本发明公开了液相芯片miRNA检测试剂盒。本发明提供了检测miR‑21、miR‑210和miR‑31表达量的液相芯片miRNA检测试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定待测样本是否为NSCLC癌组织的产品中的应用。本发明还提供了检测miR‑21、miR‑210和miR‑31表达量的液相芯片miRNA检测试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定待测患者是否为NSCLC患者的产品中的应用。本发明的实验证明，对26例不同期NSCLC肺癌患者肿瘤组织miRNAs进行表达量检测，发现miR‑21、miR‑210和miR‑31可以作为标志组合物，用于判断是否为NSCLC肺癌患者，其预测准确率为94.2％。具有临床操作简便、高通量、可自由组合，绝对定量等特点，尤其能够对NSCLC肺癌进行早期诊断，增加治愈的成功率。
1.检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在制备鉴定或辅助鉴定待测样本是否为NSCLC癌组织的产品中的应用；
所述检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器为检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂盒；
所述试剂盒包括miR-21嵌合探针、miR-210嵌合探针、miR-31嵌合探针、固定有探针A的聚苯乙烯微球、固定有探针B的聚苯乙烯微球、固定有探针C的聚苯乙烯微球；
所述miR-21嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列1；
所述miR-210嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列2；
所述miR-31嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列3；
所述试剂盒还包括荧光标记物SAPE、miR-21、miR-210和miR-31；
所述应用中，所述鉴定待测样本是否为NSCLC癌组织为如下标准：若所述待测样本的RNA中miR-21的表达量大于1478.3amol/μl，且miR-210的表达量大于2.49amol/μl，且miR-
31的表达量大于2.57amol/μl，则所述待测样本为或候选为NSCLC癌组织；若所述待测样本RNA中miR-21、miR-210和miR-31的表达量不满足上述标准，则所述待测样本不为或候选不为NSCLC癌组织。
2.检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在制备鉴定或辅助鉴定待测患者是否为NSCLC患者的产品中的应用；
所述检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器为检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂盒；
所述试剂盒包括miR-21嵌合探针、miR-210嵌合探针、miR-31嵌合探针、固定有探针A的聚苯乙烯微球、固定有探针B的聚苯乙烯微球、固定有探针C的聚苯乙烯微球；
所述miR-21嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列1；
所述miR-210嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列2；
所述miR-31嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列3；
所述试剂盒还包括荧光标记物SAPE、miR-21、miR-210和miR-31；
3.检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在制备诊断或辅助诊断待测患者是否为NSCLC患者的产品中的应用；
所述检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器为检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂盒；
所述试剂盒包括miR-21嵌合探针、miR-210嵌合探针、miR-31嵌合探针、固定有探针A的聚苯乙烯微球、固定有探针B的聚苯乙烯微球、固定有探针C的聚苯乙烯微球；
所述miR-21嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列1；
所述miR-210嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列2；
所述miR-31嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列3；
所述试剂盒还包括荧光标记物SAPE、miR-21、miR-210和miR-31；
