一种仿软骨细胞外基质可注射水凝胶的制备方法

摘要

本发明涉及一种可注射水凝胶的制备方法，特别是一种仿软骨细胞外基质可注射水凝胶的制备方法，属于生物医用材料制备技术领域。本发明采用紫外光聚合技术，以甲基丙烯酰化丝素蛋白和马来酰化甲壳胺为原料，制备仿软骨细胞外基质可注射水凝胶。该水凝胶由模拟软骨细胞外基质的主要成分胶原蛋白和糖胺聚糖的全天然高分子构成，能全面模拟软骨细胞外基质的微环境，显著促进软骨细胞的黏附、生长与增殖，生物相容性好；另一方面，由于采用紫外光聚合技术，将甲基丙烯酰化丝素蛋白微粒作为主交联点嵌入到马来酰化甲壳胺凝胶中，形成纳米微粒共价交联甲壳胺分子链的纳米增强型水凝胶结构，赋予水凝胶高的机械强度，完全克服水凝胶强度低的缺陷。

权利要求

1.一种仿软骨细胞外基质可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法按以下步骤进行：a.马来酰化甲壳胺的制备

将甲壳胺和马来酸酐置于非质子溶剂中，甲壳胺与非质子溶剂质量体积比为1：10～

200，甲壳胺分子链上氨基与马来酸酐的酸酐基摩尔比为1：0.1～10，室温下搅拌均匀，在25～90℃条件下反应，反应时间为12～48小时，反应结束后，在甲壳胺、马来酸酐、非质子溶剂形成的混合溶液中加入无水丙酮至混合溶液无沉淀析出为止，收集沉淀物，沉淀物在室温下真空干燥2天，得到摩尔取代度为0.05～0.5的马来酰化甲壳胺；

b.甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒的制备

将甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酰氯、三乙胺分别置于甲苯中，甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酰氯、三乙胺的摩尔比为1：1.1：1.1，甲基丙烯酸羟乙酯与甲苯的体积比为1：10，搅拌均匀，在

0～5℃条件下反应4小时，反应结束后，将甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酰氯、三乙胺、甲苯形成的混合溶液，按去离子水、1mol/L盐酸、1mol/L氢氧化钠溶液的顺序对甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酰氯、三乙胺、甲苯形成的混合溶液进行洗涤，分液得上层亮黄色液体，亮黄色液体在

35℃条件下真空干燥24h，得到丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯；

将丝素蛋白纳米微粒和上述丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯分别置于非质子溶剂中，丝素蛋白纳米微粒与非质子溶剂重量体积比为1：50～200，丝素蛋白纳米微粒分子链上的氨基与丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯的丙烯酰基摩尔比为1：1～20，室温下搅拌均匀，在25～

70℃条件下反应，反应时间为12～24小时，反应结束后，在丝素蛋白纳米微粒、丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯、非质子溶剂形成的固液体系中，加入无水丙酮至固液体系中无沉淀析出为止，收集沉淀物，沉淀物在室温下真空干燥2天，得到摩尔取代度为0.04～0.2的甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒；

c.仿软骨细胞外基质可注射水凝胶的制备

将经步骤a得到的马来酰化甲壳胺、经步骤b得到的甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒、生长因子、光引发剂、磷酸盐缓冲溶液按照质量百分比分别为：的比例，室温下高速混合均匀，得到粘度为10000～100000cps仿软骨细胞外基质前体溶液，仿软骨细胞外基质前体溶液在紫外光下照射1～5min，形成仿软骨细胞外基质可注射水凝胶，其中，紫外光波长为320nm，光强为5～100mW/cm2。

2.根据权利要求1所述的一种仿软骨细胞外基质可注射水凝胶的制备方法，其特征在于：所述非质子溶剂为二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺或二甲基亚砜中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种仿软骨细胞外基质可注射水凝胶的制备方法，其特征在于：所述生长因子为转移生长因子β或成纤维生长因子或骨形态发生蛋白或胰岛素生长因子中的一种。

