对Bt毒素具有杀虫增效作用的小菜蛾钙粘蛋白基因蛋白片段PxCAD1及应用

摘要

一种对Bt毒素具有杀虫增效作用的小菜蛾钙粘蛋白基因蛋白片段PxCAD1及应用，该蛋白片段PxCAD1的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码该蛋白的基因PxCAD0的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因片段为从小菜蛾(Plutella xylostella)中克隆的钙粘蛋白基因片段，通过原核表达及室内毒力测定发现本发明的基因PxCAD0原核表达后的PxCAD1蛋白，可显著提高Cry1Ac杀虫晶体蛋白对小菜蛾的杀虫活性，并可克服或延缓小菜蛾等鳞翅目害虫对Bt制剂或Bt转基因植物的抗性，在鳞翅目害虫的防治方面具有极为广泛的应用价值。

权利要求

1.一种对Bt毒素具有杀虫增效作用的小菜蛾钙粘蛋白基因蛋白片段PxCAD1，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.编码权利要求1所述蛋白片段PxCAD1的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.含有权利要求2所述基因的载体。

4.权利要求2所述基因或权利要求3所述载体在制备转基因植物中的应用。

5.权利要求1所述蛋白片段PxCAD1、权利要求2所述基因或权利要求3所述载体在提高杀虫晶体蛋白Cry1Ac对小菜蛾的杀虫活性中的应用。

6.权利要求1所述蛋白片段PxCAD1、权利要求2所述基因或权利要求3所述载体在制备Bt杀虫剂中的应用。

说明书

对Bt毒素具有杀虫增效作用的小菜蛾钙粘蛋白基因蛋白

片段PxCAD1及应用

技术领域

[0001] 本发明属农业微生物学应用技术领域，具体涉及一种具有杀虫增效作用的小菜蛾钙粘蛋白基因片段的克隆、表达及其编码的多肽片段在Bt杀虫剂中的应用。

背景技术

[0002] 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)，存在于土壤中，是能够形成芽孢的革兰氏阳性细菌。苏云金芽孢杆菌在芽孢形成过程中，能够产生杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal proteins，ICPs，又称δ-内毒素)，因其对害虫高效、对非目标动物安全、对环境友好而在世界范围内得到广泛应用。Bt毒素目前已成为世界范围内应用最广和产量最大的微生物杀虫剂，占微生物杀虫剂总产量的95％以上。编码Bt杀虫蛋白的基因也被转入到多种重要的粮棉作物中，至2009年底，全世界种植的转Bt基因农作物面积已达13400万公顷，在减少害虫危害、增加作物产量、减少化学农药对环境的污染等方面发挥了重要作用。

[0003] Bt产生的杀虫晶体蛋白中，占主要的是Cry和Cyt两种毒素蛋白。这两种毒素蛋白都属于同一类孔道毒素蛋白(pore-forming toxins,PFT)。Bt毒素对昆虫的作用机理尚不完全明确，3D-Cry类毒素的作用机制被普遍接受是孔道形成和信号传导两种假说。有研究表明，几丁质酶、Cyt蛋白、营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal proteins，VIPs)、辅助蛋白(Accessary proteins)P19、P20、P21和Zwittermicin A等均可增强Bt毒素的杀虫作用。近年来，也发现钙粘蛋白片段(Cadherin)、氨肽酶氮(Aminopeptidase N)及碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)等也可增强Cry毒素的杀虫活性。钙粘蛋白属依赖于钙离子的跨膜蛋白家族中的一类，在多细胞间起连接和保持细胞完整性的作 用，还在细胞增殖、分化过程中起连接蛋白作用，并能调节胞外结构域与胞质结构域的信号转导途径。它是Bt Cry毒素的初级受体，介导Bt Cry毒素毒杀害虫的过程。目前，在烟草天蛾(Manduca sexta)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、家蚕(Bombyx mori)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)、舞毒蛾(Lymantria dispar)、小菜蛾(Plutella xylostella)、二化螟(Chilo suppressalis)、美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、草地贪夜蛾(Spdoptera frugiperda)、亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)等鳞翅目昆虫，玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifeFa virgifera)、黄粉虫(Tenebrio molitor)、赤拟谷盗(Tribolium castaneurn)等鞘翅目昆虫，及冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)等双翅目昆虫中，钙粘蛋白氨基酸序列均已被确定。昆虫的钙粘蛋白从N端至C端依次是信号肽、由9～12个重复子(cadherin repeats，CR)组成的重复区、近膜区(membrane proximal extracellular domain，MPED)、跨膜区(transmembrane domain)和胞质区(intracellular domain)5个功能区域。通过抗性Cry1Ac与钙粘蛋白结合位点之间的紧密联系进行回交分析发现钙粘蛋白是基于开发以DNA为基础的监测苏云金芽孢杆菌抗性田间种群鳞翅类害虫的首选靶标。

