低分子肝素-甘草次酸聚合物及其合成方法与应用

摘要

本发明涉及低分子肝素-甘草次酸聚合物及其合成方法与应用，先合成低分子肝素-己二酸二酰肼，再合成甘草次酸丁二酸酯，制备甘草次酸丁二酸酯活性酯溶液，最后合成低分子肝素-甘草次酸聚合物。以肝素为水溶性骨架材料，用甘草次酸通过丁二酸酐和己二酸二酰肼作为连接臂对水溶性骨架进行疏水改造制成甘草次酸介导的具有靶向能力的纳米载体材料。本发明的肝素-甘草次酸聚合物，具有良好的生物相容性、生物可降解性和无免疫原性。制备的肝靶向载药纳米胶束包封率和载药量高，具有优良的缓释性，能增强药物治疗效果，并降低非特异性毒副作用，具有良好的应有前景。

权利要求

1.低分子肝素-甘草次酸聚合物的合成方法，其特征是，包括步骤如下：

(1)低分子肝素-己二酸二酰肼的合成：将低分子肝素溶解于蒸馏水中，向其中依次加入己二酸二酰肼、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三氮唑，用氢氧化钠调节反应体系pH＝6-7，室温反应20-30小时，得低分子肝素-己二酸二酰肼；

(2)甘草次酸丁二酸酯的合成：将甘草次酸溶于无水四氢呋喃中，加入丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶，避光室温下搅拌20-30小时后，旋蒸除去有机溶剂，然后加入乙酸乙酯溶解，洗涤、纯化得到甘草次酸丁二酸酯；

(3)甘草次酸丁二酸酯活性酯溶液的制备：将甘草次酸丁二酸酯溶解于N,N二甲基甲酰胺中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，于室温搅拌3-5小时后，加入有机碱，得到甘草次酸丁二酸酯活性酯溶液；

(4)低分子肝素-甘草次酸聚合物的合成：将步骤(1)中所得的低分子肝素-己二酸二酰肼溶于蒸馏水中，搅拌使其充分溶胀、溶解，然后加入N,N二甲基甲酰胺稀释，备用；将步骤(3)中所得甘草次酸丁二酸酯活性酯溶液在强烈搅拌下滴入上述低分子肝素-己二酸二酰肼溶液中，室温搅拌反应40-50小时，得到反应物溶液，反应溶液纯化、冷冻干燥即得低分子肝素-甘草次酸聚合物。

2.根据权利要求1所述的低分子肝素-甘草次酸聚合物的合成方法，其特征是，步骤(1)中所述低分子肝素、蒸馏水、己二酸二酰肼、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、

1-羟基苯并三氮唑的质量比为0.5-0.6：100：6-7：0.9-1：0.6-0.7。

3.根据权利要求1所述的低分子肝素-甘草次酸聚合物的合成方法，其特征是，步骤(1)中所述低分子肝素的分子量为3kD～6kD。

4.根据权利要求1所述的低分子肝素-甘草次酸聚合物的合成方法，其特征是，步骤(2)中甘草次酸、丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1：4：0.1；无水四氢呋喃的用量为每克甘草次酸加25毫升；无水四氢呋喃与乙酸乙酯的体积比为1:2。

5.根据权利要求1所述的低分子肝素-甘草次酸聚合物的合成方法，其特征是，步骤(3)中甘草次酸丁二酸酯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺、有机碱的摩尔比为1:2:2:2。

6.根据权利要求1所述的低分子肝素-甘草次酸聚合物的合成方法，其特征是，所述有 机碱为三乙胺、N,N,N',N'-四甲基乙二胺或N，N-二异丙基乙胺。

7.根据权利要求1所述的低分子肝素-甘草次酸聚合物的合成方法，其特征是，步骤(4)中低分子肝素-己二酸二酰肼与甘草次酸丁二酸酯活性酯的质量比为1：0.2-0.6，蒸馏水与N,N二甲基甲酰胺的体积比为1:3，每克低分子肝素-己二酸二酰肼加100ml蒸馏水。

