一种氨基化淫羊藿苷‑羧甲基壳聚糖改性骨修复支架材料

摘要

一种新型PHBV改性诱导型骨修复支架材料，其制备：氨基乙酸溶于碳酸氢钠溶液，得第一溶液；二碳酸二叔丁酯溶于二氧六环，得第二溶液；第二溶液滴入第一溶液；调pH值至中性，溶解固体，滤液滴入冷乙醚，洗涤干燥不溶物，得二碳酸叔丁氧羰基‑甘氨酸；缩合淫羊藿苷和二碳酸叔丁氧羰基‑甘氨酸，产物中加入三氟乙酸与二氯甲烷的混合液，反应停止，蒸发；乙酸乙酯溶解剩余物质；除溶剂，得氨基化淫羊藿苷；缩合反应；氨基化淫羊藿苷‑PHBV倒入壳聚糖溶液，注入环形模具，液氮冷冻，脱模干燥，制得新型PHBV改性诱导型骨修复支架材料。该骨修复支架材料促进干细胞向成骨细胞定向分化，加速骨生长和功能恢复，能有效修复骨缺损。

权利要求

1.一种氨基化淫羊藿苷-羧甲基壳聚糖改性骨修复支架材料，其特征在于，该骨修复支架材料按以下步骤制得：步骤1：将氨基乙酸溶于碳酸氢钠溶液中，搅拌，得第一溶液；将二碳酸二叔丁酯完全溶解于二氧六环中，冷却后形成第二溶液；

步骤2：冰水浴中、在搅拌的条件下将第二溶液滴入第一溶液，滴加完毕后，室温下继续搅拌反应20～24h；

然后，用0.01M盐酸溶液调节反应后液的pH值至中性，除去溶剂，残留固体用二氯甲烷溶解，过滤，将滤液滴至冷乙醚中，析出固体，抽滤收集不溶物，用乙醚洗涤，真空干燥，得二碳酸叔丁氧羰基-甘氨酸；

步骤3：以二环己基碳二亚胺为脱水剂，以4-二甲氨基吡啶为催化剂，按质量比1︰1将淫羊藿苷和二碳酸叔丁氧羰基-甘氨酸进行缩合反应，得到淫羊藿苷-甘氨酸-二碳酸叔丁氧羰基；

步骤4：将三氟乙酸与二氯甲烷混合成混合溶液，将该混合溶液加入淫羊藿苷-甘氨酸-二碳酸叔丁氧羰基中，室温下搅拌，反应停止，旋转蒸发后；将剩余物质完全溶解于乙酸乙酯中，洗涤至pH值为8～9；除去溶剂，获得氨基化淫羊藿苷；

步骤5：通过缩合反应，将氨基化淫羊藿苷中的氨基与壳聚糖上羧甲基的羧基连接起来，得到氨基化淫羊藿苷-羧甲基壳聚糖；

步骤6：按质量百分比，将80%的氨基化淫羊藿苷-羧甲基壳聚糖倒入20%的壳聚糖溶液中，搅拌均匀后，挤压注入环形不锈钢模具中，置于液氮中冷冻10～20min，迅速取出，放入温度为4℃的凉水中5～10s，脱模，干燥，制得氨基化淫羊藿苷-羧甲基壳聚糖改性骨修复支架材料。

2. 根据权利要求1所述的氨基化淫羊藿苷-羧甲基壳聚糖改性骨修复支架材料，其特征在于，所述步骤1中，将2mmo1氨基乙酸溶于20mL 质量百分比浓度为1.68%的NaHCO3溶液中，得第一溶液；将0.45g 二碳酸二叔丁酯完全溶解于二氧六环中，冷却后形成第二溶液。

3. 根据权利要求1所述的氨基化淫羊藿苷-羧甲基壳聚糖改性骨修复支架材料，其特征在于，所述步骤4中，将9mL三氟乙酸与10mL二氯甲烷混合成混合溶液，然后将该混合溶液加入到5g 淫羊藿苷-甘氨酸-二碳酸叔丁氧羰基中。