[0004] 现已发现钙粘蛋白作为协同增效剂能显著增强Bt Cry1A对鳞翅目天蛾科的烟草天蛾、小地老虎、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)和玉米夜蛾(Helicoverpa zea)的毒性。目前，已报道烟草天蛾、烟芽夜蛾和甜菜夜蛾有一个小的毒素结合片段，钙粘蛋白在Bt毒素反应过程中起着协同作用，且在烟草天蛾中不管片段的大小，钙粘蛋白在不同水平上都影响着毒素的增强。Sabino等(2009)分析了存在于不同钙粘蛋白片段的体外低聚物的形成，还分析了存在于烟草天蛾幼虫不同钙粘蛋白片段中Cry1Ac、Cry1Ab毒素的杀虫活性和突变体钙粘蛋白片段影响毒素的结合。数据显示，杀虫活性的增强是由于CR12、Cry1A毒素与低聚 物的形成。除此之外，Sabino等还指出钙粘蛋白片段CR7和CR11增强了Cry1Ac、Cry1Ab毒素对烟草天蛾幼虫的杀虫活性，但是效率不如CR12片段。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于针对鳞翅目等昆虫对Bt抗性强的现状，提供一种对Bt毒素具有杀虫增效作用的小菜蛾钙粘蛋白基因蛋白片段PxCAD1及应用。本发明从小菜蛾体内发现了一种新型的增效因子钙粘蛋白片段PxCAD1，通过原核表达与毒力测定，表明该多肽片段能显著提高Bt晶体蛋白的杀虫活性。本发明包括一个具有杀虫增效作用的小菜蛾钙粘蛋白基因片段的纯化、克隆、表达及其编码的多肽片段在Bt杀虫剂中的应用。

[0006] 为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种对Bt毒素具有杀虫增效作用的小菜蛾钙粘蛋白基因蛋白片段PxCAD1，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

[0007] 本发明同时提供一种编码上述蛋白的基因PxCAD0，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

[0008] 本发明从小菜蛾(Plutella xylostella)中克隆了一个新的钙粘蛋白基因片段(命名为PxCAD0)。经过测序发现该PxCAD0由735个碱基组成，其序列如SEQ ID No.1所示，序列分析发现本发明的PxCAD0编码了一个由245个氨基酸残基组成的多肽片段PxCAD1，该多肽具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。该PxCAD1片段的分子量大小约为55.1千道尔顿(kDa)。通过原核表达及室内毒力测定，本发明的基因PxCAD0原核表达后的PxCAD1蛋白，可显著提高Cry1Ac杀虫晶体蛋白对小菜蛾的杀虫活性。

[0009] 本发明的小菜蛾体内的新的增效蛋白基因可用于转化微生物等，使之表达出具有增效作用的多肽PxCAD1，从而可显著提高杀虫晶体蛋白的杀虫活性，并可克服或延缓小菜蛾等鳞翅目害虫对Bt制剂或Bt转基因植物的抗性，在鳞翅目害虫的防治方面具有极为广泛的应用价值。

