鲫鱼鲤疱疹病毒2型特异性PCR检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明属于生殖技术领域，具体涉及一种公开了鲫鱼鲤疱疹病毒2型特异性PCR检测试剂盒及检测方法。本发明所述的鲫鱼鲤疱疹病毒2型的PCR快速检测试剂盒，包括：2×反应混合缓冲液1.0mL；优选设计的上、下游引物；Taq DNA聚合酶；阳性对照液；阴性对照液；ddH2O。本发明克服了现有鲤疱疹病毒2型检测方法的不足，提供一种新型PCR快速检测试剂盒及检测方法。本发明对鲫鱼鲤疱疹病毒2型进行临床诊断不仅切实可行，且具有快速、准确、特异的优点，满足了临床诊断的要求，为检测鲫鱼鲤疱疹病毒2型提供了便利条件。

权利要求

1.鲫鱼鲤疱疹病毒2型的PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：(1)2×反应混合缓冲液1.0mL，包含以下成分：

(2)检测引物的设计合成：根据GenBank中发布的鲤疱疹病毒2型的基因序列，设计一对特异性检测引物，上游引物C-F：5’-CGCAGCGGGATCATCCCAATC-3’，下游引物C-R：5’-CGATGTGTATTTCATATAGTG-3’，浓度为10μM；

(3)Taq酶               5U/μL；

(4)灭菌的ddH2O         1.0mL；

(5)阳性对照液：鲫鱼鲤疱疹病毒2型基因组DNA；

(6)阴性对照液：健康鲫鱼基因组DNA；

采用试剂盒检测鲫鱼鲤疱疹病毒2型的方法为：

(1)鲫鱼鲤疱疹病毒2型DNA的提取：取鳃、脾脏、肾脏组织，加入灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入200μL Tris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，

12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入的75％的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用ddH2O溶解，即为试验用DNA模板，提取的DNA模板置于-70℃保存备用；

(2)PCR反应体系：采用PCR反应体系，在PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液，上游引物、下游引物，Taq DNA聚合酶，DNA模板，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上；

(3)PCR反应条件：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环30次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；

(4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取产物在含溴化乙锭0.5μg/mL的1.5％琼脂糖凝胶上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；

(5)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在526bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为鲤疱疹病毒2型阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的鲤疱疹病毒2型。

说明书

鲫鱼鲤疱疹病毒2型特异性PCR检测试剂盒及检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及养殖技术领域，特别涉及一种鲫鱼鲤疱疹病毒2型的基因检测试剂及检测方法，适用于鲫鱼鲤疱疹病毒2型的流行病学监测、鲤疱疹病毒2型的检测及基因工程技术等领域。

背景技术

[0002] 鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)，又称疱疹病毒性造血器官坏死病病毒(Herpesviralhaematopoietic necrosis virus，HVHNV)或金鱼造血器官坏死病毒(Goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV)。该病毒在1992-1993年首次在日本养殖的金鱼被分离鉴定，也是该病的首次报道，曾给日本金鱼养殖业造成了巨大的经济损失，死亡率高达100％。该病毒2009年在我国江苏地区首次出现，濒死鱼的血液会顺着鳃丝流出，渔民称之为“鳃出血”，2010年在该地区广泛暴发，2011～2012年，该病毒继续蔓延，导致鲫鱼主要养殖区的异育银鲫暴发了“鳃出血”病，死亡率达80％以上。根据流行病学调查，综合电镜观察、分子检测和回归感染实验，确定“鳃出血”病原为CyHV-2。该病传播范围广、传染性强、发病快、致死率高，已给我国鲫鱼养殖业造成了巨大的经济损失，成为我国水产养殖中危害最为严重的病毒性疾病之一。为了及早发现养殖鱼类是否被CyHV-2感染，有必要建立一种快速、准确、灵敏的检测方法。

[0003] 传统病毒病的诊断需要进行病毒分离，细胞培养，电镜观察以及免疫检测等方法，缺乏对病毒进行快速、准确、敏感的检测方法。PCR方法具有操作简单、特异、快速、敏感等优点，正逐步应用于病原微生物的检测与研究中。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种鲫鱼鲤疱疹病毒2型特异性PCR检测方法，能快速、高效地用于鲤疱疹病毒2型的检测。

[0005] 本发明通过下述技术方案实现的。

[0006] 1.鲫鱼鲤疱疹病毒2型的PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

[0007] (1)2×反应混合缓冲液，包含以下成分：

[0008] KCl，

[0009] MgCl2，

[0010] Tris-HCl，pH5.8，

[0011] dNTP；

[0012] (2)检测引物的设计合成：上游引物C-F：5’-CGCAGCGGGATCATCCCAATC-3’，下游引物C-R：5’-CGATGTGTATTTCATATAGTG-3’，浓度为10μM；

[0013] (3)Taq酶；

[0014] (4)灭菌的ddH2O；

[0015] (5)阳性对照液：鲫鱼鲤疱疹病毒2型基因组DNA；

[0016] (6)阴性对照液：健康鲫鱼基因组DNA。

[0017] 2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，采用试剂盒检测鲫鱼鲤疱疹病毒2型的方法为：

