玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF、其检测方法及应用转让专利
申请号 : CN201510308329.9
文献号 : CN104862322B
文献日 : 2017-11-10
发明人 : 刘铜 , 赵丰舟 , 左豫虎 , 侯巨梅 , 刘震
申请人 : 海南大学
摘要 :
本发明涉及的是玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF、其检测方法及应用，其中的玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；这种玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF用于控制玉米弯孢叶斑病菌分生孢子产生和致病性。本发明提供的CLF基因，可用于玉米弯孢叶斑病菌的调控，通过抑制病菌分生孢子产生和降低其致病性，有效的阻止病害传播、发生与危害，为创建持久，有效防治技术提供技术支持。
权利要求 :
1.一种玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF，其特征在于：这种玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF，其特征在于：所述的基因CLF编码的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求1所述的玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF，其特征在于：所述的玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF的碱基序列有3个外显子，分别位于SEQ.ID1的5端第 1位至198位碱基之间、第 252位至 324位碱基之间、第379位至 2987位碱基之间。
4.一种权利要求1或2或3所述的玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF的检测方法，其特征在于：这种玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF的检测方法：根据玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF的 编码区序列设计 引物，检测CLF基因的表达 ； CLF正向引物 ：5 `-TCATACCTTCACTCACGGGACA-3`，CLF反向引物：GCAACCGAGGGACCAAAT 。
5.一种权利要求1所述的玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF的应用，其特征在于：这种玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF用于控制玉米弯孢叶斑病菌分生孢子产生和致病性。
6.一种权利要求1所述的玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF的应用，其特征在于：这种玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF的表达与其蛋白的表达、修饰与定位作为重要候选基因用于抗真菌药剂的筛选和设计中。
7.根据权利要求5所述的玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF的应用，其特征在于：其特征在于：所述的玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF用于控制玉米弯孢叶斑病菌分生孢子产生和致病性功能的检测方法：一、通过同源重组方法构建玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF的缺失突变体，构建的突变体由PCR验证CLF基因已被潮霉素抗性基因替换，且检测不到CLF基因的表达，获得CLF基因敲除突变体；
二、采用基因互补方法将包括CLF基因起始密码子ATG前2000bp DNA和CLF基因通过原生质方法转入CLF基因敲除突变体中，且检测到CLF基因的表达，获得CLF互补突变体；
三、将野生型菌株、CLF基因敲除突变体和CLF互补突变体转接到PDA平板培养基上，观察其产孢和致病性情况，结果表明该基因的缺失导致玉米弯孢叶斑病菌不产孢；CLF缺失突变体产生的致病斑大小略小于野生型菌株；通过基因互补可以恢复CLF缺失突变体的产孢和致病性，综合以上结果，说明CLF基因可以调控玉米弯孢叶斑病菌分生孢子产生和致病性。