附图说明

[0010] 图1是本发明实施例中PCR的琼脂糖凝胶电泳图。

[0011] 其中，M:100bp plus II DNA Ladder分子量标准；1：钙粘蛋白基因片段PxCAD0的PCR扩增产物。

[0012] 图2是本发明实施例构建的克隆载体PxCAD-T1的物理图谱。

[0013] 图3是本发明实施例中超量表达载体PxCAD-6p的构建图及其物理图谱。

[0014] 图4是本发明克隆的钙粘蛋白基因片段PxCAD1的原核超量表达产物经纯化后的SDSPage电泳图。

[0015] 其中，M：10-200KD的未预染蛋白标准；1、2：纯化后的洗脱后上清，包含PxCAD1可溶性蛋白。

[0016] 图5是本发明实施例中增效蛋白PxCAD1与杀虫晶体蛋白配比后生物测定结果分析图。其中横坐标为不同的处理，纵坐标为死亡率；图中的不同字母代表在0.01水平上差异显著。

具体实施方式

[0017] 以下叙述是根据本发明实施方案的实施例，对本发明仅具说明作用，而无限制作用。有关DNA的标准操作方法和所使用的药品均参考《分子克隆实验指南》所描述的内容(参见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京)。本发明中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规技术。

[0018] 实施例1小菜蛾钙粘蛋白基因片段PxCAD0的克隆

[0019] 本发明以小菜蛾幼虫作为钙粘蛋白基因片段PxCAD0的来源。

[0020] 1、小菜蛾中肠RNA的提取

[0021] 小菜蛾中肠RNA的提取采用的是Trizol法。整个操作过程在无菌环境下进行。首先准备好实验器材,其中玻璃器皿180℃灭菌1h或用0.1％DEPC浸泡过夜后用无菌水冲洗干净再灭菌，配试剂所用的水用0.1％DEPC处理，然后高温高压 灭菌。塑料耗材必须灭菌无酶。

[0022] 将小菜蛾用天然菜叶培养至2-3龄，取50头左右新鲜活虫，置于生理盐水中浸泡清洗，取其中肠。用镊子将所有中肠转移至预冷的研磨器中，加入适量Trizol，然后在冰上研磨成匀浆。涡旋混匀后室温静置5min，12000×g 4℃，离心5min，然后将上清液转移至新的1.5mlEP管中。加入1/5Trizol(TaKaRa公司产品)体积量预冷的氯仿，震荡混匀，室温下静置5min，12000×g 4℃，离心15min，将上清液转移至新的EP管中，注意不要吸入杂质。在上清液中加入等量体积预冷的异丙醇于室温静置10min，12000×g 4℃，离心10min。将上清弃之，向沉淀中加入与Trizol等体积预冷的75％的乙醇，涡旋混匀清洗沉淀，12000×g4℃，离心5min。弃上清保留沉淀，让其空气自然干燥或真空干燥数分钟。加入适量的DEPC水溶解沉淀，用枪头反复吸打混匀。

[0023] 2、反转录PCR扩增获得钙粘蛋白基因片段PxCAD0

[0024] 合成cDNA采用的是TaKaRa公司的反转录试剂盒，按照说明书的方法加入1-5μg模板RNA、1μl Oligo dT Primer(50μM)、1μl dNTP Mixture(10mM each)，加RNase free dH2O补足至10μl。吸打混匀后置于65℃温育5min，立即置于冰上冷却。再在该体系中加入4μl 5×PrimeSctipt II Buffer、0.5μlRNase Inhibitor(40U/μl)、1μl PrimeSctipt II RTase(200U/μl)，加RNase free dH2O补足至20μl。温和的混匀，45℃温育45min，最后70℃处理15min，迅速置于冰上，存于-20℃备用。