4.根据权利要求1所述的氨基化淫羊藿苷-羧甲基壳聚糖改性骨修复支架材料，其特征在于，步骤6中所用不锈钢模具的长度10～12cm、内径1～1.2mm、外径4～4.2mm。

说明书

一种氨基化淫羊藿苷-羧甲基壳聚糖改性骨修复支架材料

技术领域

[0001] 本发明属于医疗技术领域，涉及一系列聚羟基丁酸酯共羟基戊酸酯（PHBV）改性诱导型骨修复支架材料，通过材料的构建、物理加工以及中药单体淫羊藿苷的化学改性等方法制成。

背景技术

[0002] 骨损伤是临床上常见的疾病，骨是一种天然的具有复杂分级结构的无机物与有机物的复合材料。战争、交通事故、工伤、运动创伤、疾病和自然灾害等原因造成的骨折、骨缺损和骨缺失伤患人数全世界每年达几百万，损伤的骨可用内源骨或外源骨修复。内源骨易被患者接受，修复效果较好，但其数量十分有限，而且需要二次手术，有可能带来别的损伤；而采用外源骨虽然取材简便，但修复效果远不如内源骨，目前外源骨修复手段存在免疫排斥反应，难降解，可能带有潜在的病原体和其他副反应等。所以临床上越来越广泛地采用人工制备的材料作为骨修复材料。

[0003] 研究表明，骨修复材料本身必须具备：足够的力学强度、与骨长入相匹配的材料降解速度、良好的生物相容性以及一定的组织诱导能力。

[0004] 骨修复材料是一类可对机体组织进行修复、替代与再生，具有特殊功能作用的材料。该类材料在临床的应用，为伤（患）者恢复正常的生理功能提供了可能，同时也可避免采用内源骨或外源骨所带来的问题。

[0005] 鉴于传统的骨组织生物材料的缺点，具有“主动修复功能”和“可调控生物响应”特性的第三代生物活性材料成为当前的研究热点和未来的发展方向。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于克服现有骨修复材料的缺点与不足，提供一系列具备适当力学性能又能有效诱导骨形成，从而实现对骨缺损有效快速修复的骨组织工程支架材料。

[0007] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种新型PHBV改性诱导型骨修复支架材料，其特征在于，该骨修复支架材料按以下步骤制得：

[0008] 步骤1：将氨基乙酸溶于碳酸氢钠溶液中，搅拌，得第一溶液；将二碳酸二叔丁酯完全溶解于二氧六环中，冷却后形成第二溶液；

[0009] 步骤2：冰水浴中、在搅拌的条件下将第二溶液滴入第一溶液，滴加完毕后，室温下继续搅拌反应20～24h；

[0010] 然后，用0.01M盐酸溶液调节反应后液的pH值至中性，除去溶剂，残留固体用二氯甲烷溶解，过滤，将滤液滴至冷乙醚中，析出固体，抽滤收集不溶物，用乙醚洗涤，真空干燥，得二碳酸叔丁氧羰基-甘氨酸；

[0011] 步骤3：以二环己基碳二亚胺为脱水剂，以4-二甲氨基吡啶为催化剂，按质量比1︰1将淫羊藿苷和二碳酸叔丁氧羰基-甘氨酸进行缩合反应，得到淫羊藿苷-甘氨酸-二碳酸叔丁氧羰基；

[0012] 步骤4：将三氟乙酸与二氯甲烷混合成混合溶液，将该混合溶液加入淫羊藿苷-甘氨酸-二碳酸叔丁氧羰基中，室温下搅拌，反应停止，旋转蒸发后；将剩余物质完全溶解于乙酸乙酯中，洗涤至pH值为8～9；除去溶剂，获得氨基化淫羊藿苷；

