一种利用未成熟果实进行燕子花离体快速繁殖的方法

摘要

本发明公开了一种利用未成熟果实进行燕子花离体快速繁殖的方法，包括如下步骤：(1)在花期，人工辅助授粉提高早期坐果率；(2)选取健康幼嫩的果实，进行预处理后灭菌，获得无菌材料；(3)接种到不定芽诱导培养基上进行不定芽的诱导；(4)分割获得的不定芽，接种到增殖培养基上进行增殖；(5)接种到生根培养基上进行壮苗和生根培养；(6)移栽和驯化。本发明利用未成熟果实进行燕子花离体快速繁殖的方法建立了燕子花的无性系，繁殖效果好。

权利要求

1.一种利用未成熟果实进行燕子花离体快速繁殖的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)在花期，人工辅助授粉提高坐果率；

(2)选取燕子花健康幼嫩的果实，进行预处理后灭菌，获得无菌材料；

(3)接种到不定芽诱导培养基上进行不定芽的诱导；

(4)分割获得的不定芽，接种到增殖培养基上进行增殖；

(5)接种到生根培养基上进行壮苗和生根培养；

(6)移栽和驯化；

其中，步骤(1)和步骤(2)具体包括如下步骤：在花期时进行人工授粉，提高坐果率；在6月初-6月中旬之间采集燕子花健康幼嫩的果实，剥开灭菌或直接灭菌，灭菌方法为：分别放到100ml磨口广口瓶中，用自来水冲洗2h后置于超净工作台上，用75％的乙醇灭菌1min后，迅速用无菌水洗涤，接着用0.1％的HgCl2溶液振荡灭菌8min，再用无菌水振荡洗涤4～5次，即获得无菌材料；

步骤(3)中所述不定芽诱导培养基为MS+0.1mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA或MS+0.1mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA；

步骤(4)中所述增殖培养基为MS+0.1mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA；

步骤(5)中所述生根培养基为1/2MS。

2.根据权利要求1所述的利用未成熟果实进行燕子花离体快速繁殖的方法，其特征在于：步骤(3)具体包括如下步骤：剥开灭菌的果实直接接种到不定芽诱导培养基上，直接灭菌的果实选择以下两种中的一种方式进行接种：I.在无菌工作台内剥掉灭菌后的果实的果壳，将果实内的幼嫩种子一一分开，接种到不定芽诱导培养基上；

II.在无菌工作台内将幼嫩果实直接切成小段，然后接种到不定芽诱导培养基上。

3.根据权利要求1所述的利用未成熟果实进行燕子花离体快速繁殖的方法，其特征在于：步骤(6)具体包括如下步骤：待不定芽在生根培养基上生根后，将培养瓶打开放于室内环境下适应2d，然后取出，洗净培养基，移栽于体积比为1：1：1的泥炭、珍珠岩和松鳞的混合基质中，保湿。

4.根据权利要求1所述的利用未成熟果实进行燕子花离体快速繁殖的方法，其特征在于：培养室的培养条件为温度25℃，光照强度为2000Lux，光照时间为12h。

说明书

一种利用未成熟果实进行燕子花离体快速繁殖的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及组织培养领域，特别是涉及一种利用未成熟果实进行燕子花离体快速繁殖的方法。

背景技术

[0002] 燕子花(Iris laevigata)为鸢尾科鸢尾属多年生宿根花卉，是优良湿地、浅水绿化园林植物；夏季开花，色彩鲜艳，具有较高的观赏价值和推广应用价值。一般采用分株繁殖的方法，但是由于繁殖系数很低，很难满足市场需求。利用组织培养的方法可以利用有限的外植体快速获得大量的繁殖材料，大大提高繁殖系数。目前，关于鸢尾属植物特别是宿根鸢尾类的组培快繁报道较少，仅见于几种常见的鸢尾属材料；外植体的选择有茎尖块、花蕾、花托、花苞、顶芽，但各有缺点，研究发现以这些材料作为外植体时，虽然愈伤很多但是分化芽很少；而自然情况下，结实率非常低(低于10％)，即使成熟，果实内部种子败育现象严重，且存在严重的休眠特性，并不是非常理想的外植体。现有技术还存在如下缺点：1、自然条件下，大部分花不能坐果，结实率较低；2、即使获得种子，种子发育不良，出苗率很低，繁殖系数低；3、种子具有较为严重的休眠特性，出苗参差不齐；4、最常用繁殖方法分株繁殖繁殖系数很低；5、组培难度大，诱导分化难。

