095] 在本发明的实施方式中，本发明的抗TM4SF5抗体特异性识别TM4SF5，并且其检测能力远高于市售TM4SF5多克隆抗体(图5、7至10)，因此表明本发明的抗体可有效用于诊断包括肝癌的各种癌症。
[0096] 另一方面，本发明提供诊断癌症的试剂盒，包含诊断癌症的单克隆抗体。
[0097] 组合物和癌症同上述。另外，诊断癌症的试剂盒可进一步包括组合物，该组合物包含至少一种适于分析的构成成分、溶液或装置。
[0098] 另一方面，本发明提供利用单克隆抗体治疗癌症的方法。
[0099] 单克隆抗体和癌症同上述。治疗癌症的方法可以是这样的方法：包括给予患有或疑患癌症的对象包含本发明的单克隆抗体和另外药学上可接受的载体的药物组合物。药学上可接受的载体同上述。优选地，治疗癌症的方法可以是这样的方法：包括给予患有癌症的对象包含本发明的单克隆抗体的组合物。对象包括哺乳动物，包括牛、猪、羊、鸡、狗、和人、和鸟，并且非限制地包括通过给予本发明的组合物可治疗其癌症的任何对象。
[0100] 可以单剂型或多剂型给予药学有效量的组合物。具体地，可给予液体、粉末、气溶胶、胶囊、肠溶包衣片剂或胶囊、或栓剂形式的组合物。另外，可腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、口服、局部、鼻内、肺内或直肠内给予组合物，但不限于此。然而，在口服给予组合物时，肽在胃中被消化，因此，口服组合物应被配制使得活性成分被包衣或保护，防止在胃中分解。另外，可通过任何可递送活性成分至靶细胞的系统来给予药物组合物。
[0101] 由于本发明的药物组合物包含本发明的特异性结合TM4SF5的单克隆抗体，包含该单克隆抗体的药物组合物在体内的给予可抑制或阻止癌症发生、增殖或转移，或通过抑制其进程来治疗癌症。
[0102] 另一方面，本发明提供通过将单克隆抗体给予有此需要的对象来抑制癌症肝转移的方法。
[0103] 单克隆抗体、TM4SF5蛋白和给予同上述。
[0104] 另一方面，本发明提供诊断癌症的方法，包括利用该单克隆抗体通过抗原-抗体反应检测从疑患癌症的对象分离的生物学样品中的TM4SF5蛋白。单克隆抗体、癌症、对象和TM4SF5蛋白同上述。
[0105] 在诊断癌症的方法中，可通过如下检测TM4SF5蛋白：使TM4SF5特异性单克隆抗体与从疑患癌症的对象分离的生物学样品反应，和检测抗原-抗体复合物的形成，从而可诊断癌症。
[0106] 由于TM4SF5在各种癌细胞——包括肝癌、结直肠癌或胰腺癌的细胞——中过表达，可通过比较TM4SF5在生物学样品中与对照组如正常细胞或组织中的表达水平来诊断癌症，但不限于此。
[0107] 如本文所用，术语“生物学样品”可包括组织、细胞、全血、血清、血浆、组织解剖样品(例如，脑、皮肤、淋巴结、脊髓等)、细胞培养上清液、破裂的真核细胞、和细菌表达系统，但不限于此。这些生物学样品可与受控或非受控状态的单克隆抗体反应，从而确定TM4SF5蛋白的存在或癌症的存在/不存在。
[0108] 如本文所用，术语“抗原-抗体复合物”指代样品中的TM4SF5蛋白抗原和识别该TM4SF5蛋白抗原的单克隆抗体之间的缀合物。这种抗原-抗体复合物的形成可通过选自下列的任何方法来检测：比色法、电化学方法、荧光法、发光法、颗粒计数法、视觉评估法和闪烁计数法，但不限于此，并且多种方法可被使用和适用。
[0109] 在本发明中，各种标记可用于检测抗原-抗体复合物。标记的具体实例可包括——虽然不限于此——酶、荧光材料、配体、发光材料、微粒和放射性同位素。