4.根据权利要求1所述的一种仿软骨细胞外基质可注射水凝胶的制备方法，其特征在于：所述光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-对羟乙基醚基苯基丙酮或1-羟基环己基苯基甲酮或

2,2-二甲氧基-苯基乙酮中的一种。

5.根据权利要求1所述的一种仿软骨细胞外基质可注射水凝胶的制备方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲溶液为pH为7.0～7.4的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液或K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液的一种。

说明书

一种仿软骨细胞外基质可注射水凝胶的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种可注射水凝胶的制备方法，特别是一种仿软骨细胞外基质可注射水凝胶的制备方法，属于生物医用材料制备技术领域。

背景技术

[0002] 软骨是一种无血管、神经和淋巴腺的组织，主要由一些稀疏的软骨细胞包埋在较为密集的细胞外基质中组成。这种特殊的组织结构，使得软骨对于损伤的自修复能力极低，如若治疗不恰当，可能会导致严重的功能障碍。临床上，由各种原因引起的软骨损伤十分常见。

[0003] 目前，临床上常用的用于关节软骨修复的方法主要有微骨折法、自体软骨移植和同种异体软骨移植。这些方法虽然在一定程度上降低了软骨损伤带给病人的疼痛感，提高了软骨的部分功能，但是，存在着供体匮乏、机体对植入组织的免疫排斥反应、移植造成的疾病传播等缺点，难以满足临床需要。

[0004] 近些年来，将软骨细胞在合适的基质中培养增殖，然后移入软骨缺损部位，进行修复的方法成为一种理想的解决途径。这里，基质对软骨的修复效果起着至关重要的作用。在诸多材料形成的基质中，可注射型水凝胶，由于其结构形态更接近于天然软骨基质，能更好地为受损软骨组织提供适合其修复与再生的微环境，同时具有精确填充任意形状和深度的软骨损伤部位、紧密粘合周围组织、微创注入等可注射特性，而成为当前最为理想的软骨修复材料之一。

[0005] 可注射型水凝胶的制备方法很多，包括化学（或辐射）交联、相转变、分子自组装等。然而，这些制备方法由于存在着诸如交联剂（或引发剂）具有一定的毒性、交联反应时较大反应热的释放、射线对细胞和组织的损伤、原位形成凝胶的时间较长等缺陷，大大限制其在软骨修复中的普遍应用。

[0006] 原位光聚合的方法制备软骨损伤修复用可注射水凝胶，恰能很好地克服上述诸多缺陷，优势显著。通常，生成这种水凝胶所用的单体一般由含有两个或多个带有光活性基团的水溶性天然高分子或合成高分子单体组成。然而，由单一的合成高分子单体所形成的原位光聚合水凝胶，表面缺乏细胞可以识别的位点，不利于细胞特异性黏附及特异基因的激活；而由单一的天然高分子单体所形成的原位光聚合水凝胶机械强度差，不足以匹配软骨组织。虽然研究者们做了改进，构建了系列光聚合天然高分子-合成高分子杂化水凝胶支架，然而，这些杂化水凝胶支架，由于微环境中合成高分子的引入，致使整个支架材料的生物活性显著降低，与全天然高分子水凝胶支架相比，在促进软骨细胞的黏附、生长与增殖方面，差距明显。

发明内容

[0007] 针对上述问题，本发明的目的在于提供一种生物相容性好、强度高的仿软骨细胞外基质可注射水凝胶的制备方法。

[0008] 为了实现上述目的，其技术方案如下。

[0009] 一种仿软骨细胞外基质可注射水凝胶的制备方法，所述制备方法按以下步骤进行：

[0010] a. 马来酰化甲壳胺的制备

[0011] 将甲壳胺和马来酸酐置于非质子溶剂中，甲壳胺与非质子溶剂质量体积比为1：10～200，甲壳胺分子链上氨基与马来酸酐的酸酐基摩尔比为1：0.1～10，室温下搅拌均匀，在25～90℃条件下反应，反应时间为12～48小时，反应结束后，在甲壳胺、马来酸酐、非质子溶剂形成的混合溶液中加入无水丙酮至混合溶液无沉淀析出为止，收集沉淀物，沉淀物在室温下真空干燥2天，得到摩尔取代度为0.05～0.5的马来酰化甲壳胺。