[0025] 根据Donghai Peng等报道棉铃虫氨基酸毒素结合区HaCad1第1217-1461位氨基酸能增强Cry毒素活性。在NCBI上下载其棉铃虫(AF519180)及小菜蛾(EF541176)的氨基酸序列，通过DNAMAN软件比对，找出对应的核苷酸序列，并以此为依据设计引物Cad-1F：ACGATCAGGGCCACCGACG(SEQ ID No.3)；Cad-1R：GTACACCTTCACCTCCGCAC(SEQ ID No.4)进行PCR扩增。以反转录成的cDNA1μl为模板，加入2.5μl(含镁离子)10×Taq Buffer、正反向引物各0.5μl (10μmol/L)、0.5μldNTP Mixture(10mmol/L)、0.5μl TIANGEN Taq(2.5U/ul)，加Nase-free水补至25μl体系。所用的PCR反应参数和程序：94℃，5min,1个循环；
94℃，1min,62.2℃，1min，72℃，lmin，30个循环；72℃，10min，1个循环。结果如图1所示，PCR扩增得到了一条大小为735bp的特异性DNA片段，与预期的目标片段735bp大小相符。

[0026] 3、PxCAD0片段的序列测定

[0027] 得到的PCR产物通过胶回收试剂盒(购自TIANGEN公司)纯化回收后，T/A克隆连接至T载体pEASY-T1上(购自全式金公司)，得到的该重组质粒PxCAD-T1(见图2)转化大肠杆菌E.coli DH5α中，涂布含有氨苄青霉素抗性的平板。将抗性平板于37℃培养12-16h，筛选转化子。取lml LB培养基过夜培养的阳性转化子测序(上海生工公司)。测序结果见SEQ ID No.1所示，为小菜蛾钙粘蛋白基因片段的核苷酸序列，申请人将该基因命名为PxCAD0。该段序列编码由245个氨基酸组成的多肽片段，其GST融合蛋白分子量约为
55.1kDa，申请人将其命名为PxCAD1，序列如SEQ ID No.2所示。实施例2小菜蛾钙粘蛋白基因片段PxCAD1的超量表达与纯化

[0028] 1.小菜蛾钙粘蛋白片段PxCAD0原核超量表达载体的构建

[0029] 将实施例1中获得的含有PxCAD0的重组质粒PxCAD-T1经EcoRI和SalI双酶切，同时将pGEX-6p-l(购自Novagen公司)进行相同的双酶切。双酶切后的产物分别进行1％的琼脂糖凝胶分离后，切下目标片段并通过DNA凝胶回收试剂盒(购自TIANGEN生物技术公司)纯化回收。通过T4连接酶(购自TaKaRa公司)将两者连接，获得含有PxCAD0的重组表达质粒PxCAD-6p(见图3)。将该重组表达质粒转化大肠杆菌E.coli Trans-T1(购自全式金公司)，挑取生长的单菌落，提取质粒进行EcoRI和SalI双酶切验证并测序，结果表明PxCAD0片段被成功插入pGEX-6p-1表达载体中。

[0030] 2.小菜蛾钙粘蛋白片段PxCAD0的原核超量表达

[0031] 为了得到尽可能多的PxCAD1多肽片段，申请人将上述携带其编码序列的重组表达质粒PxCAD-6p转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLyss(购自全式金公司)，得到重组菌(命名为PGCAD)。将该重组菌株接种于5ml的LB液体培养基中(加入终浓度为100μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素)，过夜活化。按照1:100的体积比转接至100ml LB液体培养基中，于37℃摇床培养至OD600为0.4-0.6左右，加入终浓度为0.2mmol/L的异丙基-B-D硫代半乳糖苷(即IPTG，购自鹏程生物公司)于37℃诱导培养5小时。然后8000rpm离心5min收集菌体，用灭菌去离子水洗涤菌体三遍，重新加入5-8倍灭菌去离子水稀释菌体。以4:1(体积比)加入5×SDS Loading Buffer混匀，沸水浴处理10min，12000rpm离心3min，取上清液进行SDS-PAGE电泳(SDS-PAGE电泳的操作步骤参见蛋白质技术手册/王家政，范明主编，北京，科学出版社，2000，ISBN7-03-008329-6)。结果，本实施例的重组菌株PGCAD表达了一条特异性蛋白条带。与蛋白分子量标准对比，估算该特异性蛋白其分子量为55kDa，与预计的融合增效蛋白GST-PxCAD1(55.1kDa)分子量大小吻合。表明本发明的增效蛋白PxCAD1在大肠杆菌中得到了成功的表达。