[0110] 可用作检测标记的酶的实例包括乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、和β-内酰胺酶。荧光材料的实例包括荧光素、Eu3+、Eu3+螯合物、穴状化合物等。配体的实例包括生物素衍生物等。发光材料的实例包括吖啶酯、异氨基苯二酰肼衍生物等。另外，微粒的实例包括胶体金、有色胶乳等。放射性同位素的实例包括57Co、3H、125I、和125I-Bonton Hunter试剂。
[0111] 优选地，抗原-抗体复合物可通过ELISA方法检测。ELISA方法的实例包括直接ELISA——利用带标记的抗体，其能够识别附着于固体支持物的抗原；间接ELISA——利用带标记的二级抗体，其能够识别抗体复合物中的捕获抗体，该抗体复合物能够识别附着于固体支持物的抗原；直接夹心ELISA——其利用另一带标记抗体，该带标记抗体能够识别附着于固体支持物的抗原-抗体复合物中的抗原；和间接夹心ELISA，其包括使另一抗体与附着于固体支持物的抗原-抗体复合物中的抗原反应，然后利用能够识别该抗体的带标记的二级抗体；等等。
[0112] 单克隆抗体可具有检测标记。当单克隆抗体不具有检测标记时，其可用具有检测标记的另一抗体处理而被捕获和检测。
[0113] 发明实施方式
[0114] 在下文中，将参考实施例对本发明进行更详细描述。然而要理解，这些实施例仅以示例为目的，而非意图限制本发明的范围。
[0115] 实施例1：抗TM4SF5抗体的制备和选择
[0116] 实施例1-1：通过噬菌体展示的淘选
[0117] 构建TM4SF5抗原蛋白，其包括TM4SF5胞外结构域2(TM4SF5EC2)中跨越第113至第157残基的氨基酸区域。将TM4SF5EC2蛋白的C端融合于Myc蛋白和人Fc蛋白，以构建
TM4SF5EC2-hFc-Myc形式的融合蛋白构建物。利用发明人拥有的在哺乳动物细胞中高度表达蛋白质的载体系统(韩国专利号10-110365)，在HEK293E细胞中表达包括TM4SF5EC2结构域AA 113-157的融合蛋白，并纯化。用于本发明的抗原蛋白和抗体的完整筛选方法在中图1示例。通过淘选针对抗原蛋白筛选抗体库的方法如下进行。
TM4SF5EC2-hFc-Myc形式的融合蛋白构建物。利用发明人拥有的在哺乳动物细胞中高度表达蛋白质的载体系统(韩国专利号10-110365)，在HEK293E细胞中表达包括TM4SF5EC2结构域AA 113-157的融合蛋白，并纯化。用于本发明的抗原蛋白和抗体的完整筛选方法在中图1示例。通过淘选针对抗原蛋白筛选抗体库的方法如下进行。
[0118] 将来自小鼠scFv库的细胞接种于100mL 2xYT中至OD 600nm下的吸光度为0.1，并在37℃、250rpm下培养，直到其具有0.5至0.7的OD值。
[0119] 然后，将辅助噬菌体VCSM13(Stratagene)用10倍数量的库中细胞在37℃下重复感染30分钟，并在250rpm下培养30分钟。将感染的细胞在3500rpm下离心10分钟，并在200mL新制的2xYTAK培养基(0.1％氨苄青霉素和0.1％70mg/mL卡那霉素)中在26℃、250rpm下扩增过夜。将所得物在6000rpm下离心20分钟，并在其中溶解噬菌体的上清液中加入4％(w/v)聚乙二醇(PEG)和3％NaCl，在冰上沉淀1小时。将所得物在4℃、8,000rpm下离心1小时，并将噬菌体溶解在1mL磷酸盐缓冲液(PBS)中。所得物在4℃、13,000rpm下离心10分钟，并使用。
