一种从海萝藻中提取抗紫外辐射活性物质的方法

摘要

本发明公开了一种从海萝藻中提取抗紫外辐射活性物质的方法，含以下步骤：（1）前处理；（2）超声波提取；（3）冷冻醇沉；（4）离心除杂；（5）脱色，得到白色抗紫外辐射活性物质。该方法采用低浓度甲醇、超声波技术提取及固相小柱分离纯化技术相结合的集成技术，通过控制提取的时间、温度、甲醇浓度、料液比例，超声波的频率和功率，最大化地提取该活性物质，该方法提取的海萝藻抗紫外辐射活性物质在UVB(280~320nm)区段和320~360nm（UVA）均有明显的紫外吸光能力，很适合应用于化妆品中，对于日常防晒具有明显的效果。

权利要求

1.一种从海萝藻中提取抗紫外辐射活性物质的方法，其特征是含以下步骤：(1)前处理：选取海萝藻，清洗、干燥后粉碎；

(2)超声波提取：在粉碎的海萝藻中加入甲醇水溶液，采用超声波提取，提取后离心，取上清液，在沉淀物中加入上述甲醇水溶液，重复提取一次，提取后离心，取上清液，合并两次提取的上清液；

(3)冷冻醇沉：在步骤(2)所得上清液中加入无水乙醇进行醇沉；

(4)离心除杂：将醇沉获得的沉淀物离心，取上清液，将上清液旋干，所得产物用超纯水复溶后，移出黄褐色溶解物；

(5)脱色：将黄褐色溶解物采用固相萃取柱过滤纯化，收集纯化物，冻干即得到白色抗紫外辐射活性物质；

步骤(1)中将新鲜采集的海萝藻洗净，沥干水，放在-20℃以下的冰箱中冻结，然后将冻透的海萝藻放在冷冻干燥机中，干燥温度为-55℃～-60℃，干燥时间为24h～40h；

步骤(2)中甲醇水溶液中甲醇的体积百分含量为5～15％，甲醇水溶液的用量为海萝藻总质量的55～75倍；

步骤(2)中超声波提取时，提取温度为35～50℃，提取时间为60～85min，超声波的频率为35kHz，超声波的强度为280～360W。

2.根据权利要求1所述的从海萝藻中提取抗紫外辐射活性物质的方法，其特征是：步骤(3)中无水乙醇的用量为上清液总体积的3.5～4.5倍，醇沉时在低于-18℃条件下醇沉2～

3h。

3.根据权利要求1所述的从海萝藻中提取抗紫外辐射活性物质的方法，其特征是：步骤(4)中离心时，离心温度为2～6℃，转速为8000～12000r/min，离心时间为15～20min，离心后保留上清液，除去沉淀物。