[0032] 3.增效蛋白PxCAD1的纯化

[0033] 将上述100mL重组菌PGCAD的5h诱导培养物经过8000rpm离心10min收集菌体，利用超声波(功率200W、破碎5秒、间歇5秒)将细胞破碎后12000rpm离心10min取上清。然后将上清液过GST亲和层析柱(购自Merck Millipore公司)提纯该特异蛋白GST-PxCAD1。具体的纯化步骤按照试剂盒ACK5010GS(购自Merck Millipore公司)操作说明书进行。对最终的纯化产物进行SDS-PAGE电泳检测，提纯的蛋白(如图4泳道1、2所示)与PGCAD中表达的特异性蛋白条带大小一致，表明本发明提纯的特异蛋白即为融合的GST-PxCAD1。

[0034] 实施例3 小菜蛾钙粘蛋白重组蛋白PxCAD1对Bt毒素CrylAc的增效活性生物学试验

[0035] 1、杀虫晶体蛋白CrylAc

[0036] 本发明中所用的纯化的CrylAc购自中国农业科学院植物保护所。

[0037] 2、小菜蛾钙粘蛋白重组蛋白PxCAD1对杀虫晶体蛋白CrylAc杀虫增效活性的生物学测定

[0038] 以小菜蛾3龄幼虫为对象测定本发明制备的增效蛋白PxCAD1对杀虫晶体蛋白CrylAc杀虫的增效活性。具体的生物测定程序按照参考文献(参见文献:Yang ZX,Wen LZ,Wu QJ,et al.Effects of injecting cadherin gene dsRNA on growth and development in diamondback moth Plutella xylostella(Lep.:Plutellidae)[J].Journal of Applied Entomology,2009,133(2):75-81.)进行。每个样品的生物测定重复3次，并计算死亡率。

[0039] 为了检测增效蛋白PxCAD1对CrylAc的杀虫增效活性，本发明配制终浓度为1.87μg/mL的杀虫晶体蛋白CrylAc，之后将浓度为556μg/ml和浓度为517.33μg/ml的二小菜蛾钙粘蛋白片段PxCAD1溶液分别与CrylAc混合，采用叶片浸渍法进行生测，并设最高剂量的仅含空白载体pGEX-6p-l(282.58μg/mL)为对照。结果如图5所示，加入1μg/mL的CrylAc引起小菜蛾幼虫的死亡率为46.67％，而当加入了556μg/ml与517.33μg/ml的PxCAD1溶液以后，其致死率分别上升为85.56％和82.22％。对照组中，最高剂量的含有pGEX-6p-l的PxCAD1溶液(556μg/mL)，并无明显的受试昆虫的死亡，这说明PxCAD1本身对小菜蛾幼虫并无毒杀作用。以上结果表明PxCAD1能显著提高杀虫晶体蛋白CrylAc对小菜蛾幼虫的杀虫活性，且活性的提高是由于PxCAD1片段对CrylAc的增效特性，其本身并无毒杀作用。

[0040] 本发明制备的新型增效因子——小菜蛾钙粘蛋白片段PxCAD1为提高Bt毒素的杀虫活性及害虫抗性的综合治理等方面提供了新的有效手段，且本发明的增效因子也可用于害虫抗性治理的其他方面。