[0013] 步骤5：通过缩合反应，将氨基化淫羊藿苷中的氨基与壳聚糖上羧甲基的羧基连接起来，得到氨基化淫羊藿苷-PHBV；

[0014] 步骤6：按质量百分比，将80%的氨基化淫羊藿苷-PHBV倒入20%的壳聚糖溶液中，搅拌均匀后，挤压注入环形不锈钢模具中，置于液氮中冷冻10～20min，迅速取出，放入温度为4℃的凉水中5～10s，脱模，干燥，制得新型PHBV改性诱导型骨修复支架材料。

[0015] 本发明具有组织诱导性功能的骨修复支架材料是一种复合淫羊藿苷药物的PHBV和壳聚糖复合支架材料，具有如下优点：

[0016] 1）淫羊藿苷与材料共价结合的制备工艺达到设计要求，实现了药物的缓释作用，及药物对组织诱导的持续作用；

[0017] 2）材料具有良好的生物力学强度能起到支撑骨生长的作用；

[0018] 3）淫羊藿苷与材料共价结合的缓释的作用促进干细胞向成骨细胞定向分化，加速骨生长和功能恢复；

[0019] 4）具有良好的降解性和生物相容性，符合组织工程支架材料的要求；

[0020] 5）能有效修复骨缺损。

附图说明

[0021] 图1是淫羊藿苷氨基改性前后的红外对比图。

[0022] 图2是淫羊藿苷与PHBV材料结合及氨基改性的红外对比图。

[0023] 图3是淫羊藿苷氨基改性前的粒径图。

[0024] 图4是淫羊藿苷氨基改性后的粒径图。

[0025] 图5是淫羊藿苷氨基改性前后的X射线衍射（XRD）对比图。

[0026] 图6是淫羊藿苷氨基改性前后的差热-热重分析（TG/DTA）对比图。

[0027] 图7是本发明骨修复支架材料的横截面扫描电镜图。

[0028] 图8是本发明骨修复支架材料形貌的扫描电镜图。

[0029] 图9是本发明骨修复支架材料表面细胞生长的扫描电镜图。

[0030] 图10是淫羊藿苷-PHBV骨修复支架材料进行动物实验1月时的组织学染色（HE染色）光学显微镜图。

[0031] 图11是本发明氨基化淫羊藿苷-PHBV骨修复支架材料进行动物实验1月时的组织学染色（HE染色）光学显微镜图。

[0032] 图12是淫羊藿苷-PHBV骨修复支架材料进行动物实验3月时的组织学染色（HE染色）光学显微镜图。

[0033] 图13是本发明氨基化淫羊藿苷-PHBV骨修复支架材料进行动物实验3月时的组织学染色（HE染色）光学显微镜图。

[0034] 图14是淫羊藿苷-PHBV骨修复支架材料进行动物实验6月时的组织学染色（HE染色）光学显微镜图。

[0035] 图15是本发明氨基化淫羊藿苷-PHBV骨修复支架材料进行动物实验6月时的组织学染色（HE染色）光学显微镜图。

[0036] 图16是淫羊藿苷-PHBV支架材料动物实验的6月时组织学染色（Masson染色）光学显微镜图。

[0037] 图17是本发明氨基化淫羊藿苷-PHBV支架材料动物实验6月时的组织学染色（Masson染色）光学显微镜图。

具体实施方式

[0038] 下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

[0039] 本发明提供了一种具有组织诱导性功能的PHBV骨修复支架材料，以复合淫羊藿苷药物的PHBV壳聚糖复合材料作为骨修复支架材料，具有组织诱导性，用于骨缺损修复，可有效提高骨损伤修复及其功能恢复，降低致残率。

[0040] 该骨修复支架材料具体按以下步骤制得：

[0041] 步骤1：将2mmo1氨基乙酸溶于20mL 质量百分比浓度为1.68%的NaHCO3溶液中，室温搅拌1～2h，得第一溶液；将0.45g 二碳酸二叔丁酯（Boc）完全溶解于二氧六环中，冷却后形成第二溶液；