4.根据权利要求1所述的从海萝藻中提取抗紫外辐射活性物质的方法，其特征是：步骤(4)中将上清液旋干时旋转蒸发仪的温度为35～45℃。

5.根据权利要求1所述的从海萝藻中提取抗紫外辐射活性物质的方法，其特征是：步骤(4)中所得产物用10～50mL超纯水复溶。

6.根据权利要求1所述的从海萝藻中提取抗紫外辐射活性物质的方法，其特征是：步骤(5)中所述的固相萃取柱为SPE-pak C18固相萃取小柱。

说明书

一种从海萝藻中提取抗紫外辐射活性物质的方法

技术领域

[0001] 本发明属于海萝藻技术领域，具体涉及一种从海萝藻中提取抗紫外辐射活性物质的方法。

背景技术

[0002] 海萝，又名赤菜、牛毛菜、胶菜等。红藻门内枝藻科海萝属，一年生红藻。藻体紫红色，黄褐色至褐色，软革质，干后韧，高4-10cm，可达15cm，丛生，主枝短，圆柱形或亚圆柱形，宽约4mm，不规则二叉分枝，于分枝处常缢缩。海萝藻喜生长在接受波浪冲击，盐度较高，垂直分布可达2米左右的外海岩礁上，喜阳光。我国沿海分布于辽宁、河北、山东、江苏、浙江、福建、广东、台湾等沿海,东南沿海海岸分布较为广泛，尤其是粤东地区的南澳岛地处闽粤之交的外海，尤其适合其生长。目前海萝藻的人工培育、养殖也取得突破，海萝藻是我国南方地区的重要经济海藻。海萝藻含有丰富的功能活性物质，如具有清热、解毒、抗炎症、抗紫外辐射等。紫外线是电磁波谱中波长从200-400nm辐射的总称，到达地球表面的紫外辐射主要来自太阳,太阳紫外线辐射在太阳全波段辐射总量中所占的百分率很少，但所产生的光化学作用和生物学效应十分显著,对地球气候、生态环境及人类健康的影响很大。紫外线中UV-A会加速皮肤老化，引起色斑并使皮肤变黑，UV-B是产生人体伤害的主要波段，不仅能引起皮炎、色斑、皮肤癌，还会降低人体免疫能力，可直接致癌。因此寻找高效的抗紫外剂具有重要意义。

[0003] 天然抗紫外辐射剂在医药、化妆品、保健品和食品添加剂等方面应用前景广阔，筛选具有强抗紫外辐射活性的天然资源已成为食品科学、生物学、医学等研究的新趋势。目前关于海萝藻抗紫外辐射活性物质的制备工艺方面的研究较少，还存在很大的开发空间。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种从海萝藻中提取抗紫外辐射活性物质的方法，该方法操作简便、安全环保。

[0005] 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种从海萝藻中提取抗紫外辐射活性物质的方法，含以下步骤：

[0006] (1)前处理：选取海萝藻，清洗、干燥后粉碎；

[0007] (2)超声波提取：在粉碎的海萝藻中加入甲醇水溶液，采用超声波提取，提取后离心，取上清液，在沉淀物中加入上述甲醇水溶液，重复提取一次，提取后离心，取上清液，合并两次提取的上清液；

[0008] (3)冷冻醇沉：在步骤(2)所得上清液中加入无水乙醇进行醇沉；

[0009] (4)离心除杂：将醇沉获得的沉淀物离心，取上清液，将上清液旋干，所得产物用超纯水复溶后，移出黄褐色溶解物；

[0010] (5)脱色：将黄褐色溶解物采用固相萃取柱过滤纯化，收集纯化物，冻干即得到白色抗紫外辐射活性物质。

[0011] 在上述从海萝藻中提取抗紫外辐射活性物质的方法中：

[0012] 步骤(1)中干燥优选采用冷冻干燥，冻干机干燥温度为-55℃～-60℃，干燥时间为24～40h。

[0013] 步骤(1)中前处理进一步包括：将新鲜采集的海萝藻洗去泥沙，沥干水，放在-20℃以下的冰箱中冻结(时间跟冻藏温度有关，如果是-20℃需要6～8h，如果是-80℃需要大约2h)，然后将冻透的海萝藻放在冷冻干燥机中，干燥温度为-55℃～-60℃，干燥时间为24h～
40h，取冻干海萝藻于组织粉碎机间断粉碎或用高通量组织研磨仪粉碎，粉碎的海萝藻粉过大约60目网筛，收集大约60目藻粉于密封袋保存。

[0014] 步骤(2)中甲醇水溶液中甲醇的体积百分含量优选为5～15％，甲醇水溶液的用量优选为海萝藻总质量的55～75倍。

[0015] 步骤(2)中超声波提取时，提取温度优选为35～50℃，提取时间优选为60～85min，超声波的频率优选为35kHz，超声波的强度优选为280～360W。

[0016] 步骤(2)中超声波提取进一步包括：将海萝藻粉放在抽提容器中，加入浓度为5～15％的甲醇水溶液，料液比为1：55～75，在超声波仪器中，进行提取，控制提取温度为35～
50℃，提取时间为60～85min，超声波的频率为35kHz，超声波的强度为280～360W，将提取物离心分离，取上清液，将沉淀物按上述方法重复提取一次，合并两次上清液。

