一种新型α-淀粉酶及其应用

摘要

本发明的目的是提供一种新型α‑淀粉酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1，编码上述α‑淀粉酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO：2。本发明的α‑淀粉酶具有更宽的温度耐受范围，50℃下测得酶比活力高达5776U/mg，而其在低温10℃下仍能保持38％左右的活性。

权利要求

1.一种α-淀粉酶，其特征在于，所述的α-淀粉酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的α-淀粉酶。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

4.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒用于重组表达权利要求1所述的α-淀粉酶。

5.如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有权利要求2所述的基因。

6.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌转化有权利要求4所述的重组质粒。

7.如权利要求6所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌的保藏编号为CCTCC NO:M2015163。

8.权利要求1所述的α-淀粉酶在饲料加工领域中的应用。

说明书

一种新型α-淀粉酶及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于功能基因筛选技术领域，具体涉及一种新型α-淀粉酶及其应用。

背景技术

[0002] α-淀粉酶特异性的催化水解淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，它可以将淀粉水解为更小的片段。其作为降解淀粉的主要水解酶，α-淀粉酶组成了一个非常庞大的糖基水解酶家族。目前发现的淀粉酶大部分具有耐酸、耐高温的性质，虽然很多物种都能产生淀粉酶，但是商业应用的α-淀粉酶主要来自芽孢杆菌属(地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌等)。目前广泛投入商业应用的耐热α-淀粉酶主要来自枯草芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。但是鲜有低温高活的α-淀粉酶的工业化应用报道。而低温下保持高活力的α-淀粉酶对有特殊温度要求的工艺以及节约能源等具有很高的应用潜力，所以筛选低温高活的新型α-淀粉酶具有十分重要的意义

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种新型α-淀粉酶，从而弥补现有技术的不足。

[0004] 本发明的α-淀粉酶，包含有

[0005] 1)氨基酸序列为SEQ ID NO：1的α-淀粉酶；

[0006] 2)在1)进行取代、缺失、添加一个或几个氨基酸形成的，且具有1)中酶学性质的α-淀粉酶；

[0007] 编码上述α-淀粉酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO：2；

[0008] 本发明还提供一种重组大肠杆菌，转化有携带上述基因的表达质粒。

[0009] 上述的重组大肠杆菌，为大肠杆菌XH031-A1(Escherichia coli XH031-A1)，于2015年3月25日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2015163。

[0010] 本发明的α-淀粉酶具有更宽的温度耐受范围，50℃下测得酶比活力高达5776U/mg，而其在低温10℃下仍能保持38％左右的活性。

附图说明

[0011] 图1：本发明的α-淀粉酶的活性与温度的关系图。

具体实施方式

[0012] 实施例1：α-淀粉酶基因laxh3357的获取

[0013] 通过对深海新菌XH031进行全基因组进行分析，得到3个淀粉酶基因及其基因序列，利用生物学软件Primer5.0设计上游引物(5’-CGGAATTCATGCACCCTCGACCGGC-3’)和下游引物(5’-CCCTCGAGACGCCGCCACATCCG-3’)以基因组DNA为模板，进行PCR反应，PCR反应组成如下(50μl反应体系)：ddH2O 11.5μl、上游和下游引物各0.5μl，DNA模板2μl、2×GC Buffer25μl、Taq 0.5μl、dNTP Mixture 8μl。反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸3min30s，72℃终延伸10min，共30个循环。反应结束后，将PCR产物回收得到α-淀粉酶基因laxh3357。laxh3357是其中的一个α-淀粉酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，与其最相似蛋白Alpha-amylase(Streptomyces hygroscopicus)，entry：P08486，identity仅为28.3％。表明其是一种之前没有报道过的α-淀粉酶基因。

[0014] 实施例2：大肠杆菌克隆载体PUCm-T-laxh3357的构建。

[0015] α-淀粉酶基因laxh3357与载体PUCm-T的连接，采用DNA Ligation Kit连接，连接体系(10μl)如下：SolutionI5μl，DNA片段4μl，PUCm-T载体1μl。16℃连接16h所得到的连接液即可获得大肠杆菌克隆载体PUCm-T-laxh3357，用于转化大肠杆菌JM109。

[0016] 实施例3：大肠杆菌重组株JM109-PUCm-T-laxh3357的构建

[0017] 加入200μl解冻的感受态Ecoli.JM109和10μl实施例2得到的连接液至2mlEppendorf管中，冰浴30min，42℃热休克90s，冰浴15min，加入LB培养基800μl，37℃振荡培养45min。菌液与4μl IPTG及40μl X-gal混合后涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12-14h。挑取白色菌落做PCR及双酶切检测，酶切体系(20μl)如下：ddH2O 8μl，PUCm-T-laxh3357质粒DNA 8μl，EcoRI1μl，XholI1μl，10×H Buffer 2μl，琼脂糖凝胶电泳中出现1428bp特异带者为阳性转化克隆，即含有PUCm-T-laxh3357的大肠杆菌JM109-PUCm-T-laxh3357。将1ml阳性克隆菌液送测，以M13测序通用引物测定外源插入序列laxh3357核苷酸序列。

[0018] 实施例4：大肠杆菌表达载体pET24a(+)-laxh3357的构建

[0019] 克隆载体PUCm-T-laxh3357和表达载体pET24a(+)分别用EcoRI和XholI双酶切，酶切体系(20μl)如下：

[0020] 反应体系1：ddH2O 8μl，PUCm-T-laxh3357质粒DNA 8μl，EcoRI1μl，XholI1μl，10×H Buffer 2μl反应体系2：ddH2O 8μl，pET24a(+)质粒DNA 8μl，EcoRI1μl，XholI1μl，10×H Buffer 2μl.