4.检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在制备预测或辅助预测待测人或动物是否会患有NSCLC的产品中的应用；
所述检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器为检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂盒；
所述试剂盒包括miR-21嵌合探针、miR-210嵌合探针、miR-31嵌合探针、固定有探针A的聚苯乙烯微球、固定有探针B的聚苯乙烯微球、固定有探针C的聚苯乙烯微球；
所述miR-21嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列1；
所述miR-210嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列2；
所述miR-31嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列3；
所述试剂盒还包括荧光标记物SAPE、miR-21、miR-210和miR-31；
5.检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在制备预测或辅助预测待测患者是否会发生NSCLC复发的产品中的应用；
所述检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器为检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂盒；
所述试剂盒包括miR-21嵌合探针、miR-210嵌合探针、miR-31嵌合探针、固定有探针A的聚苯乙烯微球、固定有探针B的聚苯乙烯微球、固定有探针C的聚苯乙烯微球；
所述miR-21嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列1；
所述miR-210嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列2；
所述miR-31嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列3；
所述试剂盒还包括荧光标记物SAPE、miR-21、miR-210和miR-31；
6.检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂盒，为如下1)或2)：
1)鉴定或辅助鉴定待测样本是否为NSCLC癌组织的产品；
2)鉴定或辅助鉴定待测患者是否为NSCLC患者的产品；
所述试剂盒包括miR-21嵌合探针、miR-210嵌合探针、miR-31嵌合探针、固定有探针A的聚苯乙烯微球、固定有探针B的聚苯乙烯微球、固定有探针C的聚苯乙烯微球；
所述miR-21嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列1；
所述miR-210嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列2；
所述miR-31嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列3；
所述试剂盒还包括荧光标记物SAPE、miR-21、miR-210和miR-31；
所述试剂盒还包括记载如下标准的可读载体：若所述待测样本的RNA中miR-21的表达量大于1478.3amol/μl，且miR-210的表达量大于2.49amol/μl，且miR-31的表达量大于
2.57amol/μl，则所述待测样本为或候选为NSCLC癌组织；若所述待测样本RNA中miR-21、miR-210和miR-31的表达量不满足上述标准，则所述待测样本不为或候选不为NSCLC癌组织。
液相芯片miRNA检测试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种液相芯片miRNA检测试剂盒。
背景技术
[0002] 肺癌是目前全球头号癌症杀手，其发病率和死亡率呈逐年迅速上升趋势，而中国是世界上肺癌患者最多的国家。肺癌可分为NSCLC(非小细胞肺癌)和SCLC(Small cell lung cancer，小细胞肺癌)，其中NSCLC约占肺癌总数的80％，并可大致分为SCC(Squamous cell carcinoma，鳞状细胞癌)、AC(Adenocarcinoma，腺癌)和LCC(Large cell carcinoma，大细胞癌)。Ⅳ期NSCLC的5年生存率仅为10％，但Ⅰ期NSCLC的5年生存率则可达到80％左右，因此，如何对肺癌进行早期诊断成为了关键。目前，临床上使用肿瘤标志物进行体检，由于一种肿瘤标志物可以出现在多种肿瘤中，一种肿瘤也可以出现多种肿瘤标志物，因此，肿瘤标志物只能作为辅助检查项目。