发明内容

[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种繁殖效果好、周期短、操作简便的利用未成熟果实进行燕子花离体快速繁殖的方法。

[0004] 一种利用未成熟果实进行燕子花离体快速繁殖的方法，包括如下步骤：

[0005] (1)人工授粉，大大提高坐果率，获得幼嫩果实材料；

[0006] (2)选取燕子花健康幼嫩的果实，进行预处理后灭菌，获得无菌材料；

[0007] (3)接种到不定芽诱导培养基上进行不定芽的诱导；

[0008] (4)分割获得的不定芽，接种到增殖培养基上进行增殖；

[0009] (5)接种到生根培养基上进行壮苗和生根培养；

[0010] (6)移栽和驯化。

[0011] 本发明所述的利用未成熟果实进行燕子花离体快速繁殖的方法，其中，步骤(1)和步骤(2)具体包括如下步骤：

[0012] 在花期时进行人工授粉，提高坐果率，在6月初-6月中旬之间采集燕子花健康幼嫩的果实，剥开灭菌或直接灭菌，灭菌方法为：分别放到100ml磨口广口瓶中，用自来水冲洗2h后置于超净工作台上，用75％的乙醇灭菌1min后，迅速用无菌水洗涤，接着用0.1％的HgCl2溶液振荡灭菌8min，再用无菌水振荡洗涤4～5次，即获得无菌材料。

[0013] 本发明所述的利用未成熟果实进行燕子花离体快速繁殖的方法，其中，步骤(3)具体包括如下步骤：

[0014] 剥开灭菌的果实直接接种到不定芽诱导培养基上，直接灭菌的果实选择以下两种中的一种方式进行接种：

[0015] I.在无菌工作台内剥掉灭菌后的果实的果壳，将果实内的幼嫩种子一一分开，接种到不定芽诱导培养基上；

[0016] II.在无菌工作台内将幼嫩果实直接切成小段，然后接种到不定芽诱导培养基上。

[0017] 本发明所述的利用未成熟果实进行燕子花离体快速繁殖的方法，其中，所述不定芽诱导培养基为MS+0.1mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA或MS+0.1mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA。

[0018] 本发明所述的利用未成熟果实进行燕子花离体快速繁殖的方法，其中，步骤(4)中所述增殖培养基为MS+0.1mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA。

[0019] 本发明所述的利用未成熟果实进行燕子花离体快速繁殖的方法，其中，步骤(5)中所述生根培养基为1/2MS。

[0020] 本发明所述的利用未成熟果实进行燕子花离体快速繁殖的方法，其中，步骤(6)具体包括如下步骤：

[0021] 待不定芽在生根培养基上生根后，将培养瓶打开放于室内环境下适应2d，然后取出，洗净培养基，移栽于体积比为1：1：1的泥炭、珍珠岩和松鳞的混合基质中，保湿。

[0022] 本发明所述的利用未成熟果实进行燕子花离体快速繁殖的方法，其中，培养室的培养条件为温度25℃，光照强度为2000Lux，光照时间为12h。

[0023] 本发明利用未成熟果实进行燕子花离体快速繁殖的方法与现有技术不同之处在于：本发明根据的燕子花坐果结实特性，通过人为辅助授粉大大提高坐果率，同时在大部分果实败育之前(果实在发育过程中又存在较大比较的败育率)，利用未成熟果实进行燕子花离体快速繁殖的方法建立了燕子花的无性系，繁殖效果好，在本发明的不定芽诱导培养基(MS+0.1mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA)中出芽率可达到92％，在本发明的增殖培养基(MS+0.1mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA)中平均增殖系数可达到4.5。本发明的果实灭菌和处理方法和各阶段培养基的选择都是针对于燕子花这个特殊的植物来设置的。