[0012] b. 甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒的制备

[0013] 将甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酰氯、三乙胺分别置于甲苯中，甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酰氯、三乙胺的摩尔比为1：1.1：1.1，甲基丙烯酸羟乙酯与甲苯的体积比为1：10，搅拌均匀，在0～5℃条件下反应4小时，反应结束后，将甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酰氯、三乙胺、甲苯形成的混合溶液，按去离子水、1 mol/L盐酸、1 mol/L氢氧化钠溶液的顺序对甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酰氯、三乙胺、甲苯形成的混合溶液进行洗涤，分液得上层亮黄色液体，亮黄色液体在35℃条件下真空干燥24h，得到丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯。

[0014] 将丝素蛋白纳米微粒和上述丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯分别置于非质子溶剂中，丝素蛋白纳米微粒与非质子溶剂重量体积比为1：50～200，丝素蛋白纳米微粒分子链上氨基与丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯丙烯酰基摩尔比为1：1～20，室温下搅拌均匀，在25～70℃条件下反应，反应时间为12～24小时，反应结束后，在丝素蛋白纳米微粒、丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯、非质子溶剂形成的固液体系中，加入无水丙酮至固液体系中无沉淀析出为止，收集沉淀物，沉淀物在室温下真空干燥2天，得到摩尔取代度为0.04～0.2的甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒。

[0015] c. 仿软骨细胞外基质可注射水凝胶的制备

[0016] 将经步骤a得到的马来酰化甲壳胺、经步骤 b得到的甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒、生长因子、光引发剂、磷酸盐缓冲溶液按照质量百分比分别为：

[0017] 马来酰化甲壳胺                           2～10%

[0018] 甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒             0.1～3%

[0019] 生长因子                                 0～0.01%

[0020] 光引发剂                                 0.05～0.1%

[0021] 磷酸盐缓冲溶液                           86.89～97.85%

[0022] 的比例，室温下高速混合均匀，得到粘度为10000～100000cps的仿软骨细胞外基质前体溶液，仿软骨细胞外基质前体溶液在紫外光下照射1～5 min，形成仿软骨细胞外基质可注射水凝胶，其中，紫外光波长为320-480 nm，光强为5～100 mW/cm2。

[0023] 所述非质子溶剂为二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺或二甲基亚砜中的一种。

[0024] 所述生长因子为转移生长因子β或成纤维生长因子或骨形态发生蛋白或胰岛素生长因子中的一种。

[0025] 所述光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-对羟乙基醚基苯基丙酮或1-羟基环己基苯基甲酮或2,2-二甲氧基-苯基乙酮中的一种。

[0026] 所述磷酸盐缓冲溶液为pH为7.0～7.4的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液或K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液的一种。

[0027] 由于采用以上技术方案，本发明的仿软骨细胞外基质可注射水凝胶的制备方法，其有益技术效果是：

[0028] （1）本发明的制备方法采用甲基丙烯酰化丝素蛋白、马来酰化甲壳胺分别模拟结构相似的软骨细胞外基质的主要成分胶原蛋白和糖胺聚糖，从仿生角度以全天然高分子构建了可注射水凝胶，全面模拟软骨细胞外基质的微环境，显著促进软骨细胞的黏附、生长与增殖，生物相容性好。

[0029] （2）本发明的制备方法采用紫外光聚合技术，将甲基丙烯酰化丝素蛋白微粒作为主交联点嵌入到马来酰化甲壳胺凝胶中，形成纳米微粒共价交联甲壳胺分子链的纳米增强型水凝胶结构，赋予水凝胶高的机械强度，完全克服天然高分子形成的水凝胶强度低的普遍缺陷。本发明制备方法简单，成本低，易工业化生产。