[0120] 将TM4SF5EC2-hFc-Myc抗原和hFc片段作为对照组在碳酸钠缓冲液(pH 9.6)中以5μg/mL的浓度稀释，并在4℃下在免疫-96微孔板(Nunc，Denmark)的表面上固定。第二天，将固定的抗原用200μL PBS洗涤两次，并用200μL封闭缓冲液(PBS中4％脱脂乳，MPBS)在室温下封闭2小时。将上述制备的库噬菌体与封闭缓冲液以1：1的比例混合，使其在固定hFc片段的孔中反应30分钟，并移除结合于hFc片段的噬菌体。使经过消减过程的噬菌体在固定TM4SF5EC2-hFc-Myc抗原的孔中反应，将其用200μL PBST(0.05％吐温20)洗涤2分钟5次和用200μL PBS洗涤两次，并去除非特异性结合的噬菌体。将上述结合于抗原的噬菌体用100μL的0.2M甘氨酸-HCl(0.1％BSA，pH 2.5)洗脱10分钟，然后立即用6μL的2M Tris-HCl(pH 8.0)中和。将洗脱的噬菌体转移至5mL ER2738(OD 600nm，0.7)，在37℃下感染30分钟并在
200rpm下培养30分钟。将噬菌体感染的细胞在3,500rpm下离心10分钟，溶解在600μL培养基中，分别以300μL的量等分，并在30℃下在SOB培养基中培养过夜。用2mL的15％甘油回收所得细胞。将回收的细胞再次用噬菌体感染，并如上所述进行淘选。
200rpm下培养30分钟。将噬菌体感染的细胞在3,500rpm下离心10分钟，溶解在600μL培养基中，分别以300μL的量等分，并在30℃下在SOB培养基中培养过夜。用2mL的15％甘油回收所得细胞。将回收的细胞再次用噬菌体感染，并如上所述进行淘选。
[0121] 实施例1-2：噬菌体-ELISA筛选
[0122] 在第二次淘选后，随机选择96个集落，并在深孔板(Bioneer，韩国)上培养过夜，其中每个孔加载200μL的2xYTA培养基。第二天，将10μL培养物液体转移到加有90μL培养基的新的深孔板中，并在37℃、250rpm下培养6小时。在所得物中加入10μL VCSM13辅助噬菌体，在37℃下重复感染30分钟，并在250rpm下培养30分钟。然后，在所得物中加入100μL 2xYTAK培养基(0.1％氨苄青霉素和0.2％卡那霉素)，并在26℃、250rpm下培养过夜。第二天，将所得物在2000rpm下离心10分钟，获得噬菌体。同时，在免疫-96微孔板中，将作为对照组的hFc和TM4SF5-EC2抗原——其以100μL碳酸钠缓冲液中1μg/mL的浓度在板表面上固定过夜——用200μL PBS洗涤两次，并与4％MPBST(0.05％PBST中的脱脂乳)在37℃下反应1小时。将噬菌体与4％MPBST以1：1的比例混合30分钟，并以100μL的量等分至每个封闭孔，并使其反应1小时。为去除非特异性结合的噬菌体，将所得物用200μL PBST洗涤4次，并与在100μL的0.4％MPBST中以1：2000的比例稀释的IgG-抗M13-HRP(Pharmacia)反应1小时。将所得物用
200μL PBST洗涤5次，并添加100μL TMB底物试剂组(BD bioscience，USA)——其中底物A和B以1：1的比例混合，以显色。然后，观察显色程度，并通过添加50μL的2.5M H2SO4终止反应。
通过微板读取器在OD 450nm下测量显色。基于结果，选择96个集落中显示阳性响应的20个集落#1、#6、#13、#14、#16、#26、#27、#28、#45、#46、#51、#53、#55、#58、#68、#73、#79、#85、#88和#92(图2)。
200μL PBST洗涤5次，并添加100μL TMB底物试剂组(BD bioscience，USA)——其中底物A和B以1：1的比例混合，以显色。然后，观察显色程度，并通过添加50μL的2.5M H2SO4终止反应。