[0003] microRNA(miRNA)是一类内源性非编码的小分子RNA，它们调节的基因超过半数位于肿瘤相关基因组区或脆性位点，一旦发生失常就会影响肿瘤的发生及发展，miRNAs在不同组织器官、不同病理类型及不同发病阶段的肿瘤中的表达具有特征性。大量研究结果表明，肺癌患者的癌组织、外周血、胸腔积液及痰液中均存在特异性表达的miRNAs，多达几十种miRNAs被证实与肺癌有关，但不同实验组之间结果不尽相同且可比性较差，这主要是由于miRNA的长度(small size)限制了其检测技术的发展，造成各课题组检测技术不同，内参也不同。常用的miRNA检测方法包括northern blot、RT-qPCR和microarray。northern blot是金标准，但操作起来费时费力；RT-qPCR虽灵敏度较高，但茎环引物设计复杂，且无法实现多重检测；microarray是高通量检测方法，但特异性和重复性较低，且价格昂贵，不适用于临床。另外，不同公司的芯片和RT-qPCR试剂盒在设计原理上存在不少差异，导致相互之间结果差异较大。
[0004] 液相芯片技术具有高通量、操作简便、不需要预处理和扩增的优点，且不同于固相芯片，它指标选择灵活，可根据需要自行组合，大大降低检测成本。Dacic S et al使用第一代FlexmiR对肺腺癌组织及癌旁组织中319种成熟miRNAs进行检测，发现miR-20a、miR-328、miR-34c和miR-18b在癌组织中表达比癌旁组织增高20倍以上，同时miR-32、miR-137和miR-342表达降低20倍以上。Markou A et al也使用同样的方法分析非小细胞肺癌(NSCLC)癌组织和癌旁组织中miRNAs表达谱，不同的是，癌组织中仅miR-21表达上调。Wang Y et al使用第二代FlexmiR选择性地检测了NSCLC癌组织和癌旁组织中的miR-21、miR-31、miR-222、miR-145和miR-126表达，发现癌组织中前三者表达增高，后二者表达降低。用qRT-PCR对以上结果进行验证，两种技术检测结果呈高度相关，证实了FlexmiR的可靠性。
发明内容
[0005] 本发明的一个目的是提供检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器的用途。
[0006] 本发明提供了miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在制备鉴定或辅助鉴定待测样本是否为NSCLC癌组织的产品中的应用。
[0007] 本发明另一个目的是提供检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器的用途。
[0008] 本发明提供了检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在制备鉴定或辅助鉴定待测患者是否为NSCLC患者的产品中的应用。
[0009] 本发明第三个目的是提供检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器的用途。
[0010] 本发明提供了检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在制备诊断或辅助诊断待测患者是否为NSCLC患者的产品中的应用。
[0011] 本发明第四个目的是提供检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器的用途。
[0012] 本发明提供了检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在制备预测或辅助预测待测人或动物是否会患有NSCLC的产品中的应用。
[0013] 本发明第五个目的是提供检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器的用途。
[0014] 本发明提供了检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在制备预测或辅助预测待测患者是否会发生NSCLC复发的产品中的应用。
[0015] 上述应用中，
[0016] 所述检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器为检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂盒；
[0017] 所述试剂盒包括miR-21嵌合探针、miR-210嵌合探针、miR-31嵌合探针、固定有探针A的聚苯乙烯微球、固定有探针B的聚苯乙烯微球、固定有探针C的聚苯乙烯微球；
[0018] 所述探针A能结合所述miR-21嵌合探针；
[0019] 所述探针B能结合所述miR-210嵌合探针；
[0020] 所述探针C能结合所述miR-31嵌合探针；
[0021] 所述miR-21嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列1；
[0022] 所述miR-210嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列2；