具体实施方式

[0030] 下面结合具体实施例对本发明仿软骨细胞外基质可注射水凝胶的制备方法作进一步详细描述。

[0031] 一种仿软骨细胞外基质可注射水凝胶的制备方法，所述制备方法按以下步骤进行：

[0032] a. 马来酰化甲壳胺的制备

[0033] 将甲壳胺和马来酸酐置于非质子溶剂中，甲壳胺与非质子溶剂质量体积比为1：10～200，甲壳胺分子链上氨基与马来酸酐的酸酐基摩尔比为1：0.1～10，室温下搅拌均匀，在25～90℃条件下反应，反应时间为12～48小时，反应结束后，在甲壳胺、马来酸酐、非质子溶剂形成的混合溶液中加入无水丙酮至混合溶液无沉淀析出为止，收集沉淀物，沉淀物在室温下真空干燥2天，得到摩尔取代度为0.05～0.5的马来酰化甲壳胺。

[0034] 甲壳胺是一种亲水性天然高分子，具有诸多优良特性，例如良好的生物相容性、生物可降解性、抗菌性和促进伤口愈合等。由于具有这些特性，甲壳胺在伤口敷料、药物控释系统和组织工程等诸多方面有着广泛的应用前景。然而，尽管甲壳胺具有良好的应用潜力，但由于它们是分子结构规整的线性高分子，结晶度高，使得溶解性非常差，仅能溶解在稀酸或毒性大的离子液体中，大大限制其在生物医学方面的应用。

[0035] 本发明中，利用甲壳胺分子链上氨基与马来酸酐的酰化反应，得到带有羧基和双键的丙烯酰化甲壳胺，水溶性好，同时由于引入双键，可以进一步进行自由基聚合得到交联的三维网络结构水凝胶。步骤a中，通过控制甲壳胺的氨基与马来酸酐的酸酐基的摩尔比以及反应条件，来实现甲壳胺的氨基N上定位取代，且实现马来酰化基团的取代度在0.05～0.5范围内，保证马来酰化甲壳胺具备良好水溶性的同时，分子链上有足够含量的双键可以进行下一步的聚合反应或交联反应。因此，选择合适的摩尔比为：1：0.1～10；选择合适的反应条件为：温度25～90℃，反应时间12～48小时。这里的非质子溶剂是该酰化反应的促进剂和良溶剂，可促进该反应的进行以及反应产物的溶解。

[0036] b. 甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒的制备

[0037] 将甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酰氯、三乙胺分别置于甲苯中，甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酰氯、三乙胺的摩尔比为1：1.1：1.1，甲基丙烯酸羟乙酯与甲苯的体积比为1：10，搅拌均匀，在0～5℃条件下反应4小时，反应结束后，将甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酰氯、三乙胺、甲苯形成的混合溶液，按去离子水、1 mol/L盐酸、1 mol/L氢氧化钠溶液的顺序对甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酰氯、三乙胺、甲苯形成的混合溶液进行洗涤，分液得上层亮黄色液体，亮黄色液体在35℃条件下真空干燥24h，得到丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯。

[0038] 将丝素蛋白纳米微粒和上述丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯分别置于非质子溶剂中，丝素蛋白纳米微粒与非质子溶剂重量体积比为1：50～200，丝素蛋白纳米微粒分子链上氨基与丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯丙烯酰基摩尔比为1：1～20，室温下搅拌均匀，在25～70℃条件下反应，反应时间为12～24小时，反应结束后，在丝素蛋白纳米微粒、丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯、非质子溶剂形成的固液体系中，加入无水丙酮至固液体系中无沉淀析出为止，收集沉淀物，沉淀物在室温下真空干燥2天，得到摩尔取代度为0.04～0.2的甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒。所述非质子溶剂为二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺或二甲基亚砜中的一种。