[0042] 步骤2：冰水浴中、在搅拌的条件下将2mmo1第二溶液2 mL缓慢滴入第一溶液，滴加完毕后，室温下继续搅拌反应20～24h；反应式为：

[0043]

[0044] 然后，用0.01M盐酸溶液调节反应后液的pH值至中性，旋转蒸发除去溶剂，残留固体用二氯甲烷（CH2CCl2）溶解，过滤除去不溶物(NaC1)，将滤液滴至冷乙醚中，析出淡黄色固体，抽滤收集不溶物，用乙醚洗涤3～5次，置于真空干燥箱中干燥，得二碳酸叔丁氧羰基-甘氨酸（Boc-GLY）；

[0045] 步骤3：以二环己基碳二亚胺（DCC）为脱水剂，以4-二甲氨基吡啶（DMAP）为催化剂，按质量比1︰1将淫羊藿苷（Icariin）和Boc-GLY（Boc-GLY稍过量）进行缩合反应，得到淫羊藿苷-甘氨酸-二碳酸叔丁氧羰基（Icariin-GLy-Boc），反应式为：

[0046]

[0047] 步骤4：将9mL三氟乙酸与10mL二氯甲烷混合成混合溶液，然后将该混合溶液加入到5g Icariin-GLy-Boc中，室温下搅拌1～2h，反应停止，旋转蒸发后；将剩余物质放入适量乙酸乙酯中完全溶解，然后，用质量百分比浓度为5%的NaCO3溶液洗涤至pH值为8～9；除去溶剂，获得脱去Boc保护基后的产物，该产物为氨基化淫羊藿苷（Icariin-NH2），反应式为：

[0048]

[0049] 步骤5：Icariin-NH2与PHBV连接：

[0050] 利用碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)法（参考文献：王迎军，杨春蓉，汪凌云. EDC/NHS交联对胶原物理化学性能的影响，华南理工大学学报(自然科学版),2007,35（12）：66-70），通过缩合反应，将Icariin-NH2中的氨基与壳聚糖上羧甲基的羧基连接起来，得到氨基化淫羊藿苷-PHBV（Icariin-NH2-PHBV），反应式为：

[0051]

[0052] 步骤6：按质量百分比，将80%的Icariin-NH2-PHBV倒入20%的壳聚糖溶液中，匀浆机高速（2500转/分钟）搅拌均匀后，挤压注入环形不锈钢模具中（该模具的长度10～12cm、内径1～1.2mm、外径4～4.2mm），然后连同模具一同置于液氮中冷冻10～20min，迅速取出，放入温度为4℃的凉水中5～10s，脱模，干燥，制得新型PHBV改性诱导型骨修复支架材料。

[0053] 淫羊藿苷能有效促进骨髓间充质干细胞（MSCs）的增殖；并通过诱导碱性磷酸酶、骨钙素的表达和钙化结节的形成促进MSCs向成骨细胞分化，因而可视为一种良好的骨诱导活性因子。本发明利用化学改性方法使淫羊藿苷改性后与PHBV材料共价结合，随着PHBV材料的降解使淫羊藿苷实现缓释，促进成骨细胞增殖分化的作用实现组织修复的功能。