[0021] 37℃酶切30min，电泳后分别回收两个目的片段1428bp和5.3Kb，二者分别与α-淀粉酶YM01基因全长片段与表达载体PET24a(+)片段大小相同，用DNA Ligation Kit连接，连接体系(10μl)如下：SolutionI5μl，DNA片段1.5μl，pET24a(+)载体1.1μl，ddH2O 2.4μl。16℃连接16小时即可获得大肠杆菌表达载体pET24a(+)-laxh3357，用于转化大肠杆菌BL21(DE3)。

[0022] 实施例5:大肠杆菌重组BL21(DE3)-pET24a(+)-laxh3357(XH031-A1)的构建[0023] 加入200μl解冻的感受态E.coliBL21和10μl实施例4得到的连接液至2mlEppendorf管中，冰浴30min，42℃热休克90s，冰浴15min，加入LB培养基800μl，37℃振荡培养45min。菌液涂布于含有100μg/ml卡那霉素的LB平板上，37℃培养8-12h。挑取菌落做双酶切检测，酶切体系(10μl)如下：ddH2O 4μl，pET24a(+)-laxh3357质粒DNA 4μl，EcoRI 0.5μl，XhoI 0.5μl，10×H Buffer 1μl。琼脂糖凝胶电泳中出现1428bp特异带者为阳性转化克隆，即含有pET24a(+)-laxh3357的大肠杆菌重组株BL21(DE3)-pET24a(+)-laxh3357。

[0024] 实施例6：重组α-淀粉酶的制备

[0025] 挑取大肠杆菌重组株BL21(DE3)-pET24a(+)-laxh3357单克隆于含有浓度为100μg/ml卡那霉素的LB的液体培养基中，37℃振荡培养过夜，按1％接种量接种至200ml含有100μg/ml卡那霉素的LB的液体培养基中，37℃150rpm振荡培养至OD600为0.4-0.5，加入终浓度为0.1mMIPTG，16℃诱导表达16-20h。诱导菌液4℃6000rpm离心10min，收集菌体，菌体用10ml1×Ni柱结合缓冲液(20mM Tris-HCl，PH＝8.0；10mM咪唑；0.5mM NaCl)重悬并进行超声波破碎，破碎后4℃12000rpm离心10min，收集上清液。上清液上至用平衡好的Ni柱，用10倍体积1×Ni柱洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl，PH＝8.0；20mM咪唑；0.5mM NaCl)洗脱，然后依次用不同浓度(20mM，50mM，150mM)咪唑的洗涤缓冲液洗涤亲和柱，最后用浓度为250mM咪唑的洗脱液洗涤亲和柱，收集洗脱液。洗脱液于透析液(20mM Tris-HCl，PH＝8.0；0.85(g/v)NaCl，10％甘油(v/v))中透析24h后SDS-PAGE检测洗脱液中蛋白分布，合并含单一目的条带的洗脱液即可得到重组α-淀粉酶。用Bradford法测定目的蛋白的浓度，分装后将蛋白冻于-
20℃保存以备用。

[0026] 实施例7：重组α-淀粉酶活性检测及其酶学性质

[0027] 在淀粉酶平板上打孔，分别取10微升诱导的空白对照上清和大肠杆菌菌株XH031-A1的蛋白上清点在对应孔上，37℃放置3h，然后用卢戈氏碘液染色，结果可在棕色背景上看到XH031-A1有明显的透明圈，然后将纯化的重组酶同样方法点在淀粉板上发现有较大透明圈，证明其活性高。

[0028] 用DNS试剂法测得此琼胶酶的酶学性质如下：

[0029] 1、最适温度为50℃，10℃下酶活力为最适酶活的38％。

[0030] 2、热稳定性：0℃-100℃下放置1h，其中0℃-45℃能保持100％的活性。

[0031] 3、最适PH为10.0

[0032] 4、PH稳定性：PH＝3～12缓冲液中放置12h，其中PH＝6-11能保持57％以上的活性。

[0033] 5、不同离子对酶活的影响：金属离子如Na+、K+、Mn2+在低浓度1mM可以提高酶的活力，分别提高21.5％、8.1％和17.2％；重金属离子如Fe3+、Zn2+、Ag+对酶活有明显的抑制作用。

[0034] 6、酶比活：50℃下测得酶比活力高达5776U/mg(图1)

[0035] 本发明的低温高活力α-淀粉酶在洗涤剂工业，不需要较高的水温就能达到良好的洗涤效果，从而节约了能源；在食品工业，可以缩短生面团的发酵时间，提高生面团的质量。更重要的一点，该淀粉酶能够适应较宽的温度范围，适用于需要温度变化的工艺流程，比如饲料添加方面，饲料调制需要较高温度，而进入饲养动物体内的温度降温37摄氏度，整个过程该酶都可以发挥很好的作用。