[0039] 丝素蛋白纳米微粒表面分子链上具有活性氨基，通过氨基与丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯分子上非甲基取代基端不饱和双键之间的迈克尔加成反应，控制反应配比和反应条件，得到表面带有双键基团的甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒，且甲基丙烯酰基取代度在0.04～0.2范围内，来保证甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒内部晶型结构基本不变的同时，表面具有足够的双键含量，可以进行下一步的聚合反应或交联反应。因此，选择合适的摩尔比为1：1～20选择合适的反应条件为：温度25～70℃，反应时间为12～24小时。这里的非质子溶剂是丝素蛋白反应的促进剂。

[0040] c. 仿软骨细胞外基质可注射水凝胶的制备

[0041] 将经步骤a得到的马来酰化甲壳胺、经步骤 b得到的甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒、生长因子、光引发剂、磷酸盐缓冲溶液按照质量百分比分别为：

[0042] 马来酰化甲壳胺                           2～10%

[0043] 甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒             0.1～3%

[0044] 生长因子                                 0～0.01%

[0045] 光引发剂                                 0.05～0.1%

[0046] 磷酸盐缓冲溶液                           86.89～97.85%

[0047] 的比例，室温下高速混合均匀，得到粘度为10000～100000cps的仿软骨细胞外基质前体溶液，仿软骨细胞外基质前体溶液在紫外光下照射1～5 min，形成仿软骨细胞外基质可注射水凝胶，其中，紫外光波长为320-480 nm，光强为5～100 mW/cm2。

[0048] 所述生长因子为转移生长因子β或成纤维生长因子或骨形态发生蛋白或胰岛素生长因子中的一种。

[0049] 所述光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-对羟乙基醚基苯基丙酮或1-羟基环己基苯基甲酮或2,2-二甲氧基-苯基乙酮中的一种。

[0050] 所述磷酸盐缓冲溶液为pH为7.0～7.4的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液或K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液的一种。

[0051] 我们运用仿生学原理，利用全天然高分子模拟天然软骨细胞外基质结构和功能，基于光聚合技术构建仿生可注射水凝胶。从软骨结构看，胶原蛋白和糖胺聚糖是软骨细胞外基质的主要成分，由两种主要成分构成的胞外基质不仅能使软骨细胞在空间结构上分布均匀，而且还能为其提供和传导环境信号，引导细胞黏附与增殖，形成特定的组织。为了构建这种软骨细胞外微环境，我们模拟软骨细胞外基质结构，选用丝素蛋白模拟胶原蛋白，因其结构和胶原蛋白结构类似，同是天然可降解的蛋白质，具有优良的生物相容性，而且分子结构上具有细胞信号识别位点，能促进软骨细胞的黏附、生长与增殖，维持细胞的表型。同时，选用甲壳胺模拟糖胺聚糖，因其甲壳胺是一种具有良好生物相容性和可降解性的天然多糖，其结构与软骨组织中的糖胺聚糖——硫酸软骨素、透明质酸等物质结构相似，能够促进软骨基质生成和软骨细胞的增殖。

[0052] 生长因子参与软骨细胞的增殖、分化和迁移，并在软骨基质的维持及降解过程中起重要作用。其中的胰岛素生长因子，是最早被发现的可作用于软骨的生长因子之一，是软骨基质合成的主要刺激因子，不仅可以刺激关节软骨细胞的增殖，还可以刺激软骨细胞的分化和合成基质，增加软骨组织的胶原和蛋白多糖的合成，同时抑制软骨基质的降解。转移生长因子β软骨的发展阶段起着重要作用，主要调节细胞的分化。成纤维生长因子是伤口愈合过程中细胞有丝分裂的促进剂，保持软骨细胞在扩增过程中软骨化的潜能、促进细胞分裂。骨形态发生蛋白调节软骨细胞的分化状态、增加细胞外基质的合成。