通过微板读取器在OD 450nm下测量显色。基于结果，选择96个集落中显示阳性响应的20个集落#1、#6、#13、#14、#16、#26、#27、#28、#45、#46、#51、#53、#55、#58、#68、#73、#79、#85、#88和#92(图2)。
[0123] 实施例1-3：筛选克隆的序列分析
[0124] 在对通过实施例1-2的噬菌体-ELISA筛选选择的20个集落关于其序列和其CDR3区域序列进行分析后，确认集落#1和#6具有相同的序列，确认集落#13、#14、#26、#51、#53、#55、#58、#68，和#73具有相同的序列。基于该分析，分离出11个不同序列(图3)。在具有相同序列的集落中，集落#1和#73被认定为代表性集落，具有相互不同氨基酸序列的其余11个集落进行关于人-His-Fc-Myc结合的scFv的ELISA(图4)，并且集落#16相对于对照组显示阳性响应，因此选择集落#1、#27、#28、#45、#46、#73、#79、#85、#88和#92，排除集落#16。
[0125] 其中，选择的单克隆抗体#1包括SEQ ID NO：1所示的重链可变区的氨基酸序列、和SEQ ID NO：5所示的轻链可变区的氨基酸序列；SEQ ID NO：9所示的编码重链可变区的多核苷酸序列、和SEQ ID NO：10所示的编码轻链可变区的多核苷酸序列。
[0126] 另外，选择的单克隆抗体#27包括SEQ ID NO：11所示的重链可变区的氨基酸序列、和SEQ ID NO：13所示的轻链可变区的氨基酸序列；SEQ ID NO：17所示的编码重链可变区的多核苷酸序列、和SEQ ID NO：18所示的编码轻链可变区的多核苷酸序列。
[0127] 另外，选择的单克隆抗体#79包括SEQ ID NO：19所示的重链可变区的氨基酸序列、和SEQ ID NO：21所示的轻链可变区的氨基酸序列；SEQ ID NO：23所示的编码重链可变区的多核苷酸序列、和SEQ ID NO：24所示的编码轻链可变区的多核苷酸序列。
[0128] 另外，选择的单克隆抗体#88包括SEQ ID NO：25所示的重链可变区氨基酸序列、和SEQ ID NO：27所示的轻链可变区的氨基酸序列；SEQ ID NO：29所示的编码重链可变区的多核苷酸序列、和SEQ ID NO：30所示的编码轻链可变区的多核苷酸序列。
[0129] 最后，选择的单克隆抗体#92包括SEQ ID NO：31所示的重链可变区的氨基酸序列、和SEQ ID NO：35所示的轻链可变区的氨基酸序列；SEQ ID NO：38所示的编码重链可变区的多核苷酸序列、和SEQ ID NO：39所示的编码轻链可变区的多核苷酸序列。
[0130] 实施例1-4：抗TM4SF5抗体对TM4SF5的结合亲和力的确认和选择
[0131] 从细菌获得实施例1-3中制备的处于scFv-噬菌体状态的10种不同抗体，并且将肝癌细胞的裂解物进行蛋白质印迹分析，结果显示在图5C中。结果是共7种抗体#1、#28、#45、#46、#79、#85和#92显示对TM4SF5具有结合亲和力。
[0132] 另外，将这10种不同抗体转化成scFv-Fc形式，并在动物细胞中表达。具体地，收集上清液状态的胞外分泌的抗体，并进行FACS分析，以确认抗体在肝癌细胞系中的结合亲和力。
[0133] FACS分析揭示，单克隆抗体#1、#27、#79、#88和#92对TM4SF5表达细胞系(Tp)具有相对于对照细胞系(Cp)较高的结合亲和力(图5A和5B)。
[0134] 基于FACS分析和蛋白质印迹分析，再次选择单克隆抗体#1、#27、#79、#88和#92。
[0135] 实施例1-5：选择的抗TM4SF5抗体的生产及其纯化