[0054] 本发明PHBV改性诱导型骨修复支架材料的评价：

[0055] 1）红外光谱仪测定：溴化钾研磨，制片，利用日本岛律C8-20型傅里叶样品的傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectrometer, FTIR）。淫羊藿苷改性前后的红外对比图，如图1所示，图中显示，氨基化淫羊藿苷在3371cm-1和3328cm-1处出现2个中等强度、形状尖锐的N-H伸缩振动峰，在1689cm-1出现N-H变角振动峰，表明NH2的存在；在1708cm-1、1625cm-1出现C=O伸缩振动峰，为酯基的特征峰；2926cm-1、2850cm-1处出现的2个峰对应C-H伸缩振动峰，表明亚甲基的出现；以上结果表明淫羊藿苷被成功的氨基化改性。
利用DCC的红外特征吸收峰判定反应的进行程度和原料是否处理完全，淫羊藿苷与PHBV材料结合及氨基改性的红外对比图，如图2所示，从图2可看出壳聚糖微球化过程中，壳聚糖上的-NH2与戊二醛上的-CHO发生了schiff碱交联反应，1714cm-1、1560 cm-1处出现明显的新吸收峰；与壳聚糖的红外吸收图谱相比较，氨基化淫羊藿苷-壳聚糖（Icariin-NH2-CSM）的红外吸收图谱并没有出现新的特征峰，表明Icariin-NH2与壳聚糖之间没有新键的生成，但其主要特征峰都出现一定量的红移，Icariin-NH2主要是以物理包埋的方式被壳聚糖所包埋，说明Icariin-NH2可能以共价键交联的方式被壳聚糖所固定。中间产物Icariin-Gly-Boc在
2117cm-1出现的特征峰为DCC结构中含有C＝N，表明最终产物Icariin-NH2此处没有峰出现。

[0056] 2）粒径分布：利用珠海欧美克仪器有限公司的LS-POP动静态多角度激光光散仪测定粒径分布。图3是淫羊藿苷氨基化改性前微球的粒径曲线图，图4是淫羊藿苷氨基化改性后微球的粒径曲线图，图中显示，两种微球的粒径主要集中在3～12  、3～9 范围内，与SEM观察结果相比，其粒径范围均有一定程度的增大，主要是部分微球聚集所造成的。

[0057] 3）X射线衍射：利用Rigaku XG  control RINT2500  X射线衍射(X-ray diffraction，XRD)仪分别分析淫羊藿苷和氨基化淫羊藿苷的物相。如图5所示，图中显示，改性前后样品结晶性都较好；氨基化改性后，由于氨基的存在，样品的结晶性有所增强，样品的主要衍射峰均呈现小角度偏移，表明淫羊藿苷氨基化后其结晶性增强，有助于材料结晶成形。

[0058] 4）热失重及差热分析：利用美国TA公司的SDT-Q600型热重–差热分析仪(thermogravimetry-differential thermal analysis，TG–DTA)分别分析淫羊藿苷样品和氨基化淫羊藿苷样品的热失重及差热分析。如图6所示，图中显示，氨基化改性后，受氨基的影响，Ica-NH2的热稳定性明显降低。Ica的明显失重出现在190℃附近，而Ica-NH2的则在160℃附近出现明显的失重。对应的DTA曲线显示淫羊藿苷分别在57℃附近和196℃附近出现2个明显的放热峰，而Ica-NH2则在51℃附近、108℃附近和222℃附近出现3个较明显的放热峰，表明淫羊藿苷氨基化后热稳定性比氨基化前明显降低，热稳定性降低表明物质混合程度较高，有助于材料降解时药物的均一和有效释放。

[0059] 5）扫描电子显微镜(SEM)观察：对本发明骨修复支架材料断面喷金后，利用荷兰PHILIPS公司XL-30环境扫描电子显微镜观察材料的断面形貌；该骨修复支架材料横截面扫描电镜图，如图7所示，图中显示该骨修复支架材料外径约3.4～3.5mm，中空孔径约在740～760 ，且结构较为致密。该骨修复支架材料的形貌扫描电镜图，如图8所示，从图中可看出壳聚糖材料作为基材呈网络状分布，PHBV呈链接球状，均匀分布在壳聚糖聚合物的网络之间，壳聚糖网络与PHBV球状物网络形成互穿网络结构，网络间有一定的微孔分布，微孔大小
3～10 。说明该材料具有一定的孔隙结构，有助于物质交换和组织的形成。

[0060] 6）力学性能评价：利用Instron5865万能材料测试机测试材料的抗压强度，平衡5个样。实验结果显示，两种材料的弯曲强度45～50MPa，显著大于松质骨的弯曲强度要求(大于 20 M P a)。表明该类材料具备一定的力学强度，在骨缺损修复过程中能发挥一定的支撑作用。