[0024] 本发明利用未成熟果实进行燕子花离体快速繁殖的方法中进行了人工授粉，尽管人工授粉未能显著促进最终结实率，但可以大大提高早期坐果率，此时的果实即可作为繁殖材料，为本发明的材料来源提供了保障。目前，关于鸢尾属植物特别是宿根鸢尾类的组培快繁报道较少，仅见于几种常见的鸢尾属材料，外植体的选择有茎尖块、花蕾、花托、花苞、顶芽，但各有缺点，研究发现以这些材料为外植体时，虽然愈伤很多但是分化芽很少，而成熟的果实败育现象严重，不适合做外植体。且如采用成熟的果实作为外植体，材料来源将会大大减少(未成熟的果实很多，不一定都能后期成为成熟的果实，成熟后数量大大减少)。果实采集时间也非常重要，为6月上旬到中旬，过完采集会导致萌发率大大下降。本发明移栽过程中采用了特殊种类和配比的基质，体积比为1：1：1的泥炭、珍珠岩和松鳞的混合基质，其中添加一定比例的松鳞是针对于燕子花的生物学特性来配制的，既能保证生长所需的条件，又能一定程度上控制其根系生长(避免过长)，适合燕子花的生长。

[0025] 下面结合附图对本发明的利用未成熟果实进行燕子花离体快速繁殖的方法作进一步说明。

附图说明

[0026] 图1为本发明利用未成熟果实进行燕子花离体快速繁殖的方法的过程；

[0027] 图2为三株采用本发明的方法培养出的燕子花无性系植株；

[0028] 图3为多株采用本发明的方法培养出的燕子花无性系植株；

[0029] 图4为本发明中移栽4周后的植株；

[0030] 图5为本发明中移栽3个月后的植株。

具体实施方式

[0031] 一、材料与方法：

[0032] 供试材料：燕子花幼嫩的果实，6月初-6月中旬采集。

[0033] 在花期，采集自身花粉进行人工辅助授粉，尽管人工授粉未能显著促进最终结实率，但可以大大提高早期坐果率，发育到一定程度的果实即可作为繁殖材料，为本发明的材料来源提供了保障。采集时间非常重要，6月中旬之后采集会导致诱导率大大下降。

[0034] 二、试验方法：

[0035] (1)材料灭菌

[0036] 选取燕子花健康幼嫩的果实，分别放到100ml磨口广口瓶中，用自来水冲洗2h后置于超净工作台上，用75％的乙醇灭菌1min后，迅速用无菌水洗涤，接着用0.1％的HgCl2溶液振荡灭菌8min，再用无菌水振荡洗涤4～5次，即获得无菌材料。

[0037] (2)不定芽的诱导

[0038] 果实经过两种处理：1.剥开灭菌；2.直接灭菌

[0039] 剥开灭菌的果实直接接种到培养基上；

[0040] 直接灭菌的幼嫩果实又经过以下处理：①剥掉果壳，将果实内的幼嫩种子一一分开；②将幼嫩果实直接切成小段；然后接种到不定芽诱导培养基上。诱导不定芽的培养基为2、3、8、9、10、11号培养基。

[0041] (3)不定芽的增殖

[0042] 将前面获得的不定芽进行分割，将长势优良的不定芽分别接种到增殖培养基上。不定芽增殖的培养基为2、3、8、15、17、18、19、20、21、22、31、32、57、59、61、63、64、67、68号培养基。

[0043] (4)壮苗和生根、移栽和驯化

[0044] 挑选生长较为健壮的不定芽接种到培养基MS、1/2MS、MS+0.2NAA、1/2MS+0.2NAA上进行壮苗、生根培养。待不定芽生根后，将培养瓶打开放于室内环境下适应2d，然后取出，洗净培养基，移栽于泥炭：珍珠岩：松鳞(1：1：1)的混合介质中，保湿。

[0045] 所用培养基配方见表1，每种培养基均加蔗糖30g/L和琼脂6.5g/L，pH5.8。培养条件为：温度保持25℃左右，光照强度为2000Lux，光照时间为12h。

[0046] 表1培养基配方

[0047]

[0048] 三、结果与分析

[0049] (1)不定芽的诱导

[0050] 将无菌材料①、②及剥开果皮灭菌的种子分别接种到2、3、8、9、10、11六种培养基上进行不定芽的诱导培养，结果见表2。培养24d后，观察到在2、11号培养基上的外植体周围有明显膨大现象，有些外植体周围出现少量愈伤组织；在3、8号培养基中的外植体上诱导形成了不定芽或有萌动现象；在9、10培养基上培养的情况介于两者之间。其中，剥开后灭菌的外植体表皮褐化严重，少数转绿；灭菌后剥开的外植体转绿，部分萌发形成芽或有萌动；连果壳切开接种的外植体同样褐化严重只有少数转率形成愈伤。剥开后灭菌的外植体和连果壳切开接种的外植体也可以采用本发明的方法建立燕子花的无性系，只是效果没有灭菌后剥开的外植体效果好。