8.权利要求1-7任一项所述的方法制得的低分子肝素-甘草次酸聚合物。

9.权利要求8所述的低分子肝素-甘草次酸聚合物作为难溶性抗肿瘤药物的载体材料在受体介导的肝靶向载药纳米自组装胶束制剂制备中的应用。

10.权利要求9所述的应用，其特征是，方法为：将低分子肝素-甘草次酸聚合物，超声分散去离子水中；将抗肿瘤药物，或抗肿瘤药物和抗肿瘤药物增敏剂溶解于有机溶剂中，在强烈搅拌情况下缓慢滴加至上述低分子肝素-甘草次酸聚合物水溶液中，室温继续强烈搅拌，用探头式超声处理，超声完毕后将溶液转移至透析袋中对水透析，然后将所得溶液离心，以除去未包封的药物，上清液接着过0.8μm滤膜，即得抗肿瘤药物的纳米胶束制剂。

说明书

低分子肝素-甘草次酸聚合物及其合成方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种纳米聚合物自组装胶束材料(低分子肝素-甘草次酸聚合物)的合成，尤其是指低分子肝素-甘草次酸聚合物的合成及以该聚合物作为生物材料制备抗肿瘤药物纳米胶束制剂的应用方法。本发明属于生物医用材料和纳米药物制剂领域。

背景技术

[0002] 几十年来，恶性肿瘤的发生率和死亡率呈现明显上升趋势，成为严重威胁人类生命健康的多发病之一。有研究预测至2050年仅亚太地区的恶性肿瘤新发病例和死亡人数便将达到730万和550万，是2000年的2倍以上。而其中肝癌被称为“癌中之王”，其治愈率低，死亡率高。而我国是世界上肝癌的高发区，近20年来肝癌死亡率增加了41.7％，全世界每年约有125万人死于肝癌，其中近一半发生在我国。肝癌早期症状较为隐匿不易察觉，但一旦表现出明显症状，其恶性程度高，发展迅速，若治疗不及时或治疗方案选择不当，平均生存期仅为半年。目前，针对肝癌的临床治疗，为了弥补手术疗法的不彻底性和易诱发转移的缺点，化学疗法作为辅助治疗手段依然占据着非常重要的地位。然而，传统的基于细胞毒性的化学治疗药物在通过全身给药方式获得治疗效果的同时对人体正常的脏器也存在着较强的细胞毒性，继而引发严重的毒副作用。例如紫杉醇是从红豆杉属植物中提取分离得到的一种天然抗癌活性成分。作为一种高效的细胞毒类抗癌药，其临床制剂泰素注射液曾长时间作为乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌以及急性白血病的一线药物使用。但是其溶媒聚氧乙烯蓖麻油易产生诸如神经毒性、心脏毒性、肾毒性、过敏反应等毒副作用，加之紫杉醇的全身分布会导致严重的心脏毒性和肾毒性，因此如何在术后的肝癌患者身上运用温和的、可耐受的化学治疗手段以降低化学疗法带来的潜在危险是需要医药领域研究人员需要亟需解决的问题。

[0003] 纳米给药系统是近年来抗肿瘤药物剂型开发和递送领域的研究热点。它通过纳米载体材料将化学药物包裹或分散于纳米级的基质当中，有效地改善难溶性药物的溶解性，延长药物在血液中的循环时间，改变药物的体内分布，提高药物生物利用度，并且具有一定的靶向性。这些优点可以有效降低化疗过程中的非特异性不良反应，提高治疗效能，尤为适用于肿瘤的治疗。其中，聚合物胶束系统凭借其低毒性和良好的稳定性在难溶性药物的增溶和递送领域备受国内外学者关注。它是由两亲性的高分子聚合物在水中通过疏水基团的分子内和分子间作用力自发形成的一种具有典型核壳结构的自组装结构。这种胶束系统由紧密的疏水内核和亲水性的外壳组成，因其内核可以通过疏水作用力等包载一些难溶性药物，因此该系统被认为是一种有前景的难溶性药物的递送载体。然而，这些纳米给药系统并不具备从网状内皮系统逃逸的能力，在体内很容易被单核巨噬细胞吞噬而清除。另一方面，这种依靠制剂纳米级粒径实现的被动靶向依然存在肿瘤部位自聚物摄取不充分、甚至引发多药耐药从而降低疗效的现象。为了完成肿瘤纳米系统的靶向给药，利用体内的特异性分子识别机制，在纳米载体表面偶联靶标分子已成为一种较为成熟的靶向策略。