[0136] 将从实施例1-4选择的五种不同的抗体#1、#27、#79、#88，和#92在HEK293E细胞中大规模表达，然后纯化。具体地，用包含编码抗体的多核苷酸的表达载体转染2X10e7的HEK293E细胞(100mm皿，10皿)，更换成无血清培养基，并以3日间隔获取上清液5次。然后，将收集的上清液用蛋白A excellose珠纯化，并且从每种抗体各获得平均2mg(图6)。
[0137] 实施例2：抗TM4SF5抗体的结合亲和力分析
[0138] 关于TM4SF5过表达SNU-449肝癌细胞系(Tp，T3，T7，T16)和对照细胞系(Cp)进行FACS实验。结果是确认本发明的抗体#1、#27和#79区别于对照细胞系结合于TM4SF5过表达细胞系(图7)。
[0139] 另外，免疫细胞化学实验的结果揭示，所有经五种抗体#1、#27、#79、#88和#92处理的组使TM4SF5过表达肝癌细胞染色，更加区别于对照细胞(图8)。具体地，经抗体#92处理的组显示其他四种抗体中的任一种均没有出现的特殊模式，其使核膜染色，因此表明TM4SF5进入核膜的可能性。
[0140] 同时，市售抗TM4SF5兔多克隆抗体(Proteintech group，cat no.18239-1-AP)在本发明抗体的相同实验条件下不能识别TM4SF5，因此确认本发明抗体对TM4SF5的结合亲和力较优(图9)。
[0141] 另外，在Flag-标记的TM4SF5过表达SNU-761肝癌细胞系用本发明的抗TM4SF5抗体和抗Flag抗体共同染色时，其导致共同定位(图10)。
[0142] 上述结果表明，本发明的TM4SF5抗体具有较优的能够结合TM4SF5的活性。此外，在癌细胞诊断中，本发明抗体的强结合亲和力表明其可以高灵敏度和特异性结合。
[0143] 实施例3：抗TM4SF5抗体的靶抑制效果分析
[0144] 由于报道TM4SF5促进肝癌细胞增殖和增加细胞运动(J.Clin.Invest.(2008)118:1354-1366；Carcinogenesis(2009)30:1872-1879；J.Cell.Biochem.(2010)111:59-66)，通过细胞生长实验、透孔试验和伤口愈合试验来分析本发明的抗TM4SF5抗体#1、#27和#79的靶抑制活性。
[0145] (1)透孔(transwell)试验
[0146] 分析了本发明抗体的处理对Tp细胞——TM4SF5过表达肝癌细胞系——中的细胞侵入活性的影响。将TM4SF5过表达肝癌细胞用20μg/mL本发明的抗体预先温育，在透孔中平铺，和诱导细胞移动48小时。然后将迁移的细胞固定，并用水晶紫染色，通过在200×放大倍数下计数获得平均值。结果是，观察到利用本发明的抗TM4SF5抗体的处理抑制了TM4SF5过表达肝癌细胞的侵入。具体地，本发明的抗体#1、#27和#79分别抑制肝癌细胞的侵入83％、56％和49％，(图11A)，而本发明的抗体#88和#92分别抑制浸润73％和46％(图11B)。
[0147] 另外，考察抗体#1——本发明的代表性抗体——对利用Huh7肝癌细胞的细胞迁移的减少的影响。
[0148] 具体地，将1×104个细胞用30μg/mL抗体预先温育，并等分至插入物。将5％FBS加入插入物的下室并温育48小时后，将迁移的细胞固定并染色。计数在200×高倍视野(HPF)视域下观察到的细胞数量，获得平均值，结果显示在图12中。
[0149] 结果是，如图12示例，观察到通过抗体#1——本发明的代表性抗体——的处理，固有地表达TM4SF5蛋白的Huh7细胞的迁移减少约45％。
[0150] (2)伤口愈合试验