说明书 :
玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF、其检测方法及应用
[0001] 一、技术领域：
[0002] 本发明涉及的是植物保护领域，具体涉及的是玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF、其检测方法及应用。
[0003] 二、背景技术：
[0004] 由新月弯孢引起的玉米弯孢叶斑病曾在1990年代在我国北方玉米产区大发生，造成严重的产量损失，随后不断蔓延至全国，成为玉米生产上的重要病害。由于目前药剂防治效果较差，防治该病主要以推广抗病品种为主。然而，研究发现玉米弯孢叶斑病菌存在明显的生理分化和致病性变异，一旦抗病品种丧失抗性，将直接威胁玉米生产安全。
[0005] 玉米弯孢叶斑病菌在自然界中主要以无性繁殖为主，其无性阶段产生的分生孢子通过接触寄主萌发侵入寄主，在寄主中扩展、繁殖、产生大量的分生孢子。分生孢子可借助界质形成再侵染和循环。分生孢子是该病害发生和流行的主要影响因子。
[0006] 三、发明内容：
[0007] 本发明的一个目的是提供玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF，这种玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF用于解决玉米弯孢叶斑病的问题；本发明的另一个目的是提供这种玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF的检测方法，以及这种玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF的应用。
[0008] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：这种玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0009] 上述方案中所述的基因CLF编码的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0010] 上述方案中玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF的碱基序列有3个外显子，分别位于SEQ.ID1的5端第 1位至198位碱基之间、第 252位至 324位碱基之间、第379位至 2987位碱基之间。
[0011] 上述玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF的检测方法：根据玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF的编码区序列设计引物，检测CLF基因的表达； CLF正向引物：5`-TCATACCTTCACTCACGGGACA-3`，CLF反向引物：GCAACCGAGGGACCAAAT 。
[0012] 上述玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF用于控制玉米弯孢叶斑病菌分生孢子产生和致病性。
[0013] 上述玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF的表达与其蛋白的表达、修饰与定位作为重要候选基因用于抗真菌药剂的筛选和设计中。
[0014] 上述玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF用于控制玉米弯孢叶斑病菌分生孢子产生和致病性功能的检测方法：
[0015] 一、通过同源重组方法构建玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF的缺失突变体，构建的突变体由PCR验证CLF基因已被潮霉素抗性基因替换，且检测不到CLF基因的表达，获得CLF基因敲除突变体；
[0016] 二、采用基因互补方法将包括CLF基因起始密码子ATG前2000bp DNA和CLF基因通过原生质方法转入CLF基因敲除突变体中，且检测到CLF基因的表达，获得CLF互补突变体；
[0017] 三、将野生型菌株、CLF基因敲除突变体和CLF互补突变体转接到PDA平板培养基上，观察其产孢和致病性情况，结果表明该基因的缺失导致玉米弯孢叶斑病菌不产孢；CLF缺失突变体产生的致病斑大小略小于野生型菌株；通过基因互补可以恢复CLF缺失突变体的产孢和致病性，综合以上结果，说明CLF基因可以调控玉米弯孢叶斑病菌分生孢子产生和致病性。