[0061] 本发明PHBV改性诱导型骨修复支架材料的生物相容性评价

[0062] 将该本发明骨修复支架材料置于DMEM/F12培养基中，接种大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）后， 37℃ 5% CO2培养箱分别培养3d和7d，扫描电镜观察细胞与材料的复合情况，如图9所示，图中显示细胞能在材料表面生长、增殖，说明该材料对细胞无毒副作用，具有良好的生物相容性。

[0063] 本发明PHBV改性诱导型骨修复支架材料的修复效果评价

[0064] 对照组骨修复支架材料的制备：按质量百分比，将80%的PHBV+Icarin倒入20%壳聚糖溶液中，匀浆机高速（2500转/分钟）搅拌均匀后，挤压注入环形不锈钢模具中（该模具的长度10～12cm、内径1～1.2mm、外径4～4.2mm），然后连同模具一同置于液氮中冷冻10～20min，迅速取出，放入温度为4℃的凉水中5～10s，脱模，干燥，制得淫羊藿苷-PHBV材料。

[0065] 1）动物实验：选用清洁级青紫蓝兔18只，体重3～4 kg，雌雄不拘，随机分为2组，即实验组（氨基化淫羊藿苷-PHBV材料组）和对照组（淫羊藿苷-PHBV材料组），每组9只。按每千克体重30mg的用量给2组中的实验兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠进行麻醉，左侧前臂剃毛，2.5%碘酒消毒并铺无菌洞巾。于前臂桡侧纵行切口，逐层显露桡骨骨干，切除左前腿桡骨
1.0～1.2cm骨段，实验组植入氨基化淫羊藿苷-PHBV，对照组植入淫羊藿苷-PHBV材料。术后清洁级环境下饲养。

[0066] 2）骨修复影像学评价：分别于术后1月、3月、6月做三次三维CT和X射线的影像学检测，观察其骨修复情况。结果显示：术后1月时，实验组和对照组骨缺损处影像检测无差异。术后3月时，实验组缺损处骨桥建立，新生骨沿材料生长；6个月时新生骨生长显著增多，且缺损处骨密度明显增加。对照组3个月时缺损处骨桥尚未建立，6个月时新生骨数量较少，且缺损处骨密度明显低于实验组。

[0067] 3）组织学（HE和Masson染色）分析：分别于术后1个月、3个月和6个月时，静脉注射空气法处死兔子，取材并全长骨修复处取材，常规石蜡包被，HE和Masson染色，光学显微镜下观察分析材料与宿主的生物相容性、炎性反应程度和宿主/材料界面形成的组织结构特征。术后1个月时，实验组和对照组骨缺损处宿主/材料界面无炎性细胞侵润，主要以成纤维细胞为主；如图10和图11所示。术后3个月时，对照组材料周围主要以纤维组织为主，如图12所示；术后3个月时，实验组缺损处有新生骨形成，如图13所示。术后6个月时，对照组有少量的新生骨形成，材料周围以成纤维组织居多，如图14图和16所示；实验组缺损处有大量的新生骨形成，且部分新生骨进入材料边缘内，如图15和17所示；两组支架材料部分被降解。

[0068] 通过上述实验证实：本发明PHBV诱导性骨修复材料通过氨基化淫羊藿苷诱导骨生长，实现了具有组织诱导性骨修复的组织工程支架材料，以期形成具有自主知识产权的生物材料并用于临床治疗。

[0069] 通过构建结合淫羊藿苷药物的骨修复材料，使其具有组织诱导性功能，有效解决骨损伤修复及其功能恢复。本发明PHBV壳聚糖复合诱导性骨修复材料的原材料可工业化大规模生产，来源丰富，组织工程支架成型方法简单易于操作，所用材料无毒、易降解且具有良好的生物相容性。改性淫羊藿苷与材料共价结合的制备工艺达到设计要求，能实现有效的药物缓释效果。