[0151] 通过伤口愈合试验来分析抗TM4SF5抗体对肝癌细胞迁移的影响。将T16细胞——TM4SF5过表达肝癌细胞——在96-孔板中以汇合状态平铺，刮去，然后用抗体(20μg/mL)处理。然后，上至48小时测量癌细胞伤口愈合程度。结果是，观察到本发明的抗体#1、#27、#79、#88和#92显示减少伤口愈合的作用(图13A和13B)。
[0152] (3)关于细胞生长的效果实验
[0153] 另外，确认本发明的抗体对细胞生长的影响。在平铺Tp和T16细胞系后，基于比色确定法测量96-孔板上经20μg/mL浓度的抗体分别处理48小时和72小时的TM4SF5过表达肝癌细胞系和细胞生长程度。结果揭示，本发明的抗体在血清存在的情况下不显示对肝癌细胞系细胞生长的区别性抑制。然而，本发明的抗体#1和#79抑制细胞生长约30％至50％(图14A)，并且本发明的抗体#88和#92在血清不存在的情况下抑制细胞生长约50％(图14B)。根据上述结果，确认本发明的抗体具有抑制肝癌细胞生长的活性。
[0154] 上述结果表明，本发明的抗体可特异性结合TM4SF5并有效抑制TM4SF5的生物学活性如EMT，从而有效阻止癌增殖、迁移和转移，因此有效用于预防或治疗癌症。
[0155] 实施例4：利用抗TM4SF5抗体的组织染色
[0156] 将CCl4-处理的小鼠——肝纤维化诱导型动物模型，具有CCl4处理导致的严重肝损伤和纤维化)——用抗体#27(本发明的代表性抗体)染色。
[0157] 具体地，将小鼠组织(具有CCl4处理诱导的肝纤维化的组织)制备成石蜡样品，切片以具有4μm至5μm的厚度，并固定至玻片，用二甲苯脱蜡，并进行乙醇(100％>90％>80％>70％)脱水。然后，将组织浸入1mM柠檬酸盐缓冲溶液(pH 6.0)，煮沸10分钟，并使组织固定至玻片，在室温下冷却，与3％H2O2反应10分钟(甲醇中的过氧化氢酶)。然后，将所得组织用
6％正常马血清封闭30分钟，并与作为初级抗体的3μg/mL浓度(在1％正常马血清中)的抗体#27在4℃下反应过夜。然后，将所得组织用PBS洗涤，与二级抗体以1：100的比例在室温下反应1小时(二级抗体：兔抗人IgF(Fc)，与荧光素结合(pierce#31535，1.5mg/mL)，用PBS洗涤，用DAPI染色，制作标本，以观察结果。
6％正常马血清封闭30分钟，并与作为初级抗体的3μg/mL浓度(在1％正常马血清中)的抗体#27在4℃下反应过夜。然后，将所得组织用PBS洗涤，与二级抗体以1：100的比例在室温下反应1小时(二级抗体：兔抗人IgF(Fc)，与荧光素结合(pierce#31535，1.5mg/mL)，用PBS洗涤，用DAPI染色，制作标本，以观察结果。
[0158] 结果是，确认未经CCl4处理的对照组的小鼠肝不被抗体#27染色，而CCl4处理的小鼠肝(肝损伤被诱导)的纤维化区域被抗体#27染色(图15A)。即，抗体#27显示识别由于肝损伤而表达的TM4SF5。
[0159] 另外，在人Chang肝细胞中通过TGF-β处理来诱导TM4SF5时，通过FACS分析确认抗体#27识别TM4SF5，结果显示在图15B中。
[0160] 结果是，如图15B示例，本发明的抗TM4SF5抗体显示有效识别固有的TM4SF5蛋白。
[0161] 总而言之，上述结果表明本发明的抗TM4SF5抗体，特别是抗体#27，可应用于动物模型组织和免疫组织化学(IHC)。
[0162] 根据上述，本发明所属领域的技术人员能够理解，在不改变本发明的技术思路或必要特征的情况下，本发明可以其他具体形式实施。在这点上，本文公开的示例性实施方式仅以示例为目的，不应被解释为限制本发明的范围。相反，本发明意图不仅包括示例性实施方式，而且涵盖所附权利要求限定的本发明的精神和范围可包括的各种替代方式、改动、等同范围和其他实施方式。