[0004] 早在20世纪90年代初，Negishi即证实了大鼠肝细胞膜组分中含有大量的甘草次酸结合位点，且呈现高度特异性。随后以甘草次酸为靶标分子修饰的载体材料被国内外诸多学者所报道，比如，以甘草次酸作为疏水基团构建聚合物胶束系统的甘草次酸修饰的透明质酸聚合物和甘草次酸修饰硫酸酯壳聚糖聚合物；通过水溶性PEG长链将甘草次酸作为靶向分子分布在聚合物表面的甘草次酸修饰的PEG–b-poly(γ-benzyl L-glutamate)聚合物胶束和甘草次酸修饰的壳聚糖/PEG纳米粒等。结果显示，该类载体材料具有显著的肝靶向能力。因此以甘草次酸作为肝靶向介导基团可以研究开发一类新型的甘草次酸介导的肝靶向纳米给药系统。中国专利CN101254308A公开了一种甘草次酸-聚乙二醇/壳聚糖肝靶向复合给药系统及制备方法，并说明该靶向给药系统对肝癌细胞有很强的结合能力；中国专利CN101642573A公开了一种壳聚糖基肝靶向纳米粒子给药系统及其制备方法，将甘草次酸作为靶标分子的同时作为疏水基团偶联在硫酸酯壳聚糖或羧甲基壳聚糖上，从而构建形成肝靶向纳米给药系统；中国专利CN102336802A公开了甘草次酸修饰脂质、肝靶向脂质体、胶束及复合物和制法，将甘草次酸与磷脂或胆固醇在缩合剂条件下制得甘草次酸修饰的脂质，并以其为基本材料制备了甘草次酸介导的肝靶向脂质体和胶束载体。由此可见，甘草次酸作为靶向基团运用于肝靶向给药系统构建已经受到广大学者关注。

[0005] 肝素主要是从牛肺或猪小肠粘膜中提取出来的一种动物粘多糖硫酸酯，因最初在肝脏中发现而得名。肝素主要是由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸等结构单元组成的水溶性长链大分子，平均分子量在12000Da左右。肝素因其与抗凝血酶独特的结合能力早在1939年便已作为血液抗凝剂用于临床研究。不过，肝素的临床应用也易引发诸如出血、血小板减少症的出现，从而限制了其在医药领域的进一步应用。低分子肝素是普通肝素的降解产物。与普通肝素相比，低分子肝素在具有相似或者更优的抗凝血、抗炎、抗血管增生以及抗肿瘤特性的同时，其可能的不良反应显著降低。因此，低分子肝素用于相关疾病治疗更加安全可靠。低分子肝素因分子量小，骨架刚性降低而具有更加优良的水溶性。此外，肝素骨架中含有大量活泼的可修饰的游离基团，能够通过化学修饰赋予其新的性能。因此肝素在除用作抗凝活性成分之外，以水溶性低分子肝素为基本骨架构架纳米给药系统吸引了众多药物制剂研究工作者的关注。

[0006] 近年来，对低分子肝素骨架进行疏水改性并在水性介质中构建聚合物胶束吸引了众多医药领域专家学者的研究兴趣。通过化学手段将疏水性小分子引入肝素骨架中从而构建两亲性聚合物并诱使其在水性介质中发生自组装聚合成为具有疏水内核的核壳结构胶束。但是通常情况下这些纳米胶束系统并不具备从网状内皮系统逃逸的能力，在体内很容易被单核巨噬细胞吞噬而清除。另一方面，这种依靠制剂纳米级粒径实现的被动靶向依然存在肿瘤部位自聚物摄取不充分、甚至引发多药耐药从而降低疗效的现象。为了完成肿瘤纳米系统的靶向给药，利用体内的特异性分子识别机制，在纳米载体构建过程中偶联靶标分子已成为一种较为成熟的靶向策略。

