一株防治地黄根腐病的拮抗菌及其应用

摘要

本发明提供一株防治地黄根腐病的拮抗细菌，该菌经鉴定为铜绿假单胞菌，命名为Pseudomonas aeruginosa LK‑12，保藏号为CGMCC 10966。本发明公开的铜绿假单胞菌LK‑12是经平板对峙培养方法从地黄连作根际土壤中筛选获得，对分离至地黄病变部位的尖孢镰刀菌、黄曲霉病原菌具有强拮抗作用，同时对分离至太子参发病部位的尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、踝节霉菌等病原菌也有明显的抑制作用，可以有效防治包括地黄在内的药用植物的根腐病病害，为克服或缓解药用植物的再植病害提供菌种，是一种生防效果好、无污染、安全生态的生物防治潜力菌株，开发应用前景广阔。

权利要求

1.一株防治地黄根腐病的拮抗菌，其特征在于：所述的拮抗菌为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）LK-12，已于2015年6月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC 10966。

2.一种如权利要求1所述的防治地黄根腐病的拮抗菌在防治地黄、太子参药用植物再植病害和土传病害上的应用。

说明书

一株防治地黄根腐病的拮抗菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株细菌菌株，特别涉及一株防治地黄根腐病的拮抗细菌，可用于克服或缓解连作地黄土传病害问题，属于微生物和生物防治技术领域。

背景技术

[0002] 对于连作障碍问题的认识由来已久，很多的粮食作物（如小麦、马铃薯）、经济作物（如烟草、棉花）、油料作物（如大豆、花生）、蔬菜（黄瓜、番茄）、园艺作物（如西瓜、草莓）、药用植物（如人参、地黄、三七）以及人工林（如杨树、杉木）都存在不同程度的连作障碍问题。但是，长期困扰我国农业生产的连作障碍问题，在中药材栽培生产中表现尤为严重，约70%的块根类药用植物都存在不同程度的连作障碍问题，如地黄、三七、当归、人参等药用植物均存在严重的连作障碍问题。

[0003] 地黄（Rehmannia glutinosa L.）为玄参科多年生草本植物，以块根入药，其用药历史悠久、临床疗效显著，是我国著名的道地药材。然而，地黄的连作障碍问题尤为严重，连作下地黄植株往往表现出生长发育不良的症状：地上部植株矮小弱化、叶片光合作用减弱、易枯萎倒伏；地下部块根无法正常膨大、根冠比失调；生育期缩短，药效成分无法有效积累，药用品质下降；病虫害发生猖獗，块根易腐烂，常发生大面积枯死现象（如图1所示）。通常，每茬地黄收获后须间隔8～10 年方可在同一地块上再次种植。地黄连作不仅造成产量、品质急剧下降以及土传病害严重，更加令人担忧的是，在连作障碍成因及作用机理尚不明确的情况下，大部分农户试图通过增施肥料、滥用农药等措施来维持产量，可是效果往往不佳，不但提高了生产投入，还导致环境污染、中药材农残超标和农田生态系统功能退化等一系列问题，使中药资源的栽培生产陷入了恶性循环。因此，构建一种合理有效的措施用于克服或缓解连作障碍和土传病害问题成为药用植物资源生态学研究的重要内容。课题组前期研究发现，尖孢镰刀菌（如图2所示）是导致地黄连作障碍、土传病害猖獗的重要因素，其含量随地黄连作年限增加而不断增加。而利用拮抗菌进行植物病害的生物防治被认为是一种科学、合理、高效、环境友好型的措施。本发明针对地黄专化型尖孢镰刀菌，分离筛选到一株高效拮抗该病原真菌的拮抗细菌，鉴定为铜绿假单胞菌，命名为Pseudomonas aeruginosa LK-12。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一株防治地黄根腐病的拮抗细菌，用于生物防治地黄连续种植过程中常见的根腐病问题，为克服或缓解地黄连作障碍问题提供生防菌株。

[0005] 本发明的技术方案如下：

[0006] 本发明所提供的拮抗细菌为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa LK-12），该菌株已于2015年6月9日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 10966。

[0007] 本发明所述的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa LK-12）对地黄专化型病原菌—尖孢镰刀菌具有很强的拮抗作用。

[0008] 本发明所述的有益拮抗菌具有以下几个优点：

[0009] （1）本发明所述的拮抗菌—铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa LK-12）是通过大量的筛选工作筛选到的，是从2946株土壤细菌中筛选得到的，对地黄专化型尖孢镰刀菌具有很强的拮抗效果。