[0053] 本发明中用到的光引发剂2-羟基-2-甲基-1-对羟乙基醚基苯基丙酮或1-羟基环己基苯基甲酮或2,2-二甲氧基-苯基乙酮，均是生物相容性良好的光引发剂，文献中已经有报道。

[0054] 步骤c中仿软骨细胞外基质前体溶液，是粘度为10000～100000cps的溶液，具有可注射性。溶液粘度过高，流动性较差，注射时填满缺损部位所需的时间较长；溶液粘度过低，流动性非常高，注射时塑形困难。将仿软骨细胞外基质前体溶液通过注射针管注入到软骨缺损部位，并在由光纤引入的紫外光照射下迅速凝胶，与软骨缺损部位嵌合紧密。

[0055] 步骤c中采用的是紫外光聚合的方法，该方法具有反应条件温和，释放的反应热低，交联固化时间短等特点。马来酰化甲壳胺、甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒、生长因子、光引发剂、磷酸盐缓冲溶液混合体系，在长波紫外光照射下经光聚合引发原位快速固化形成纳米复合水凝胶。

[0056] 该水凝胶其结构实质是由分子链接枝纳米微粒形成的“粒-链”结构，纳米微粒提供主交联点，通过长链分子与纳米微粒表面共聚交联，形成一种微粒与微粒之间通过长链分子连接的结构，显著提高水凝胶支架的机械强度。本水凝胶的压缩强度测试值为1.1-1.6MPa，处于天然软骨的压缩强度值范围内（0.1-2MPa），达到应用要求；而有单一天然高分子构建的水凝胶的压缩强度测试值在几至几十KPa范围内，难以满足应用要求。

[0057] 该水凝胶的细胞毒性测试值为1级，表明该水凝胶的细胞相容性很好。其原因在于，该仿生水凝胶成分和结构类似与天然软骨细胞外基质，可为软骨的黏附、增殖和细胞间信号传递提供理想的微环境，有利于软骨细胞的黏附与增殖。

[0058] 该水凝胶结构中丝素蛋白纳米微粒不会发生迁移且降解速度较慢，当凝胶降解后，丝素蛋白纳米微粒的堆砌仍然维持软骨细胞生长的空间，微粒与微粒之间的连通孔隙便于细胞所需营养和气体的交换以及代谢产物的排出。该水凝胶兼具可注射支架材料和仿生支架材料双重优势，不仅与软骨损伤组织之间嵌合性好、塑形容易及微创，而且，给软骨的黏附、增殖和细胞间信号传递提供理想的微环境，有利于软骨组织的再生与修复。具体实施例

[0059] 实施例1

[0060] 称取甲壳胺5g、马来酸酐0.25g，加入到50mL二甲基甲酰胺中，室温下搅拌均匀，在25℃条件下反应12小时，反应结束后，加入无水丙酮至无沉淀析出为止，收集沉淀物，室温下真空干燥2天，得到摩尔取代度为0.05的马来酰化甲壳胺。

[0061] 称取甲基丙烯酸羟乙酯44.94g、丙烯酰氯34.38g、三乙胺38.44g，加入到419mL的甲苯中，搅拌均匀，在0～5℃条件下反应4小时，反应结束后，依次用水105mL、1 mol/L盐酸100 mL、1 mol/L氢氧化钠溶液100 mL洗涤，分液得上层亮黄色液体，在35℃条件下真空干燥24h，得到45.0g丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯。

[0062] 称取丝素蛋白纳米微粒5g、丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯0.07g，加入到250mL二甲基甲酰胺中，在25℃条件下反应，反应时间为12小时，反应结束后，加入无水丙酮至无沉淀析出为止，收集沉淀物，室温下真空干燥2天，得到摩尔取代度为0.04的甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒。

[0063] 称取马来酰化甲壳胺2g、甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒0.1g、转移生长因子β0.01g、2-羟基-2-甲基-1-对羟乙基醚基苯基丙酮0.05g，加入到97.84g pH为7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液中，室温下高速混合均匀，在波长为320-480 nm、光强为5mW/cm2的紫外光下照射5min，得到仿软骨细胞外基质可注射水凝胶。