[0007] 综上所述，以低分子肝素作为水溶性骨架材料构建聚合物胶束，在低分子肝素分子上引入甘草次酸进行疏水改性，使其具备在水性溶液中自组装聚集的性能并利用其与肝癌实质细胞的特异性结合能力实现纳米胶束的肝靶向药物递送。该设计方法在增加药物溶解度，改变药物在体内的分布，延长药物在体内滞留时间的同时，并发挥甘草次酸修饰材料的靶向性能，其设计方法在肿瘤诊断和治疗中具有很大的研究开发前景。目前该设计尚未见相关报道。此外，运用抗癌药物增敏剂同一线抗肿瘤药物进行联合用药，逆转单一长期用药导致的多药耐药作用，增强抗肿瘤药物的治疗效果。

发明内容

[0008] 针对上述现有技术，本发明提供了一种低分子肝素-甘草次酸聚合物，并提供了其合成方法，以及其作为生物可降解性材料用于制备抗肿瘤药物肝靶向纳米制剂的应用。

[0009] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0010] 低分子肝素-甘草次酸聚合物的合成方法，包括步骤如下：

[0011] (1)低分子肝素-己二酸二酰肼的合成：将低分子肝素溶解于蒸馏水中，向其中依次加入己二酸二酰肼、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三氮唑，用氢氧化钠调节反应体系pH＝6-7，室温反应20-30小时，得低分子肝素-己二酸二酰肼；

[0012] (2)甘草次酸丁二酸酯的合成：将甘草次酸溶于无水四氢呋喃中，加入丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶，避光室温下搅拌20-30小时后，旋蒸除去有机溶剂，然后加入乙酸乙酯溶解，洗涤、纯化得到甘草次酸丁二酸酯；

[0013] (3)甘草次酸丁二酸酯活性酯溶液的制备：将甘草次酸丁二酸酯溶解于N,N二甲基甲酰胺中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，于室温搅拌3-5小时后，加入有机碱，得到甘草次酸丁二酸酯活性酯溶液；

[0014] (4)低分子肝素-甘草次酸聚合物的合成：将步骤(1)中所得的低分子肝素-己二酸二酰肼溶于蒸馏水中，搅拌使其充分溶胀、溶解，然后加入N,N二甲基甲酰胺稀释，备用；将步骤(3)中所得甘草次酸丁二酸酯活性酯溶液在强烈搅拌下滴入上述低分子肝素-己二酸二酰肼溶液中，室温搅拌反应40-50小时，得到反应物溶液，反应溶液纯化、冷冻干燥即得低分子肝素-甘草次酸聚合物。

[0015] 上述合成方法中，步骤(1)中所述低分子肝素、蒸馏水、己二酸二酰肼、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三氮唑的质量比为0.5-0.6：100：6-7：0.9-1：0.6-0.7。低分子肝素的分子量为3kD～6kD。低分子肝素-己二酸二酰肼的己二酸二酰肼取代度为43％。

[0016] 步骤(2)中甘草次酸、丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1：4：0.1；无水四氢呋喃的用量为每克甘草次酸加25毫升；无水四氢呋喃与乙酸乙酯的体积比为1:2。

[0017] 步骤(3)中甘草次酸丁二酸酯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺、有机碱的摩尔比为1:2:2:2。所述有机碱为三乙胺、N,N,N',N'-四甲基乙二胺或N，N-二异丙基乙胺。N,N二甲基甲酰胺的用量为每克甘草次酸丁二酸酯加70-300毫升。

[0018] 步骤(4)中低分子肝素-己二酸二酰肼与甘草次酸丁二酸酯活性酯的质量比为1：0.2-0.6。蒸馏水与N,N二甲基甲酰胺的体积比为1:3，每克低分子肝素-己二酸二酰肼加
100ml蒸馏水。甘草次酸的取代度范围为3％-10％(根据所需要的自组装体系的理化性质调整所需要的取代度)。

[0019] 上述方法制得的低分子肝素-甘草次酸聚合物。

[0020] 所述低分子肝素-甘草次酸聚合物作为难溶性抗肿瘤药物的载体材料在受体介导的肝靶向载药纳米自组装胶束制剂制备中的应用。具体应用时，制备方法为：将低分子肝素-甘草次酸聚合物，超声分散去离子水中；将抗肿瘤药物，或抗肿瘤药物和抗肿瘤药物增敏剂溶解于有机溶剂中，在强烈搅拌情况下缓慢滴加至上述低分子肝素-甘草次酸聚合物水溶液中，室温继续强烈搅拌，用探头式超声处理，超声完毕后将溶液转移至透析袋中对水透析，然后将所得溶液离心，以除去未包封的药物，上清液接着过0.8μm滤膜，即得抗肿瘤药物的纳米胶束制剂。