[0051] 再继续培养10d后，在2、11号培养基上的外植体分化出了少量的不定芽，而在3和8号培养基上都萌发出了较多且健壮的不定芽，其中在3号培养基上培养的外植体，不定芽的分化有所减少但呈现较好的不定芽；在8号培养基上的外植体还出现不定根的继续分化，并且长势整齐，大小均一不管是对于接下来的增殖培养还是后期的移栽种植都有着积极的作用。在9、10培养基上的外植体虽然诱导形成了一定量的不定芽但不定芽多为丛生状，且不为正常芽不利于后期的栽培工作。结果表明，在0.1mg/L NAA的基础上随着6-BA浓度的升高，出芽率呈上升趋势，当6-BA和KT互作时并未提高出芽率反而对分化芽质量有所影响；在0.1mg/L 2,4-D的基础上随着6-BA浓度的升高，同样地出芽率增加。但在相同浓度的NAA和
2,4-D的作用下，在前者中不定芽的诱导率高，既NAA对不定芽诱导的促进作用大于2,4-D。
由此可见，3、8号培养基较适合不定芽的诱导。

[0052] 表2不同培养基上不定芽的诱导情况

[0053]

[0054] 注：①a-b标不同字母者表示LSD多重比较法检测结果差异显著(P＝0.05,P＝0.01),相同字母则表示差异不显著。

[0055] ②表中数据为培养120天后，每个处理统计3次得出的平均值。

[0056] ③同栏平均值注有相同的小写英文字母，表示差异未达5％显著水平；同栏平均值注有不同的小写英文字母，表示差异达5％显著水平。同栏平均值注有相同的大写英文字母，表示差异未达1％极显著水平；同栏平均值注有不同的大写英文字母，表示差异达1％极显著水平。

[0057] 图1为燕子花的组培过程，其中1为诱导幼嫩子房形成不定芽；2为不定芽初步增殖；3为不定芽继代增殖；4为小的不定芽壮苗；5为继续增殖；6为不定芽生根。

[0058] (2)不定芽的增殖

[0059] 不同基本培养基对不定芽增殖的影响：

[0060] 将无菌材料中诱导萌发出的较均匀的不定芽分别接种到2、8、9、59、61、63、64、67、68号培养基上诱导分化增殖，其中每个基本培养基上有三组不同激素配比的处理。培养24d后，观察并记录增殖状况，再继续培养一个月，所记录的数据基本稳定。由表3可知，在相同激素配方的情况下基本培养基为MS时不定芽的增殖率最大，平均增殖数也高，且长势好；在
1/2MS和B5、Miller的基本培养基中增殖率和平均增殖数都较接近，但1/2MS的基本培养基中长势较好；而在B5和Miller的基本培养基中不定芽的增殖率较低，平均增殖芽数也不高，并且长势一般。由方差分析结果也表明了B5和Miller的效果与MS相差甚大，因此，以MS作为基本培养基不定芽的增殖效果最好。

[0061] 表3不同基本培养基对不定芽增殖的影响

[0062]

[0063] 注：①a-b标不同字母者表示LSD多重比较法检测结果差异显著(P＝0.05,P＝0.01),相同字母则表示差异不显著。

[0064] ②表中数据为培养120天后，每个处理统计3次得出的平均值。

[0065] ③同栏平均值注有相同的小写英文字母，表示差异未达5％显著水平；同栏平均值注有不同的小写英文字母，表示差异达5％显著水平。同栏平均值注有相同的大写英文字母，表示差异未达1％极显著水平；同栏平均值注有不同的大写英文字母，表示差异达1％极显著水平。