[0010] （2）本发明所述的拮抗菌—铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa LK-12）对筛选于地黄病变根部的黄曲霉和筛选于药用植物太子参连作土壤或病变部位的尖孢镰刀菌、裸节霉菌、串珠霉菌也具有很强的拮抗作用。

[0011] （3）本发明所述的拮抗菌—铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa LK-12）来源于连作地黄根际土壤中，并非源自其他生境，根际定殖效果较好并且安全可靠，对地黄及其他常种作物（如小麦、玉米、水稻、大豆、花生等）均无致病侵染能力。

[0012] （4）本发明所述的拮抗菌—铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa LK-12）的培养温度范围优选为25°C～45°C，pH范围为5～9.5，适合生长的温度和pH范围较广，适应性强。

附图说明

[0013] 图1为不同连作年限的地黄地上部和地下部生长情况。

[0014] 图2为地黄植株病害根部分离到的病原菌—尖孢镰刀菌的菌落形态. A：表示菌落正面；B：表示菌落反面。

[0015] 图3为拮抗菌铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa LK-12）的革兰氏染色及显微形态观察。

[0016] 图4为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa LK-12）与病原真菌的对峙培养照片. 平板中心接种各类病原真菌，其中A：尖孢镰刀菌（来源地黄）；B：黄曲霉（来源地黄）；C：尖孢镰刀菌（来源太子参）；D：踝节霉菌（来源太子参）；E：串珠镰刀菌（来源太子参）. B为马铃薯蔗糖培养基（PSA）平板，其余均为马铃薯葡萄糖（PDA）培养基。

[0017] 图5为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa LK-12）的代谢产物抑制尖孢镰刀菌生长. A：添加LK-12发酵液；B：未添加LK-12发酵液。

[0018] 图6为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa LK-12）防控尖孢镰刀菌侵染地黄组培苗. A：表示仅接种尖孢镰刀菌（左）及接种尖孢镰刀菌和假单胞菌（右）的组培苗生长情况俯视图；B：表示仅接种尖孢镰刀菌（左）及接种尖孢镰刀菌和假单胞菌（右）的组培苗生长情况侧面图。

[0019] 图7为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa LK-12）防控尖孢镰刀菌侵染地黄脱毒移栽苗. 左三盆表示仅接种尖孢镰刀菌；右三盆表示接种假单胞菌（距根部2 cm接种一圈）和尖孢镰刀菌（距根部4 cm接种一圈）。

具体实施方式

[0020] 以下结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细的描述。以下实施例仅仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。

[0021] 实施例1 拮抗菌铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa LK-12）的筛选及其鉴定

[0022] 1、地黄专化型尖孢镰刀菌拮抗菌Pseudomonas aeruginosa LK-12的筛选

[0023] 本发明所述的拮抗菌铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa LK-12）从连作地黄根际土壤中筛选得到。

[0024] 1.1 假单胞菌选择性培养基配制

[0025] 假单胞菌选择性培养基（pseudomonas selective isolation agar，PSIA）配制方法如下：称取20 g大豆-酪蛋白消化物琼脂培养基（soybean casein digest agar，SCD）（BD, USA），加495.5 mL双蒸水加热搅拌，充分溶解后，再加入1 mL 0.1%（wt/vol）结晶紫储备液，121°C 高温高压灭菌15 min，冷却至大约50°C时，往培养基中再添加3.5 mL 5%（wt/vol）呋喃咀啶储备液，充分混匀后，迅速倒板，冷却凝固后即制得假单胞菌选择性培养基平板。

[0026] 其中，0.1%（wt/vol）结晶紫储备液的配制方法为：称取0.1 g结晶紫（Sangon，上海），溶于100 mL双蒸水中，室温保存备用；呋喃咀啶储备液的配制方法为：称取5 g呋喃妥因（Sangon，上海），加入到90 mL N,N-二甲基甲酰胺（Sangon，上海）中充分溶解，再定容至100 mL，室温避光保存备用。

[0027] 1.2 根际土壤中假单胞菌分离筛选

[0028] 称取5 g 的新鲜根际土壤，溶于45 mL冷却的无菌水中，充分振荡摇匀，得10-1稀释液，取5 mL 10-1稀释度的土壤悬浮液至另一瓶45 mL冷却的无菌水中，充分振荡摇匀，得10-2稀释液，再次稀释得10-3稀释液，吸取60 μL的土壤稀释液，均匀涂布到制好的假单胞菌选择性培养基平板上，每个稀释度均涂3个平板，置于32°C恒温培养箱中避光培养30 h。挑选单菌落清晰可辨且生长均匀的平板，转接至新的选择性培养基平板上32°C继续培养，待菌落清晰可见时，置于4°C冰箱中短暂保存备用。