[0021] 优选制备方法如下：称取50mg低分子肝素-甘草次酸聚合物，超声分散于5mL去离子水中备用；另将5～40mg抗肿瘤药物，或抗肿瘤药物和抗肿瘤药物增敏剂溶解于1mL有机溶剂中，在强烈搅拌情况下缓慢滴加至上述低分子肝素-甘草次酸聚合物水溶液中，室温继续强烈搅拌4h后，用探头式超声在120W功率条件下处理三次，每次2min，温度4℃～8℃，脉冲开2s停4s，超声完毕后将溶液转移至透析袋中对水透析24小时，然后将所得溶液4000r/min离心20min，以除去未包封的药物。上清液接着过0.8μm滤膜，即得抗肿瘤药物的纳米胶束制剂，4℃保存或冻干获得载药纳米胶束的冻干粉。

[0022] 所述难溶性抗肿瘤药物为紫杉醇、阿霉素、多西紫杉醇等；所述抗肿瘤药物增敏剂为姜黄素、槲皮素等。

[0023] 所述有机溶剂为四氢呋喃，N,N二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。

[0024] 本发明的低分子肝素-甘草次酸聚合物，采用水溶性的低分子肝素作为基本骨架，对其进行疏水性靶向修饰，得到的两亲性聚合物可以在水性介质中进行自组装过程形成靶向纳米胶束，具有以下优点：

[0025] 1、本发明制备的载体材料低分子肝素-甘草次酸聚合物具有优良的生物相容性、可降解性和无免疫原性，而且制备工艺简单，条件温和，是一种优良肝靶向纳米药物载体。

[0026] 2、本发明制备的载药纳米胶束形态圆整，呈现均匀的球形，粒径较小，具有较高的包封率和载药量，并且稳定性好。

[0027] 3、本发明制备的纳米胶束在自组装构建过程中，作为疏水基团的甘草次酸在形成稳定内核的同时，赋予载体材料潜在的肝靶向特性，设计思路合理、操作易行。

[0028] 4、本发明制备的载药纳米胶束克服了难溶性药物水溶性差的缺陷，大大改善了难溶性抗肿瘤药物的溶解度，为其靶向治疗提供了一个理想新型载体。

[0029] 5、本发明制备的载药纳米胶束制剂同时将难溶性的抗肿瘤药物及其增敏剂包载于胶束制剂中，能够有效控制多药耐药的产生，降低给药剂量，提供药物治疗效果。

附图说明

[0030] 图1：载体材料低分子肝素-甘草次酸聚合物的核磁共振氢谱。

[0031] 图2：载紫杉醇的低分子肝素-甘草次酸纳米胶束的粒径分布图。

[0032] 图3：载紫杉醇的低分子肝素-甘草次酸纳米胶束的电镜照片。

[0033] 图4：载紫杉醇的低分子肝素-甘草次酸纳米胶束的Zeta电位图。

具体实施方式

[0034] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。以下实施例不用来限制本发明的范围。

[0035] 实施例1：低分子肝素-甘草次酸聚合物的合成

[0036] (1)低分子肝素-己二酸二酰肼的合成：称取0.5g低分子肝素溶解于100mL蒸馏水中，搅拌使其充分溶胀、溶解，然后依次向该溶液中加入6.53g己二酸二酰肼，0.96g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.68g 1-羟基苯并三氮唑，用氢氧化钠调节反应体系pH值为6.8，室温反应24小时，用蒸馏水透析三天，冷冻干燥得到中间产物低分子肝素-己二酸二酰肼。

[0037] (2)甘草次酸丁二酸酯的合成：称取200mg甘草次酸超声溶解于5mL无水四氢呋喃中，加入4倍摩尔量的丁二酸酐和0.1倍摩尔量的4-二甲氨基吡啶，避光室温下搅拌24小时后，旋蒸除去有机溶剂。然后加入10mL乙酸乙酯溶解，依次用1％的盐酸溶液和超纯水分别洗涤三次，无水硫酸钠干燥过夜后蒸去有机溶剂。产物通过硅胶柱层析方法(洗脱剂为乙醇：乙酸乙酯(11：3；v/v)纯化得到甘草次酸丁二酸酯。