[0017] 步骤(3)中无水乙醇的用量为上清液总体积的3.5～4.5倍，醇沉时在低于-18℃条件下醇沉2～3h。

[0018] 步骤(3)中冷冻醇沉进一步包括：将收集的上清液，加入无水乙醇，二者的比例为1：4，然后在低于-18℃条件下稳定醇沉2～3h。

[0019] 步骤(4)中离心时，离心温度优选为2～6℃，转速优选为8000～12000r/min，离心时间优选为15～20min，离心后保留上清液，除去沉淀物。

[0020] 步骤(4)中将上清液旋干时旋转蒸发仪的温度优选为35℃～45℃。

[0021] 步骤(4)中所得产物优选用10～50mL超纯水复溶。

[0022] 步骤(4)中离心去杂质进一步包括：将醇沉后的物质进行离心分离，离心温度为2～6℃，转速为8000～12000r/min，离心时间为15～20min，保留上清液，除去沉淀物，将上清液于旋转蒸发仪中35℃～45℃旋干，所得产物用10～50mL超纯水复溶，移出溶解物，即为抗紫外辐射活性物质，产品为黄褐色。

[0023] 步骤(5)中所述的固相萃取柱优选为SPE-pak C18固相萃取小柱。

[0024] 步骤(5)中脱色进一步包括：将提取的活性物质，通过SPE-pak C18固相萃取小柱，过滤纯化去除色素，收集纯化物，经冻干得到白色抗紫外辐射活性物质。

[0025] SPE-pak C18固相萃取小柱过滤前需要先进行柱活化和柱淋洗，其中柱活化过程为：取3～5倍柱体积甲醇，以大约5mL/min的流速通过柱填料；柱淋洗过程为：取3-5倍柱体积超纯水，以大约5mL/min的流速淋洗柱。

[0026] 采用SPE-pak C18固相萃取小柱过滤纯化黄褐色溶解物的具体过程为：将黄褐色溶解物，用超纯水稀释5～10倍，以大约1～3mL/min的流速通过SPE-pak C18固相萃取小柱，收集流出的样液，然后清洗柱：以大约1倍柱体积的超纯水清洗柱，同时收集洗脱液，将样液和洗脱液合并，即为纯化物。

[0027] 本发明具有如下优点：

[0028] (1)本发明通过采用低浓度甲醇、超声波技术提取及固相小柱分离纯化技术相结合的集成技术，从海萝藻中提取具有抗紫外辐射的活性物质，通过超声波技术具有波动和能量的双重属性，一是空化现象，即在液体介质中表现为泡的形成和破裂及伴随的能量释放，二是介质和容器也可以通过声的吸收产生共振性质的二级效应，所以在超声波的辅助作用下能促进低浓度甲醇对海萝藻中具有抗紫外辐射的功能活性物质的溶解，通过控制提取的时间、温度、甲醇浓度、料液比例，超声波的频率和功率，最大化地提取该活性物质；

[0029] (2)本发明实施例1中对海萝藻中抗紫外辐射功能活性物质进行紫外吸光能力测试，结果表明，提取的海萝藻抗紫外辐射活性物质在UVB(280～320nm)区段和320～360nm(UVA)均有明显的紫外吸光能力，很适合应用于化妆品中，对于日常防晒具有明显的效果；

[0030] (3)本发明制备方法操作简单，超声波辅助低浓度甲醇提取可以大大提高提取效率，缩短提取时间，生产成本低，产品安全，可提高生产企业的经济效益；

[0031] (4)本发明通过对海萝藻进行高值化利用，提取抗紫外辐射活性物质，可广泛应用于化妆品行业作为天然防晒剂，对促进海藻产业的可持续发展具有重要的经济意义和社会意义；