[0023] 所述miR-31嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列3；
[0024] 所述探针A的核苷酸序列为序列4；
[0025] 所述探针B的核苷酸序列为序列5；
[0026] 所述探针C的核苷酸序列为序列6。
[0027] 上述应用中，
[0028] 所述各嵌合探针5’端均标记荧光基团生物素；
[0029] 所述试剂盒还包括荧光标记物SAPE、miR-21、miR-210和miR-31；
[0030] 所述miR-21的核苷酸序列为序列7；
[0031] 所述miR-210的核苷酸序列为序列8；
[0032] 所述miR-31的核苷酸序列为序列9。
[0033] 本发明第六个目的是提供检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂盒。
[0034] 本发明提供的试剂盒，为如下1)或2)：
[0035] 1)鉴定或辅助鉴定待测样本是否为NSCLC癌组织的产品；
[0036] 2)鉴定或辅助鉴定待测患者是否为NSCLC患者的产品。
[0037] 上述的试剂盒中，所述试剂盒包括miR-21嵌合探针、miR-210嵌合探针、miR-31嵌合探针、固定有探针A的聚苯乙烯微球、固定有探针B的聚苯乙烯微球、固定有探针C的聚苯乙烯微球；
[0038] 所述探针A能结合所述miR-21嵌合探针；
[0039] 所述探针B能结合所述miR-210嵌合探针；
[0040] 所述探针C能结合所述miR-31嵌合探针；
[0041] 所述miR-21嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列1；
[0042] 所述miR-210嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列2；
[0043] 所述miR-31嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列3；
[0044] 所述探针A的核苷酸序列为序列4；
[0045] 所述探针B的核苷酸序列为序列5；
[0046] 所述探针C的核苷酸序列为序列6；
[0047] 所述各嵌合探针5’端均标记荧光基团生物素。
[0048] 上述的试剂盒中，所述试剂盒还包括荧光标记物SAPE、miR-21、miR-210和miR-31；
[0049] 所述miR-21的核苷酸序列为序列7；
[0050] 所述miR-210的核苷酸序列为序列8；
[0051] 所述miR-31的核苷酸序列为序列9。
[0052] 上述试剂盒还包括液相芯片检测仪Luminex 200机器。
[0053] 所述试剂盒还包括记载如下标准的可读载体：若所述待测样本的RNA中miR-21的表达量大于1478.3amol/μl，且miR-210的表达量大于2.49amol/μl，且miR-31的表达量大于2.57amol/μl，则所述待测样本为或候选为NSCLC癌组织；若所述待测样本RNA中miR-21、miR-210和miR-31的表达量不满足上述标准，则所述待测样本不为或候选不为NSCLC癌组织。
[0054] 本发明的实验证明，对26例不同期NSCLC肺癌患者肿瘤组织miRNAs进行表达量检测，发现miR-21、miR-210和miR-31可以作为标志组合物，用于判断是否为NSCLC肺癌患者，其预测准确率为88％。具有临床操作简便、高通量、可自由组合，绝对定量等特点，尤其能够对NSCLC肺癌进行早期诊断，增加治愈的成功率。
附图说明
[0055] 图1为NSCLC癌组织和良性病变肺组织中miRNAs的表达(amol/μl)，*P<0.05，**P<0.01；
[0056] 图2为NSCLC癌组织与癌旁组织中miRNAs的表达(amol/μl)。
[0057] 图3为ROC曲线。
[0058] 图4为检测的7个miRNA标准曲线。
具体实施方式
[0059] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0060] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0061] 实施例1、辅助检测NSCLC癌组织的标志物筛选及检测方法确定
[0062] 一、RNA的提取
[0063] 1、研究对象
[0064] 选取2013年6月-2014年3月期间深圳市人民医院胸外科经病理确诊，不同临床分期、分型且术前未接受放疗和化疗的原发性NSCLC肺癌患者26例，取手术切除的肿瘤生长活跃无坏死部位切除的癌组织1cm3左右以及距离癌组织0.5cm-2cm之间的癌旁组织1cm3左右；非肺癌人群的组织标本来自肺部良性病变17例(包括肺大疱5例、炎性假瘤6例、肺结核2例、
3
错构瘤2例、硬化性血管瘤2例)的手术切除肺病变组织1cm左右。病理分型由两位以上有经验的病理科专家一致诊断。入选的受检者均知情同意。
[0065] 2、试剂配制