[0038] (3)称取20mg甘草次酸丁二酸酯溶解于3mL N,N二甲基甲酰胺中，然后加入相当于甘草次酸丁二酸酯2倍摩尔量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和相当于甘草次酸丁二酸酯2倍摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺，于室温搅拌4小时后，加入相当于甘草次酸丁二酸酯2倍摩尔量的N,N,N',N'-四甲基乙二胺，得到甘草次酸丁二酸酯活性酯溶液。

[0039] (4)低分子肝素-甘草次酸聚合物的合成：称取100mg步骤(1)中所得的低分子肝素-己二酸二酰肼溶于10mL蒸馏水中，搅拌使其充分溶胀、溶解，然后加入3倍体积的N,N二甲基甲酰胺稀释，备用。将步骤(3)中所得甘草次酸丁二酸酯活性酯溶液在强烈搅拌下滴入上述低分子肝素-己二酸二酰肼溶液中，室温搅拌反应48小时，得到反应物溶液。反应溶液对甲醇与水的混合溶液(体积比4：1)中透析三天，以除去其中的游离甘草次酸丁二酸酯及副产物，然后对蒸馏水透析三天除去有机溶剂。冷冻干燥即得低分子肝素-甘草次酸聚合物。1H NMR定量分析得到甘草次酸的取代度为6.8％。

[0040] 低分子肝素(HEP)与所得的低分子肝素-己二酸二酰肼(HEP-ADH)以及低分子肝素-甘草次酸聚合物(HEP-GA)的1H NMR结构谱图见图1，相对于HEP，在HEP-ADH核磁氢谱中，位于1.0-1.6ppm，2.1-2.5ppm的新的特征峰归属于己二酸二酰肼枝接链的质子峰，这也证实了己二酸二酰肼已经成功偶联到了HEP骨架上。而对于HEP-GA，化学位移在0.5-1.4ppm，5.52ppm出现的新质子峰为甘草次酸骨架环质子上的特征质子峰。上述结果证明甘草次酸成功的通过己二酸二酰肼偶联在了低分子肝素上。

[0041] 实施例2：低分子肝素-甘草次酸聚合物的合成

[0042] (1)低分子肝素-己二酸二酰肼的合成：称取0.5g低分子肝素溶解于100mL蒸馏水中，搅拌使其充分溶胀、溶解，然后依次向该溶液中加入6.53g己二酸二酰肼，0.96g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.68g 1-羟基苯并三氮唑，用氢氧化钠调节反应体系pH值为6.8，室温反应24小时，用蒸馏水透析三天，冷冻干燥得到中间产物低分子肝素-己二酸二酰肼。

[0043] (2)甘草次酸丁二酸酯的合成：称取200mg甘草次酸超声溶解于5mL无水四氢呋喃中，加入4倍摩尔量的丁二酸酐和0.1倍摩尔量的4-二甲氨基吡啶，避光室温下搅拌24小时后，旋蒸除去有机溶剂。然后加入10mL乙酸乙酯溶解，依次用1％的盐酸溶液和超纯水分别洗涤三次，无水硫酸钠干燥过夜后蒸去有机溶剂。产物通过硅胶柱层析方法(洗脱剂为乙醇：乙酸乙酯(11：3；v/v)纯化得到甘草次酸丁二酸酯。

[0044] (3)称取30mg甘草次酸丁二酸酯溶解于3mL N,N二甲基甲酰胺中，然后加入相当于甘草次酸丁二酸酯2倍摩尔量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和相当于甘草次酸丁二酸酯2倍摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺，于室温搅拌4小时后，加入相当于甘草次酸丁二酸酯2倍摩尔量的N，N-二异丙基乙胺，得到甘草次酸丁二酸酯活性酯溶液。