[0032] (5)本发明制备方法能为海萝藻的高值化利用提供新的技术，促进海萝藻养殖加工产业的发展，可提高生产企业的经济效益。

附图说明

[0033] 图1是实施例1中超声波提取时甲醇浓度对提取效率的影响；

[0034] 图2是实施例1中超声波提取时海萝藻和甲醇的料液比的选择对提取效率的影响；

[0035] 图3是实施例1中超声波提取时超声波处理时间的选择对提取效率的影响；

[0036] 图4是实施例1中超声波提取时超声波处理温度的选择对提取效率的影响；

[0037] 图5是实施例1中超声波提取时超声波处理功率的选择对提取效率的影响。

具体实施方式

[0038] 实施例1

[0039] 本实施例提供的从海萝藻中提取抗紫外辐射活性物质的方法，包括以下步骤：

[0040] (1)前处理：将新鲜采集的海萝藻洗去泥沙，沥干水，然后放在-60℃冷冻干燥机中干燥24h，取冻干海萝藻于组织粉碎机间断粉碎或用高通量组织研磨仪粉碎，粉碎的海萝藻粉过60目网筛，收集60目藻粉于密封袋保存；

[0041] (2)超声波法提取：首先本发明申请人进行了最佳提取工艺条件研究，分别研究了甲醇浓度对提取率的影响、料液比的选择、超声波处理时间的选择、超声波处理温度的选择、超声波功率对提取率的影响，结果见图1-5中所示，从图1-5中可以看出：甲醇水溶液中甲醇的体积百分含量为5～15％，甲醇水溶液的用量为海萝藻总质量的55～75倍，提取温度为35～50℃，提取时间为60～85min，超声波的频率为35kHz，超声波的强度为280～360W时，提取效率相对较高。

[0042] 本实施例中采用以下条件对海萝藻中有效成分进行提取：将海萝藻粉放在抽提容器中，加入浓度(体积百分含量，下同)为10％的甲醇溶液，料液比为1：70，在超声波仪器中，进行提取，控制提取温度为40℃，提取时间为60min，超声波的频率为35kHz，超声波的强度为360W，将提取物离心分离，取上清液，将沉淀物按上述方法重复提取一次，合并两次上清液；

[0043] (3)冷冻醇沉：将上述收集的上清液，加入无水乙醇，二者的体积比为1：4，然后在低于-18℃条件下稳定醇沉2h；

[0044] (4)离心去杂质：将醇沉后的物质进行离心分离，离心温度为4℃，转速为10000r/min，离心时间为15min，保留上清液，除去沉淀物；

[0045] (5)将上清液于旋转蒸发仪中40℃旋干，所得产物用10mL超纯水复溶，移出溶解物，即为抗紫外辐射活性物质，产品为黄褐色；

[0046] (6)脱色：将上述提取的活性物质用超纯水稀释10倍，通过SPE-pak C18固相萃取小柱，过滤纯化去除色素，收集纯化物，经冻干得到白色抗紫外辐射活性物质。

[0047] SPE-pak C18固相萃取小柱过滤前需要先进行柱活化和柱淋洗，其中柱活化过程为：取3～5倍柱体积甲醇，以大约5mL/min的流速通过柱填料；柱淋洗过程为：取3～5倍柱体积超纯水，以大约5mL/min的流速淋洗柱。

[0048] 采用SPE-pak C18固相萃取小柱过滤纯化黄褐色溶解物的具体过程为：将黄褐色溶解物，以大约1～3mL/min的流速通过SPE-pak C18固相萃取小柱，收集流出的样液，然后清洗柱：以大约1倍柱体积的超纯水清洗柱，同时收集洗脱液，将样液和洗脱液合并，即为纯化物。

[0049] 根据QB/T 2410-1998中的方法，采用本发明实施例1中制备的抗紫外辐射活性物质进行的紫外吸收测试，其结果见下表1。

[0050] 表1海萝藻提取物的紫外吸光值

[0051]

[0052]