[0018] (1)鲫鱼鲤疱疹病毒2型DNA的提取：取鳃、脾脏、肾脏组织，加入灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入200μL Tris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入的75％的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用ddH2O溶解，即为试验用DNA模板，提取的DNA模板置于-70℃保存备用；

[0019] (2)PCR反应体系：采用PCR反应体系，在PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液，上游引物、下游引物，Taq DNA聚合酶，DNA模板，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上；

[0020] (4)PCR反应条件：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环30次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；

[0021] (5)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；

[0022] (6)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在526bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为鲤疱疹病毒2型阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的鲤疱疹病毒2型。

[0023] 优选的技术方案为：

[0024] 1.鲫鱼鲤疱疹病毒2型的PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

[0025] (3)2×反应混合缓冲液1.0mL，包含以下成分：

[0026]

[0027] (4)检测引物的设计合成：根据GenBank中发布的鲤疱疹病毒2型的基因序列，设计一对特异性检测引物，上游引物C-F：5’-CGCAGCGGGATCATCCCAATC-3’，下游引物C-R：5’-CGATGTGTATTTCATATAGTG-3’，浓度为10μM；

[0028] (3)Taq酶          5U/μL；

[0029] (4)灭菌的ddH2O    1.0mL；

[0030] (5)阳性对照液：鲫鱼鲤疱疹病毒2型基因组DNA；

[0031] (6)阴性对照液：健康鲫鱼基因组DNA。

[0032] 2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，采用试剂盒检测鲫鱼鲤疱疹病毒2型的方法为：

[0033] (1)鲫鱼鲤疱疹病毒2型DNA的提取：取50-100mg的鳃、脾脏、肾脏组织，加入600μL灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入200μL Tris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入1mL预冷的75％的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用50μL的ddH2O溶解，即为试验用DNA模板，提取的DNA模板置于-70℃保存备用；

[0034] (2)PCR反应体系：采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物、下游引物各0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，DNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上；

[0035] (4)PCR反应条件：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环30次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；

[0036] (5)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；

[0037] (6)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在526bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为鲤疱疹病毒2型阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的鲤疱疹病毒2型。

[0038] 与现有技术相比，本发明所述的鲫鱼的病原鲤疱疹病毒2型的特异性PCR快速检测试剂盒及其检测方法具有以下特点及优点：

[0039] (1)本发明采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术检测鲫鱼鲤疱疹病毒2型的方法，适用于对鲫鱼鲤疱疹病毒2型进行快速检测。

[0040] (2)与现有技术相比，本发明的有益效果包括：①检测快速、效率高：从核酸提取、聚合酶链反应(PCR)到结果判定仅需要3小时；一次可以进行多个样品的检测，具有高效性。②检测准确：检测引物只与鲫鱼鲤疱疹病毒2型特异性地结合，与其他鱼类病毒都没有交叉反应。③检测灵敏度高，适合用于鲫鱼鲤疱疹病毒2型的早期监控。

附图说明

[0041] 图1为感染鲤疱疹病毒2型鲫鱼组织的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号2为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号3为鲤疱疹病毒2型感染鲫鱼组织样品；标号M为分子量标准DL2000(购自宝生物工程有限公司)；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。

[0042] 图2为对不同病原的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为鲤疱疹病毒2型；标号2为鲤疱疹病毒1型；标号3为鲤疱疹病毒3型；标号4为草鱼出血病病毒；标号5为鳜鱼弹状病毒；标号6为真鲷虹彩病毒；标号7为病毒性神经坏死病毒；标号8为病毒性出血败血症病毒，标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。

[0043] 图3为6尾发病鲫鱼组织样品的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号2为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号3-8为6尾鲫鱼组织样品；标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。

具体实施方式

[0044] 下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明：

[0045] 实施例一：鲫鱼鲤疱疹病毒2型PCR快速检测试剂盒

[0046] 本实施例所述的鲫鱼鲤疱疹病毒2型PCR快速检测试剂盒的所有化学试剂及引物均从专业的试剂公司购买。但上述试剂和引物来源不构成对本发明的任何限制，本发明可自行配制有关试剂和合成有关引物。

[0047] 试剂盒由下列部分构成(9样份)：

[0048] (1)2×反应混合缓冲液(Reaction Mix Buffer)1.0mL，包含以下成分：

[0049]

[0050] (2)检测引物：上游引物C-F：5’-CGCAGCGGGATCATCCCAATC-3’，下游引物C-R：5’-CGATGTGTATTTCATATAGTG-3’，浓度为10μM，上下游引物混合，400μL。