[0045] (4)低分子肝素-甘草次酸聚合物的合成：称取100mg步骤(1)中所得的低分子肝素-己二酸二酰肼溶于10mL蒸馏水中，搅拌使其充分溶胀、溶解，然后加入3倍体积的N,N二甲基甲酰胺稀释，备用。将步骤(3)中所得甘草次酸丁二酸酯活性酯溶液在强烈搅拌下滴入上述低分子肝素-己二酸二酰肼溶液中，室温搅拌反应48小时，得到反应物溶液。反应溶液对甲醇与水的混合溶液(体积比4：1)中透析三天，以除去其中的游离甘草次酸丁二酸酯及副产物，然后对蒸馏水透析三天除去有机溶剂。冷冻干燥即得低分子肝素-甘草次酸聚合物。1H NMR定量分析得到甘草次酸的取代度为8.5％。

[0046] 实施例3：载紫杉醇的低分子肝素-甘草次酸聚合物纳米胶束制备

[0047] 将50mg低分子肝素-甘草次酸(实施例1制备)，超声分散于5mL去离子水中，备用；另称取20mg紫杉醇溶解于1mL四氢呋喃中，在强烈搅拌情况下缓慢滴加至上述低分子肝素-甘草次酸聚合物水溶液中，室温继续强烈搅拌4h后，用探头式超声在120W功率条件下处理三次，每次2min，温度保持在4℃～8℃，脉冲开2s停4s，超声完毕后将溶液转移至透析袋中对水透析24小时，然后将所得溶液4000r/min离心20min，以除去未包封的药物。上清液接着过0.8μm滤膜，即得载紫杉醇的纳米胶束制剂，冻干获得载紫杉醇纳米胶束的冻干粉。高效液相色谱法检测结果显示其载药量为20.6％，包封率为72.0％。

[0048] 将制备的载紫杉醇的纳米胶束溶液稀释适当倍数后，以Malvern Zetasizer Nano-ZS型激光电位粒度仪测定胶束的粒径和Zeta电位，所测得胶束粒子平均粒径为90.2nm，多系分散系数PI为0.23，Zeta电位值为-25.2mV，图2为载紫杉醇的低分子肝素-甘草次酸纳米胶束的粒径分布图。以H-7000型透射电子显微镜观察胶束表面形态，如图3所示，所制备的载药胶束形态圆整，大小均一，黏连较小。图4为该载药纳米胶束的Zeta电位图。

[0049] 实施例4：联合载紫杉醇、姜黄素的低分子肝素-甘草次酸聚合物纳米胶束制备[0050] 将50mg低分子肝素-甘草次酸聚合物(实施例1制备)，超声分散于5mL去离子水中，备用；另称取20mg紫杉醇和20mg姜黄素溶解于1mL四氢呋喃中，在强烈搅拌情况下缓慢滴加至上述低分子肝素-甘草次酸聚合物水溶液中，室温继续强烈搅拌4h后，用探头式超声在120W功率条件下处理三次，每次2min，温度保持在4℃～8℃，脉冲开2s停4s，超声完毕后将溶液转移至透析袋中对水透析24小时，然后将所得溶液4000r/min离心20min，以除去未包封的药物。上清液接着过0.8μm滤膜，即得共载紫杉醇和姜黄素的纳米胶束制剂，冻干获得载紫杉醇纳米胶束的冻干粉。高效液相色谱法检测结果显示紫杉醇的载药量和包封率分别为17.2％和63.5％，姜黄素的载药量和包封率分别为14.9％和55.0％。

[0051] 实施例5：联合载多西紫杉醇、槲皮素的低分子肝素-甘草次酸聚合物纳米胶束制备

[0052] 将50mg低分子肝素-甘草次酸聚合物(实施例2制备)，超声分散于5mL去离子水中，备用；另称取20mg多西紫杉醇和20mg槲皮素溶解于1mL四氢呋喃中，在强烈搅拌情况下缓慢滴加至上述低分子肝素-甘草次酸聚合物水溶液中，室温继续强烈搅拌4h后，用探头式超声在120W功率条件下处理三次，每次2min，温度保持在4℃～8℃，脉冲开2s停4s，超声完毕后将溶液转移至透析袋中对水透析24小时，然后将所得溶液4000r/min离心20min，以除去未包封的药物。上清液接着过0.8μm滤膜，即得共载紫杉醇和姜黄素的纳米胶束制剂，冻干获得载紫杉醇纳米胶束的冻干粉。高效液相色谱法检测结果显示多西紫杉醇的载药量和包封率分别为18.9％和66.1％，槲皮素的载药量和包封率分别为14.4％和53.1％。