[0018] 有益效果：
[0019] 本发明提供的CLF基因，可用于玉米弯孢叶斑病菌的调控，通过抑制病菌分生孢子产生和降低其致病性，有效的阻止病害传播、发生与危害，为创建持久，有效防治技术提供技术支持。
[0020] 四、附图说明：
[0021] 图1：CLF基因敲除示意图（A）和互补载体构建示意图(B)：CLF-F代表CLF基因5`端，CLF-R代表CLF基因3`端。
[0022] 图2：CLF基因敲除突变体（A）与野生型菌株(B)产孢比较图
[0023] 五、具体实施方式：
[0024] 下面对本发明做进一步的说明：
[0025] 这种玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0026] 该基因CLF编码的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF的碱基序列有3个外显子，分别位于SEQ.ID1的5端第 1位至198位碱基之间、第 252位至 324位碱基之间、第379位至 2987位碱基之间。
[0027] 玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF的检测方法：根据玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF的编码区序列设计引物，检测CLF基因的表达； CLF正向引物：5`-TCATACCTTCACTCACGGGACA-3`，CLF反向引物：GCAACCGAGGGACCAAAT 。
[0028] 具体如下：
[0029] 1）根据CLF编码序列设计引物：CLF正向引物：5`-TCATACCTTCACTCACGGGACA-3`，CLF反向引物：GCAACCGAGGGACCAAAT 。
[0030] 2）总 RNA 的提取和 cDNA 合成：
[0031] ① 研钵中加入液氮，充分冷却，加入放置于液氮中的菌丝或孢子，待液氮即将挥发干时快速研磨，反复研磨3次。
[0032] ② 将研磨好的样品加入到 RNAse free 的预冷的 2.0ml EP 管中，在超净工作台中向 EP 管中加入900μl 的Bizol，斡旋混匀，将 EP 管于冰中冰浴 15min。
[0033] ③ 冰浴后向 EP 管中加入800μl pH<5.0的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），剧烈摇晃并悬浮，再冰浴10min。
[0034] ④ 冰浴后，将 EP 管于预冷的离心机中12000rpm 4℃ 离心15min；将离心后的上清用枪头小心吸出转移至新的2ml RNAse free EP管中，再加入800μl pH>7.8的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），轻摇，上下颠倒10次，再冰浴10min；冰浴后再次12000rpm 4℃ 离心
15min，将上清吸入新的2mlRNase free EP管中，加入800μl 氯仿，摇晃几十下后冰浴5min；
冰浴后再12000rpm 4℃ 离心15min，将上清吸入1.5ml RNAse free EP管中，加入800μl 异丙醇，室温沉淀30min或者-20℃过夜。
15min，将上清吸入新的2mlRNase free EP管中，加入800μl 氯仿，摇晃几十下后冰浴5min；
冰浴后再12000rpm 4℃ 离心15min，将上清吸入1.5ml RNAse free EP管中，加入800μl 异丙醇，室温沉淀30min或者-20℃过夜。
[0035] ⑤ 12000rpm 4℃ 离心15min后弃上清，用800μl 75%乙醇（DEPC水配制）洗涤沉淀，将沉淀用手指轻轻弹起，静置5min；12000rpm 4℃ 离心15min后弃上清，用800μl 无水乙醇洗涤沉淀，将沉淀用手指轻轻弹起，静置5min；12000rpm 4℃ 离心15min后弃上清，用枪头将多余液体吸净，于冰中在超净工作台中干燥10min。
[0036] ⑥ 在37℃中去用RNAse free DNAase 除DNA，然后进行反转录合成cDNA。
[0037] ⑦ 取RNA 3μl于Rnase free PCR管中，加入olig dT 1μl，最后用DEPC水补至12μl。 将PCR管放置于65℃ PCR仪器中5min后，取出PCR管置于冰中5min；取出S冰浴后的PCR管加入5×Reaction Buffer 4μl， Inhibitor 1μl，reversase 1μl，10mM dNTPs 2μl，再将PCR管置于PCR仪中完成42℃ 60min；72℃ 10min；16℃ forever的程序后即得到cDNA。