[0029] 1.3地黄专化型尖孢镰刀菌的拮抗菌筛选

[0030] 配制马铃薯蔗糖培养基（PSA）或马铃薯葡萄糖培养基（PDA），配制如下：称取洗净去皮的马铃薯200 g，切成小块，加适量水煮沸后计时25 min，用四层纱布过滤，往滤液中加入蔗糖30 g（或葡萄糖30 g）、琼脂15 g，继续加热搅拌混匀，稍加冷却后再加水定容至1000 mL，分装，高压灭菌后倒板或保存备用。

[0031] 经121°C高温高压灭菌的PSA或PDA培养基，迅速倒板，冷却凝固后制得平板，在培养皿底部过圆心画十字架，在距离圆心2.5 cm处接种经活化培养的假单胞菌，置于28°C恒温培养箱中避光培养48 h后，在培养皿的中心位置接种地黄专化型尖孢镰刀菌，置于28°C恒温培养箱中避光对峙培养数天，实时观察抑菌圈的有无及大小。对峙培养5天后，通过观察抑菌圈大小筛选出一株对地黄专化型尖孢镰刀菌具有强拮抗效应的假单胞菌，对该菌株进行了保藏，保藏编号为CGMCC 10966。将筛选到的强拮抗菌株进行纯化培养，并斜面保存备用。

[0032] 2、地黄专化型尖孢镰刀菌的拮抗菌鉴定

[0033] 2.1本发明所述的拮抗菌（保藏编号为：CGMCC 10966）经显微观察可以看到该菌为杆菌，具单鞭毛，革兰氏阴性菌（如图3所示）。在LB固体培养基上为扁平、湿润的菌落, 菌落呈金属光泽。能产生荧光色素。同时，该拮抗菌的生理生化特性为：氧化酶阳性，能氧化分解葡萄糖，产酸不产气，同时能分解果糖、丙三醇、甘露醇、脯氨酸、精氨酸、丙氨酸，但不分解蔗糖和肌醇。不能水解淀粉，能液化明胶，可分解尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、硝酸钾。

[0034] 2.2 16s-23s rRNA基因区间PCR鉴定

[0035] 将筛选出的强拮抗菌株（保藏编号为：CGMCC 10966）转接至LB液体培养基进行扩大培养，提取基因组DNA，PCR扩增16s-23s rRNA基因区间，用于细菌分子鉴定。细菌基因组DNA提取方法如下：取1 mL摇过夜的假单胞菌菌液（28°C，180 rpm），10000 rpm 离心5 min，去上清，往沉淀菌体中加入950 μL TE缓冲液悬浮沉淀，并加50 μL 10% SDS溶液和5 μL 蛋白酶K（20mg/mL），混匀，37°C水浴1 h，再加入150 μL 5 mol/mL NaCl溶液和150 μL CTAB/NaCl溶液（10% CTAB，4.1% NaCl），混匀，65°C水浴20 min，加等体积的酚︰氯仿︰异戊醇（体积比25︰24︰1）溶液进行抽提，12000 rpm离心10 min，将上清液用等体积的氯仿/异戊醇（24/1）再抽提一次，上清液用等体积异丙醇室温沉淀30 min，12000 rpm离心10 min，弃上清，DNA沉淀用70%乙醇进行清洗，自然风干后用50 μL无菌水进行溶解。

[0036] 采用16s-23s rRNA基因区间PCR扩增技术对分离筛选的假单胞菌进行分子鉴定，鉴定引物序列为：1405f（5'-TGYACACACCGCCCGT-3'）和456r（5'-CCTTT CCCTCACGGTACTG -3'）。PCR扩增体系（25 μL）为：12.5 μL Taq PCR Master Mix (2×)（Sangon，上海），1.0 μL 上下游引物（10 μM），20 ng DNA模板。PCR扩增程序为：94°C预变性5 min，94°C 变性1 min，
61°C退火 1 min，72°C延伸 90 sec，35个循环，继续72°C延伸10 min。扩增的16s-23s rRNA基因片段用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用Universal DNA Purification Kit胶回收试剂盒（TIANGEN，北京）纯化回收目的条带，并送上海生工测序部进行测序。测序序列采用BLAST工具与NCBI数据库（Nucleotide collection（nr/nt））进行比对分析。分子生物学鉴定该拮抗菌为铜绿假单胞菌，命名为Pseudomonas aeruginosa LK-12。