[0053] 根据海萝藻中提取的抗紫外辐射活性物质的吸光值，由上表1鉴定结果可以推导出，防晒品化妆品中添加6～15μg/mL的该活性物质(1mL化妆品中添加6～15μg该粉末状活性物质)即可达到最小防护紫外光的效果(UVB吸光值A为0.5～1.0)、添加15～17μg/mL的该活性物质即可达中等防护紫外光效果(UVB吸光值A为1.1～1.5)，添加18～30μg/mL的该活性物质能达高效防护紫外光效果(UVB吸光值A为1.6～2.0)，添加30μg/mL以上的该活性物质可达完全防护紫外光效果(UVB吸光值A为2.1以上)。同时，由表1可看出海萝藻提取物(上文中提取的活性物质)本身在UVA段就有很好的吸光值，更适合用于日常防晒，效果显著。

[0054] 实施例2

[0055] 本实施例提供的从海萝藻中提取抗紫外辐射活性物质的方法，包括以下步骤：

[0056] (1)前处理：将新鲜采集的海萝藻洗去泥沙，沥干水，然后放在-55℃冷冻干燥机中干燥40h，取冻干海萝藻于组织粉碎机间断粉碎或用高通量组织研磨仪粉碎，粉碎的海萝藻粉过60目网筛，收集60目藻粉于密封袋保存；

[0057] (2)超声波法提取：将海萝藻粉放在抽提容器中，加入浓度为5％的甲醇水溶液，二者的料液比为1：55，在超声波仪器中，进行提取，控制提取温度为35℃，提取时间为70min，超声波的频率为35kHz，超声波的强度为320W，将提取物离心分离，取上清液，将沉淀物按上述方法重复提取一次，合并两次上清液；

[0058] (3)冷冻醇沉：将上述收集的上清液，加入无水乙醇，二者的比例为1：3.5，然后在低于-18℃条件下稳定醇沉2.5h；

[0059] (4)离心去杂质：将醇沉后的物质进行离心分离，离心温度为2℃，转速为12000r/min，离心时间为18min，保留上清液，除去沉淀物；

[0060] (5)将上清液于旋转蒸发仪中35℃旋干，所得产物用25mL超纯水复溶，移出溶解物，即为抗紫外辐射活性物质，产品为黄褐色；

[0061] (6)脱色：将上述提取的活性物质，用超纯水稀释6倍，通过SPE-pak C18固相萃取小柱，过滤纯化去除色素，收集纯化物，经冻干得到白色抗紫外辐射活性物质。

[0062] 实施例3

[0063] 本实施例提供的从海萝藻中提取抗紫外辐射活性物质的方法，包括以下步骤：

[0064] (1)前处理：将新鲜采集的海萝藻洗去泥沙，沥干水，然后放在-58℃冷冻干燥机中干燥35h，取冻干海萝藻于组织粉碎机间断粉碎或用高通量组织研磨仪粉碎，粉碎的海萝藻粉过60目网筛，收集60目藻粉于密封袋保存；

[0065] (2)超声波法提取：将海萝藻粉放在抽提容器中，加入浓度为15％的甲醇溶液，料液比为1：65，在超声波仪器中，进行提取，控制提取温度为50℃，提取时间为85min，超声波的频率为35kHz，超声波的强度为280W，将提取物离心分离，取上清液，将沉淀物按上述方法重复提取一次，合并两次上清液；

[0066] (3)冷冻醇沉：将上述收集的上清液，加入无水乙醇，比例为1：4.5，然后在低于-18℃条件下稳定醇沉3h；

[0067] (4)离心去杂质：将醇沉后的物质进行离心分离，离心温度为6℃，转速为8000r/min，离心时间为20min，保留上清液，除去沉淀物；

[0068] (5)将上清液于旋转蒸发仪中45℃旋干，所得产物用40mL超纯水复溶，移出溶解物，即为抗紫外辐射活性物质，产品为黄褐色；

[0069] (6)脱色：将上述提取的活性物质用超纯水稀释5倍，通过SPE-pak C18固相萃取小柱，过滤纯化去除色素，收集纯化物，经冻干得到白色抗紫外辐射活性物质。

[0070] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。