[0038] 3）PCR扩增和检测。以 2×Taq master mix 20μl，模板cDNA 2 μl、CLF正向引物和CLF反向引物各2 μl，加ddH2O补至50 μl。PCR扩增程序：94℃ 3 min；94℃ 30sec，55℃30 sec，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 10 min；16℃ 反应结束。用1%浓度的琼脂糖进行凝胶电泳来检测PCR扩增情况。
[0039] 玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF缺失、突变或修饰后导致基因不表达，达到控制玉米弯孢叶斑病菌分生孢子产生和致病性，用于控制玉米弯孢叶斑病菌分生孢子产生和致病性。
[0040] 玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF的表达与其蛋白的表达、修饰与定位作为重要候选基因用于抗真菌药剂的筛选和设计中。筛选能够阻止该基因表达与其蛋白质的表达、修饰与定位的化合物，可以有效控制玉米弯孢叶斑病菌分生孢子的产生和致病性，可以作为新型杀菌剂的候选新药物直接利用。
[0041] 上述玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF用于控制玉米弯孢叶斑病菌分生孢子产生和致病性功能的检测方法：
[0042] 一、通过同源重组方法构建玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF的缺失突变体，构建的突变体由PCR验证CLF基因已被潮霉素抗性基因替换，且检测不到CLF基因的表达，获得CLF基因敲除突变体；
[0043] 二、采用基因互补方法将包括CLF基因起始密码子ATG前2000bp DNA和CLF基因通过原生质方法转入CLF基因敲除突变体中，且检测到CLF基因的表达，获得CLF互补突变体；
[0044] 三、将野生型菌株、CLF基因敲除突变体和CLF互补突变体转接到PDA平板培养基上，观察其产孢和致病性情况，结果表明该基因的缺失导致玉米弯孢叶斑病菌不产孢；CLF缺失突变体产生的致病斑大小略小于野生型菌株；通过基因互补可以恢复CLF缺失突变体的产孢和致病性，综合以上结果，说明CLF基因可以调控玉米弯孢叶斑病菌分生孢子产生和致病性。
[0045] 1) 基因敲除盒构建：
[0046] ① 基因敲除采用同源重组的方法，用潮霉素基因替换玉米弯孢叶斑病菌CLF基因的编码区。左臂正反引物分别为CLF1s（5`-GCTCTAGATAGAAGCAGGAGACGAAGTG-3`）和CLF1A(5`-CATTGATGTGTTGACCTCCTGCGAGTGAGGGTGAAAGG-3`)，右臂正反引物分别为CLF2S（5`-CGGAATCCGGCTTTGACGCATTTGAC-3`）和CLF2A(5`-CGAGGGCAAAGGAATAGAGTAGTACGGTGTTTGGCAGTCC-3`)，扩增模板为玉米弯孢叶斑病菌的总DNA，扩增目的片段大小分别为926bp和992bp。潮霉素正反方向引物分别为hph1（5`-GGAGGTCAACACATCAATG-3`）和hph2（5`-CTACTCTATTCCTTTGCCCTCG-3`），扩增模板为质粒pBHt1，扩增目的片段大小为1347bp。通过融合PCR方法，左右两臂按照上下游顺序分别融合到潮霉素基因hph的两侧，构建基因置换敲除盒。
[0047] ②本发明采用的融合PCR方法如下；用引物 CLF1S 和 CLF1A 扩增上游片段，用引物 CLF2S 和 CLF2A 扩增下游片段，用引物 HPH1 和 HPH2 扩增潮霉素片段。PCR 体系（25 μl）如下：10×Buffer 2.5 μl，2mM dNTP 2.5 μl，引物各 1 μl，Mg2+2.5 ul，Taq 酶 0.25 ul，加 ddH2O 补至 25 μl。PCR反应条件为：94℃ 5 min；94℃1 min，55℃30 sec，72℃1 min，30 个循环；72℃ 10 min；16℃ 结束反应。
[0048] ③构建基因敲除盒具体 PCR 扩增体系如下：5×Buffer 5 μl，2mM dNTP 2.5 μl，2+
上、下游片段 DNA 各 50 ng，潮霉素片段 150 ng，Pfu 酶（含 Mg ）0.3 μl，加 ddH2O 补至