[0064] 实施例2

[0065] 称取甲壳胺5g、马来酸酐25g，加入到1000mL二甲基乙酰胺中，室温下搅拌均匀，在90℃条件下反应48小时，反应结束后，加入无水丙酮至无沉淀析出为止，收集沉淀物，室温下真空干燥2天，得到摩尔取代度为0.5的马来酰化甲壳胺。

[0066] 称取甲基丙烯酸羟乙酯44.94g、丙烯酰氯34.38g、三乙胺38.44g，加入到419mL的甲苯中，搅拌均匀，在0～5℃条件下反应4小时，反应结束后，依次用水105mL、1 mol/L盐酸100 mL、1 mol/L氢氧化钠溶液100 mL洗涤，分液得上层亮黄色液体，在35℃条件下真空干燥24h，得到45.0g丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯。

[0067] 称取丝素蛋白纳米微粒5g、丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯1.4g，加入到1000mL二甲基乙酰胺中，在70℃条件下反应，反应时间为24小时，反应结束后，加入无水丙酮至无沉淀析出为止，收集沉淀物，室温下真空干燥2天，得到摩尔取代度为0.02的甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒。

[0068] 称取马来酰化甲壳胺10g、甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒3.0g、成纤维生长因子0.005g、1-羟基环己基苯基甲酮0.1g，加入到86.895g pH为7.4的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液
2
中，室温下高速混合均匀，在波长为320-480 nm、光强为100mW/cm的紫外光下照射1min，得到仿软骨细胞外基质可注射水凝胶。

[0069] 实施例3

[0070] 称取甲壳胺5g、马来酸酐2.5g，加入到500mL二甲基亚砜中，室温下搅拌均匀，在70℃条件下反应24小时，反应结束后，加入无水丙酮至无沉淀析出为止，收集沉淀物，室温下真空干燥2天，得到摩尔取代度为0.2的马来酰化甲壳胺。

[0071] 称取甲基丙烯酸羟乙酯44.94g、丙烯酰氯34.38g、三乙胺38.44g，加入到419mL的甲苯中，搅拌均匀，在0～5℃条件下反应4小时，反应结束后，依次用水105mL、1 mol/L盐酸100 mL、1 mol/L氢氧化钠溶液100 mL洗涤，分液得上层亮黄色液体，在35℃条件下真空干燥24h，得到45.0g丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯。

[0072] 称取丝素蛋白纳米微粒5g、丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯0.7g，加入到500mL二甲基亚砜中，在50℃条件下反应，反应时间为18小时，反应结束后，加入无水丙酮至无沉淀析出为止，收集沉淀物，室温下真空干燥2天，得到摩尔取代度为0.1的甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒。

[0073] 称取马来酰化甲壳胺5g、甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒1g、骨形态发生蛋白0.002g、2,2-二甲氧基-苯基乙酮0.08g，加入到93.918g pH为7.2的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液中，室温下高速混合均匀，在波长为320-480 nm、光强为50mW/cm2的紫外光下照射2min，得到仿软骨细胞外基质可注射水凝胶。

[0074] 实施例4

[0075] 称取甲壳胺5g、马来酸酐2.5g，加入到500mL二甲基亚砜中，室温下搅拌均匀，在70℃条件下反应24小时，反应结束后，加入无水丙酮至无沉淀析出为止，收集沉淀物，室温下真空干燥2天，得到摩尔取代度为0.2的马来酰化甲壳胺。

[0076] 称取甲基丙烯酸羟乙酯44.94g、丙烯酰氯34.38g、三乙胺38.44g，加入到419mL的甲苯中，搅拌均匀，在0～5℃条件下反应4小时，反应结束后，依次用水105mL、1 mol/L盐酸100 mL、1 mol/L氢氧化钠溶液100 mL洗涤，分液得上层亮黄色液体，在35℃条件下真空干燥24h，得到45.0g丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯。