[0066] 不同激素配比对不定芽增殖的影响：

[0067] 将形成的均匀健壮的不定芽，继代接种到含不同激素配比的3、8、9、10、11、15、17、18、19、20、21、22、31、32号培养基中诱导增殖。每隔一周观察一次，36d后，分化芽数基本稳定。从表4中可以看出，燕子花幼嫩果实诱导出的不定芽增殖培养对NAA的敏感性大于2，4-D；随着NAA浓度升高增殖率下降，而且高浓度的NAA有助于根的生成，如在20、21、22号培养基中不定芽的增殖率普遍较低，在20号培养基中还有根的生成说明在高浓度的NAA和低浓度的6-BA作用时不利于不定芽的增殖却促进了根的生长；在0.1mg/LNAA的条件下，6-BA的作用大于TDZ，即6-BA更能促进不定芽的分化增殖，但不同浓度的6-BA对不定芽增殖的作用有着明显的差异，浓度在2.0mg/L时效果最佳，增殖率达到最大值，平均增殖不定芽数的数量也最大，平均增殖系数达到4.5,且长势好；6-BA和KT互做时，未能增加不定芽的增殖率。
因此，8号培养基最适合不定芽的增殖。

[0068] 表4不同激素配比对不定芽增殖的影响

[0069]

[0070] 注：①a-b标不同字母者表示LSD多重比较法检测结果差异显著(P＝0.05,P＝0.01),相同字母则表示差异不显著。

[0071] ②表中数据为培养120天后，每个处理统计3次得出的平均值。

[0072] ③同栏平均值注有相同的小写英文字母，表示差异未达5％显著水平；同栏平均值注有不同的小写英文字母，表示差异达5％显著水平。同栏平均值注有相同的大写英文字母，表示差异未达1％极显著水平；同栏平均值注有不同的大写英文字母，表示差异达1％极显著水平。

[0073] 活性炭对不定芽增殖的影响

[0074] 本发明也进行了活性炭对不定芽增殖影响的测定，8号和17号培养基中不定芽的增殖情况相差不多，同时也发现，17号培养基中有不定根的生成，也就是说活性炭对不定芽的增殖效果影响很小，基本可以忽略不计，但对不定根的形成有促进作用。

[0075] 壮苗和生根：

[0076] 将上述分化培养获得的不定芽从基部剪下，接种到1/2MS、MS、1/2MS+0.2NAA和MS+0.2NAA生根培养基上进行壮苗、生根培养。结果表明，在培养基1/2MS+0.2NAA和MS+0.2NAA上，培养到7d时开始形成不定根，14d时最长不定根已达到4cm以上，但形成的根数量较少且较细，在后期的移栽过程中容易损伤，而且不定芽长势较弱，也不利于后期的移栽成活；在不添加激素的培养基1/2MS和MS，培养10d左右开始形成根，此时植株也逐渐生长，较为健壮，20d时不定芽基部形成一定数量的根，且形成的不定根长度适中、较为健壮，利于后期的移栽。因此，综合考虑利用培养基1/2MS为生根培养基，可以将壮苗和生根在一步中完成，既节约了成本也节省了时间、缩短了繁殖时间。图2和图3为采用本发明方法培养出的燕子花无性系植株，图4和图5为幼苗的移栽和后期的生长状态(图4为移栽4周的植株；图5为移栽3个月后的植株)。

[0077] 尽管目前已有一些鸢尾科鸢尾属植物组织培养的报道，但关于燕子花的组织培养却没有成熟的报道。本研究以燕子花幼嫩果实为材料，成功地进行了燕子花离体不定芽的生长，不定芽的增殖,壮苗和生根的研究，并建立起燕子花的无性系。

[0078] 在MS+0.1NAA+1.06-BA和MS+0.1NAA+2.06-BA培养基中，不定芽的诱导效果最好，34d后的出芽率为92％，且诱导出的不定芽比较均匀健壮。在MS+0.1NAA+2.06-BA这一培养基上对生长的不定芽进行增殖培养最适合，36d的增殖系数达到4.5。按照这个速度繁殖可以达到快速繁殖，满足市场的需要。这一方面与所采用试验材料是选择了分化能力强的燕子花幼嫩果实有关，另一方面还与所使用的基本培养基，不同激素配比有关。不同基本培养基对不定芽的增殖有着一定的影响，在选定MS、1/2MS、B5、Miller为基本培养基后，添加外源激素浓度、配比都相同时MS中的促进效果最好。对燕子花的研究发现，NAA与6-BA配合时有较好的诱导器官分化的效果,而2,4-D与6-BA或NAA与TDZ或有KT互作时配合则形成的不定芽量不多或形成的不定芽长势不好。活性炭对不定芽的增殖基本没什么促进作用，但有利于跟的生成，这可能与活性炭的吸附作用和其创造的相对于较暗的环境有关。

[0079] 以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。