25 μl。运行程序如下：95℃ 1 min；95℃ 20 sec，60℃ 5 min，72℃ 90 sec，15 个循环；72℃ 10 min；16℃ 结束反应。反应停止后在 PCR 管（已有 25 μl）中加入下列体系：5×Buffer 5 μl，2mM dntps 2.5 μl，Pfu 酶（含 Mg2+） 0.5μl，10 μM 引物 CLF1S、CLF1A、CLF2A、CLF2S、hph1和hph2各加 0.5 μl，加 ddH2O 补至 50 μl。运行程序如下：95℃ 1 min；95℃ 20 sec，55℃ 30 sec，72℃ 90 sec，35 个循环；72℃ 10 min；16℃ 结束反应。
用融合PCR产物1ul为模板，用引物CLF1S和CLF2A按照常规PCR方法大量扩增。获得的PCR产物为3265bp，可直接用于真菌转化。
上、下游片段 DNA 各 50 ng，潮霉素片段 150 ng，Pfu 酶（含 Mg ）0.3 μl，加 ddH2O 补至
25 μl。运行程序如下：95℃ 1 min；95℃ 20 sec，60℃ 5 min，72℃ 90 sec，15 个循环；72℃ 10 min；16℃ 结束反应。反应停止后在 PCR 管（已有 25 μl）中加入下列体系：5×Buffer 5 μl，2mM dntps 2.5 μl，Pfu 酶（含 Mg2+） 0.5μl，10 μM 引物 CLF1S、CLF1A、CLF2A、CLF2S、hph1和hph2各加 0.5 μl，加 ddH2O 补至 50 μl。运行程序如下：95℃ 1 min；95℃ 20 sec，55℃ 30 sec，72℃ 90 sec，35 个循环；72℃ 10 min；16℃ 结束反应。
用融合PCR产物1ul为模板，用引物CLF1S和CLF2A按照常规PCR方法大量扩增。获得的PCR产物为3265bp，可直接用于真菌转化。
[0049] 2）玉米弯孢叶斑病菌CLF基因的敲除：
[0050] 在本发明中，玉米弯孢叶斑病菌CLF基因敲除采用PEG介导原生质体的方法，原生质体的制备和转化方法如下：
[0051] 原生质体的制备：
[0052] 制备菌丝：将在 PDA 培养基上培养了 7 d 的野生型菌株，用灭菌的涂布器刮下表面孢子，制成孢子悬浮液，混匀后调节浓度为 107个/ml。取 1ml 的孢子悬浮液加到 100 ml 菌丝培养基中，28℃、120 rpm 振荡培养 19 h 左右，致产生幼嫩的白色细小的菌丝，然后用折叠的尼龙膜过滤，用酶解缓冲液将得到的菌丝冲洗三次，收集清洗后的菌丝体放入灭菌过的 50 ml 离心管中。
[0053] 配置酶液（1%的蜗牛酶+1%的溶壁酶）：
[0054] 先加入少量的酶解缓冲溶液于 50 ml 离心管中，然后把准确称量的酶粉倒入管中（酶从-20℃冰箱取出时，要放到冰上）。加入酶解缓冲液补充至所需体系后，上下缓慢摇动离心管后放在摇床上，倾斜着固定好，室温 100 rmp 摇 20 min 以便于混合均匀，可直接用或分装放入-20℃备用。
[0055] 制备原生质体：
[0056] 将上述酶液按照 1：10（W/V）的体系加到同一个离心管中，30℃、100 rpm，振荡培养 4 h 左右，显微镜下观察得到大量原生质体时终止培养，取出离心管后，用折叠好的三层擦镜纸来过滤原生质体，4℃、4 000 rpm 离心滤液 5 min，弃掉上清，沉淀用 Wash bufferⅠ清洗两次，然后加入适量的 Wash bufferⅡ，混匀后将原生质体浓度调至 107个/ml。
[0057] ④ PEG 介导的原生质转化和转化子获得：
[0058] 先将载体 DNA 进行浓缩。把 6 管 PCR 产物都加到同一个 1.5 ml 离心管中，再加入300 µl 的 ddH2O，微微混合，再加入 Na-AC 65 µl 和等体积的异丙醇，室温静置 30 min后 4℃、12 000 rpm 离心 30 min，弃掉上清，加 300µl 70%乙醇，吸入其中一管后 4℃、12 000 rpm 离心 8 min，弃掉上清，加 700 µl 的无水乙醇后，4℃、12 000 rpm 离心 8 min，弃掉上清，放在超净工作台下吹干后加 50 µl 的 ddH2O，溶解后测 OD 值和电泳检测。将适量原生质放入 50 ml 离心管中，冰浴 20 min，然后按 5 µg DNA/200 µl 原生质体的比例加DNA，冰浴 30 min，缓慢向管中加 100 µl 的 40% PEG-4000，重复两次，冰浴
20 min，28℃放置 20 min，每个原生质体固体再生培养基平板（含 200 µg/ml 潮霉素）加