[0037] 实施例2 拮抗菌及其拮抗物质的抑菌效果检测

[0038] （1）拮抗菌对峙培养

[0039] 配制PSA或PDA培养基，经121°C高温高压灭菌后迅速倒板，冷却凝固后制得PSA或PDA平板，在培养皿底部过圆心画十字架，在距离圆心2.5 cm处接种经活化培养的假单胞菌，置于28°C恒温培养箱中避光培养48 h后，在培养皿的中心位置接种病原真菌，置于28°C恒温培养箱中避光对峙培养数天，实时观察抑菌圈的形成。培养5天发现，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa LK-12）能够高效拮抗地黄专化型尖孢镰刀菌、黄曲霉以及太子参专化型尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、踝节霉菌，抑制其菌丝生长（如图4所示）。

[0040] （2）拮抗物质的抑菌效果检测

[0041] 将保存的拮抗菌接种于LB液体培养基中振荡培养48h，高速离心后，上清用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，将滤液采用代谢物平板添加法进行抑菌效果评价。结果显示，添加了代谢产物的试验组，病原菌尖孢镰刀菌菌丝生长受抑制，而未添加代谢产物的对照组，病原菌菌丝生长正常。通过测量发现添加代谢产物的试验组尖孢镰刀菌的菌丝半径比对照组小了1 cm（如图5所示）。

[0042] 其中代谢物平板添加法的实验步骤为：将已灭菌的PDA培养基加热到完全融化，冷却到45℃左右加入已超滤除菌的拮抗菌发酵液（2.5%），混匀后倒入培养皿内，待其凝固。之后接入已活化的地黄专化型尖孢镰刀菌，置于28°C恒温培养箱中避光培养数天，实时观察尖孢镰刀菌生长。

[0043] 实施例3 拮抗菌防控尖孢镰刀菌侵害地黄组培苗效果评价

[0044] 配制地黄组培苗MS培养基（MS + 0.2 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L 蔗糖 + 7 g/L 琼脂），每个组培瓶添加30 mL培养基，经高温高压灭菌，待冷却凝固后，用镊子在培养基表面烫出一条小沟，在小沟一侧接种地黄幼苗2株，置于25°C恒温组培室中培养45天后，在小沟中添加培养过夜的假单胞菌LK-12菌液300 μL，对照组添加等量LB培养基代替，在小沟的另一侧（即远离地黄组培苗一侧）接种地黄专化型尖孢镰刀菌，期间持续往小沟内添加假单胞菌LK-12菌液，动态观察尖孢镰刀菌生长及其对地黄组培苗的侵染情况。结果显示，病原菌与组培苗间添加有拮抗菌的试验组中，尖孢镰刀菌生长被抑制，仅在小沟外侧范围内生长，而添加等量LB培养基的对照组中，尖孢镰刀菌生长快速，能够越过小沟，侵染地黄组培苗植株，造成组培苗茎腐烂，最终死亡（如图6所示）。

[0045] 实施例4 拮抗菌防控尖孢镰刀菌侵害地黄脱毒移栽苗效果评价

[0046] 将培养45天的地黄组培苗移栽至经高温高压灭菌处理的培养基质中，每盆种植1株，驯化培养两周，挑选长势一致的地黄移栽苗进行后续试验。在地黄移栽苗根部周围2 cm处接种一圈培养过夜的假单胞菌LK-12菌液，2天后，在根部周围4 cm处（即假单胞菌LK-12外圈）接种地黄专化型尖孢镰刀菌，25°C恒温组培室中继续培养，期间每3天添加一次假单胞菌LK-12菌液，对照组以添加等量LB培养基代替，动态观察尖孢镰刀菌对地黄移栽苗的侵染情况。结果显示：仅添加病原菌的对照组中，地黄移栽苗很快出现病变症状，在第10天时开始出现枯萎现象，到15天时已基本腐烂死亡，挑菌再测序验证发现对照组土壤表面和死亡植株上有大量尖孢镰刀菌菌丝生长，而试验组的地黄脱毒苗生长良好，整个试验期间都没有病变现象（如图7所示）。

[0047] 综上可见，本发明筛选出的一株拮抗菌（保藏号为CGMCC 10966）对地黄专化型病原菌具有很强的拮抗作用，能够有效防控尖孢镰刀菌病原菌对地黄的侵害，在该领域具有广阔的应用前景。

[0048] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。