[0051] (3)Taq酶          5U/μL。

[0052] (4)灭菌的ddH2O    1.0mL。

[0053] (5)阳性对照液：鲫鱼鲤疱疹病毒2型基因组DNA。

[0054] (6)阴性对照液：健康鲫鱼基因组DNA。

[0055] (7)操作说明书一份。

[0056] (8)长方体盒子，可装上述1～7号部件，9.0×5.0×5.0cm3。

[0057] (9)一块硬纸板，其大小与盒子的底面相同，高2.5cm，有2排孔，每排4个孔，孔径1.0cm，上述各小管分别对应放置于这些小孔中，装于长方体盒子中。

[0058] 上述阳性对照和阴性对照是分别取100mg鲤疱疹病毒2型感染的鲫鱼和健康的鲫鱼的鳃丝，肝脏、肾脏组织，加入600μL灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入200μL Tris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入1mL预冷的75％的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用100μL的ddH2O溶解而得。

[0059] PCR扩增反应体系(25μL)为：

[0060]

[0061] PCR扩增反应条件为：

[0062] 95℃    5min

[0063] 1个循环

[0064] 95℃    30s

[0065] 55℃    30s

[0066] 72℃    30s

[0067] 30个循环

[0068] 72℃    10min

[0069] 1个循环

[0070] 扩增产物4℃保存。

[0071] 实施例二：鲫鱼鲤疱疹病毒2型PCR检测方法

[0072] 使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：

[0073] (1)取50mg待检样品，加入600μL灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入200μL Tris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入1mL预冷的75％的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用100μL的ddH2O溶解，作为PCR反应的模板。

[0074] (2)分别取2×反应混合缓冲液12.5μL，上、下游引物(C-F、C-R)各0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O 8μL，模板3.0μL，另取阳性对照液和阴性对照液各3μL作为模板，作为阳性和阴性对照组。混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上。

[0075] (3)按下列条件进行PCR扩增：94℃5min，1个循环；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min，最后4℃保存。

[0076] (4)反应结束后，取10μL加入2μL溴酚蓝混匀，经1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)电泳25min后，于紫外仪上观察，若在526bp处出现明亮的反应条带，则为鲤疱疹病毒2型阳性；若无反应条带出现，则为阴性。

[0077] (5)实验结果分析：如图1所示，在标号3(待测样品)的电泳带中526bp处出现明亮的反应条带，在标号2(阳性对照)的电泳带中也出现同样的反应条带，而在标号1(阴性对照)的电泳带中未出现反应条带，表明本PCR试剂盒的检测效果符合预期。

[0078] 实施例三：鲫鱼鲤疱疹病毒2型PCR快速检测试剂盒特异性实验

[0079] 使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：

[0080] (1)分别以提取的鲤疱疹病毒2型、鲤疱疹病毒1型、鲤疱疹病毒3型、草鱼出血病病毒、鳜鱼弹状病毒、真鲷虹彩病毒、病毒性神经坏死病毒、病毒性出血败血症病毒的核酸作为模板，进行PCR检测。

[0081] (2)分别取2×反应混合缓冲液12.5μL，上、下游引物(C-F、C-R)各0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O 8μL，模板3.0μL。混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上。

[0082] (3)按下列条件进行PCR扩增：95℃5min，1个循环；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min，最后4℃保存。

[0083] (4)反应结束后，取10μL加到2μL溴酚蓝混匀，经1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)电泳25min后，于紫外仪上观察，若在526bp处出现明亮的反应条带，则为鲤疱疹病毒2型阳性；若无反应条带出现，则为阴性。

[0084] (5)实验结果分析：如图2所示，标号1的电泳带在526bp处出现明亮的反应条带，显示鲤疱疹病毒2型阳性。标号2～9(分别为鲤疱疹病毒1型、鲤疱疹病毒3型、草鱼出血病病毒、鳜鱼弹状病毒、真鲷虹彩病毒、病毒性神经坏死病毒、病毒性出血败血症病毒)的电泳带在526bp处无反应条带出现，显示鲤疱疹病毒2型阴性。表明本发明所述的试剂盒对鲤疱疹病毒2型的特异性强。

[0085] 实施例四：鲫鱼鲤疱疹病毒2型PCR快速检测试剂盒对发病鲫鱼的检测[0086] 使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：

[0087] (1)分别以从发病池塘中取的6尾发病鲫鱼组织中提取的DNA作为模板，进行PCR检测。

[0088] (3)分别取2×反应混合缓冲液12.5μL，上、下游引物(C-F、C-R)各0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O 8μL，模板3.0μL，另取阳性对照液和阴性对照液各3μL作为模板，作为阳性和阴性对照组。混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上。

[0089] (3)按下列条件进行PCR扩增：95℃5min，1个循环；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min，最后4℃保存。

[0090] (4)反应结束后，取10μL加到2μL溴酚蓝混匀，经1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)电泳25min后，于紫外仪上观察，若在526bp处出现明亮的反应条带，则为鲤疱疹病毒2型阳性；若无反应条带出现，则为阴性。

[0091] (5)实验结果分析：检测所取6尾鲫鱼中，6尾鲫鱼鲤疱疹病毒2型阳性，通过进一步测序表明，其检测结果均为鲤疱疹病毒2型，且核苷酸同源性都在99％以上，PCR检测结果见图3。