200 µl 的混合液，涂布均匀后，28℃培养 5 d，将长出来的菌落转移到 PDA（含200 µg/ml 潮霉素）平板上，进行二次筛选，同样的方法，进行第三次筛选，第三次筛选得到的玉米弯孢叶斑菌即为转化子。
20 min，28℃放置 20 min，每个原生质体固体再生培养基平板（含 200 µg/ml 潮霉素）加
200 µl 的混合液，涂布均匀后，28℃培养 5 d，将长出来的菌落转移到 PDA（含200 µg/ml 潮霉素）平板上，进行二次筛选，同样的方法，进行第三次筛选，第三次筛选得到的玉米弯孢叶斑菌即为转化子。
[0059] 3）本发明互补载体包括CLF基因起始密码子ATG前2Kb的DNA序列。互补载体pCAMBIA1300th先通过限制性内切酶HindⅢ线性化后回收。对野生型基因组DNA进行PCR扩增得到含有启动子区的目的基因片段，然后进行限制性内切酶HindⅢ处理后回收，然后采用T4连接酶连接两个片段，转入大肠杆菌。挑取阳性克隆抽提质粒，将质粒转入感受态农杆菌AGL-1中，进行农杆菌转化。
[0060] 4）敲除突变体和互补子（CLF互补突变体）的验证：
[0061] PCR 验证：用 PCR 技术分别以野生型和CLF缺失突变体的 DNA 为模板进行扩增，检测突变体中正确的 CLF 基因敲除突变体。PCR 反应体系（25 µl）如下： 10×La PCR Buffer2.5µl、2mM dNTP mixture 2.5 µl、引物各 1 μl、Mg2+2.5 ul ，Taq 酶 0.25 µl，用 ddH2O补至 25 ul。运行如下程序：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 30 sec，72℃ 10min，30个循环；72℃ 10 min；4℃ 终止反应。产物通过 1.0%浓度的琼脂糖进行电泳检测。
[0062] Southern blotting 验证：分别以潮霉素片段和CLF 基因片段为探针，检测野生型菌株和突变体的基因组情况。
[0063] 5）玉米弯孢叶斑病菌野生型菌株和CLF基因缺失突变体菌株生物学比较：
[0064] 将野生型菌株和CLF突变体接种到PDA平板上，每个菌株接种3皿，于28℃下培养7天后观察菌落形态，野生型菌株和突变体菌落形态无显著差异。
[0065] 野生型菌株和CLF突变体产孢量的比较：
[0066] 将野生型菌株和CLF突变体接种到PDA平板上，每个菌株接种3皿，于28℃下分别培养 2 d、4 d、7 d，每个培养皿用同一直径的打孔器（6mm）取 6 个菌饼，加入 2 ml 的 ddH2O 将孢子洗下，过滤得到孢悬液，观察产孢的情况，野生型与CLF突变体产孢情况差异显著，CLF基因缺失突变体不产孢。
[0067] 野生型菌株和CLF缺失突变体致病性的比较：
[0068] 将野生型菌株和CLF突变体接种到PDA培养基上，将培养7天后的病菌PDA菌片（直径 6mm）或滴加 10 µl 孢悬液（溶液为 0.02% Tween20 和 2%蔗糖的水溶液），接种孢悬液7
的浓度为 10 个/ml，接种于玉米（黄早四）健康离体叶片上，选取同一位叶，将健康叶片用灭菌过的针头在与叶脉垂直的平行处轻轻划一下，造成伤口，两边用 10M 6-BA 溶液浸湿的棉花包裹严实并轻轻垫起，28℃保湿培养，观察记录发病情况。
的浓度为 10 个/ml，接种于玉米（黄早四）健康离体叶片上，选取同一位叶，将健康叶片用灭菌过的针头在与叶脉垂直的平行处轻轻划一下，造成伤口，两边用 10M 6-BA 溶液浸湿的棉花包裹严实并轻轻垫起，28℃保湿培养，观察记录发病情况。
[0069] 序列表1
[0070] <110> 黑龙江八一农垦大学
[0071] <120> 玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF、其检测方法及应用
[0072] <160> 2
[0073] <210> 1
[0074] <211> 2987
[0075] <212> DNA
[0076] <213> 人工序列
[0077] <400> 1
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[0080] <110> 黑龙江八一农垦大学
[0081] <120> 玉米弯孢叶斑病菌产孢基因CLF、其检测方法及应用
[0082] <160> 2
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[0085] <212> DNA
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