[0077] 称取丝素蛋白纳米微粒5g、丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯0.7g，加入到500mL二甲基亚砜中，在50℃条件下反应，反应时间为18小时，反应结束后，加入无水丙酮至无沉淀析出为止，收集沉淀物，室温下真空干燥2天，得到摩尔取代度为0.1的甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒。

[0078] 称取马来酰化甲壳胺2g、甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒0.1g、胰岛素生长因子0.01g、2,2-二甲氧基-苯基乙酮0.05g，加入到97.84g pH为7.2的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液中，室温下高速混合均匀，在波长为320-480 nm、光强为50mW/cm2的紫外光下照射2min，得到仿软骨细胞外基质可注射水凝胶。

[0079] 实施例5

[0080] 称取甲壳胺5g、马来酸酐2.5g，加入到500mL二甲基亚砜中，室温下搅拌均匀，在70℃条件下反应24小时，反应结束后，加入无水丙酮至无沉淀析出为止，收集沉淀物，室温下真空干燥2天，得到摩尔取代度为0.2的马来酰化甲壳胺。

[0081] 称取甲基丙烯酸羟乙酯44.94g、丙烯酰氯34.38g、三乙胺38.44g，加入到419mL的甲苯中，搅拌均匀，在0～5℃条件下反应4小时，反应结束后，依次用水105mL、1 mol/L盐酸100 mL、1 mol/L氢氧化钠溶液100 mL洗涤，分液得上层亮黄色液体，在35℃条件下真空干燥24h，得到45.0g丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯。

[0082] 称取丝素蛋白纳米微粒5g、丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯0.7g，加入到500mL二甲基亚砜中，在50℃条件下反应，反应时间为18小时，反应结束后，加入无水丙酮至无沉淀析出为止，收集沉淀物，室温下真空干燥2天，得到摩尔取代度为0.1的甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒。

[0083] 称取马来酰化甲壳胺2g、甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒0.1g、2,2-二甲氧基-苯基乙酮0.05g，加入到97.85g pH为7.2的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液中，室温下高速混合均匀，在波长为320-480 nm、光强为50mW/cm2的紫外光下照射2min，得到仿软骨细胞外基质可注射水凝胶。

[0084] 实施例6

[0085] 称取甲壳胺5g、马来酸酐2.5g，加入到500mL二甲基亚砜中，室温下搅拌均匀，在70℃条件下反应24小时，反应结束后，加入无水丙酮至无沉淀析出为止，收集沉淀物，室温下真空干燥2天，得到摩尔取代度为0.2的马来酰化甲壳胺。

[0086] 称取甲基丙烯酸羟乙酯44.94g、丙烯酰氯34.38g、三乙胺38.44g，加入到419mL的甲苯中，搅拌均匀，在0～5℃条件下反应4小时，反应结束后，依次用水105mL、1 mol/L盐酸100 mL、1 mol/L氢氧化钠溶液100 mL洗涤，分液得上层亮黄色液体，在35℃条件下真空干燥24h，得到45.0g丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯。

[0087] 称取丝素蛋白纳米微粒5g、丙烯酰基氧乙基甲基丙烯酸酯0.7g，加入到500mL二甲基亚砜中，在50℃条件下反应，反应时间为18小时，反应结束后，加入无水丙酮至无沉淀析出为止，收集沉淀物，室温下真空干燥2天，得到摩尔取代度为0.1的甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒。

[0088] 称取马来酰化甲壳胺10g、甲基丙烯酰化丝素蛋白纳米微粒3.0g、胰岛素生长因子0.01g、2,2-二甲氧基-苯基乙酮0.1g，加入到86.89g pH为7.2的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液中，室温下高速混合均匀，在波长为320-480 nm、光强为50mW/cm2的紫外光下照射2min，得到仿软骨细胞外基质可注射水凝胶。