[0066] (1)Rnase free ddH2O：999ml ddH2O中加入1ml DEPC，搅拌混匀，室温下过夜后，121℃25min高压蒸汽灭菌，分装后4℃封闭保存。
[0067] (2)1.5×TMAC杂交缓冲液：将5M TMAC 225ml，20％Sarkosyl solution 1.88ml，1M Tris-HCl(pH 8.0)18.75ml，0.5M EDTA(pH 8.0)3.0ml，Rnase free ddH2O 1.73ml混匀后室温保存。
[0068] (3)TE缓冲液:1M，PH＝8.0，5ml Tris-HCl Buffer，0.5M，PH＝8.0，1ml EDTA向烧杯中加入约400ml H2O均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存。
[0069] (4)Rnase A酶切反应液：将Rnase A用3M NaCl按1:500稀释，分装后-20℃保存。
[0070] 3、总RNA的提取
[0071] NSCLC肺癌患者癌组织、癌旁组织和非肺癌人群病变组织标本离体后10min内置于液氮罐内迅速冷冻后转移至-70℃冰箱保存。使用时先称取重量，用液氮研磨法将组织磨成粉末，按50～80mg/ml的分量加入RNAiso Plus，混匀后将混合液分装成1ml每管，提取上述26例NSCLC患者癌组织RNA、26例NSCLC患者癌旁组织RNA和17例非肺癌人群病变组织RNA。
[0072] 二、液相芯片miRNA检测
[0073] 1、探针设计及试剂的配置
[0074] 1)微球及其上探针序列和对应的嵌合探针序列
[0075] 购买7种聚苯乙烯微球 -TAGTM，7种 -TAGTM微球上的探针序列见表1；根据筛选出的NSCLC特异性miRNAs的序列(利用miRBase数据库查询)和-TAGTM微球上anti-TAG的序列，设计嵌合探针。嵌合探针的RNA端与检测样本miRNA的序列互补，嵌合探针的DNA端与对应微球探针互补，5’端标记生物素。
[0076] 表1为微球上探针序列和对应的嵌合探针序列
[0077]
[0078]
[0079] 2)嵌合探针混合工作液的配制
[0080] 嵌合探针混合工作液为将表1的miR-21、miR-210、miR-205、miR-125b、miR-155、miR-375、miR-31这7种miRNA对应的嵌合探针溶解于TE缓冲液中，且使每种嵌合探针的浓度为10fmol/μl，得到混合探针工作液，具体配置如下：
[0081] 将上述表1中的7种嵌合探针原管每种均用TE缓冲液溶解成100μM，使用时先将7种探针稀释成1μM的母液，再将每种探针母液1μl加入到93μl的TE缓冲液中，得到混合探针工作液，且混合工作液中每种探针的终浓度为10fmol/μl。每次实验需新鲜配制。
[0082] 3)miRNAs参比品混合工作液的配制
[0083] miRNAs参比品混合工作液为将人共合成的表1的miR-21、miR-210、miR-205、miR-125b、miR-155、miR-375、miR-31这7种miRNA溶解于TE缓冲液中，且使每种miRNA的浓度为
10pmol/μl，得到miRNAs参比品混合工作液。
[0084] 再用TE缓冲液将miRNAs参比品混合工作液依次倍比稀释为1pmol/μl，100fmol/μl，10fmol/μl，1fmol/μl，100amol/μl，10amol/μl，1amol/μl。
[0085] miRNAs参比品混合工作液具体配置如下：
[0086] 每种miRNAs mimic用TE buffer溶解成100μM，使用时将7种参比品每种1μl加入到3ul的TE buffer，得到miRNAs参比品混合工作液，使每种参比品浓度为10pmol/μl。每次实验新鲜配制。
[0087] 2、液相芯片miRNA检测
[0088] 1)待测RNA样本与嵌合探针的杂交反应
[0089] 将上述一获得的各总RNA用核酸测定仪测定RNA总量OD260/280在1.8-2.2，再稀释为800ng/μl待检。
[0090] 将稀释后RNA、上述1中的2)的嵌合探针混合工作液和1.5×TMAC杂交缓冲液混匀，杂交，得到杂交产物，即为miRNA-嵌合探针复合物。用Rnase free ddH2O作为空白对照，每次实验设两个空白对照，每个样本重复三次。
[0091] 上述杂交反应的杂交反应体系如表2所示：
[0092] 表2为杂交反应体系
[0093]
[0094] 上述杂交具体如下：
[0095] 将表2的杂交反应体系加入到96孔PCR板中后封膜，漩涡混匀5s，然后快速离心2s使混合反应液都沉到管底,把96孔PCR板放入PCR仪中进行杂交反应，得到杂交产物，即为miRNA-嵌合探针复合物。
[0096] PCR仪反应程序：90℃3min，80℃递减至60℃，-1℃/6min(即80℃6min，79℃6min，78℃6min……60℃6min)，37℃HOLD。
[0097] 2)微球与miRNA-嵌合探针复合物的杂交
[0098] 微球反应液的配置：每种 -TAGTM微球浓度为2.5×106个/ml，而每个反应体系需要每种微球的数目为2500个。假设样本数量为n，参比品数量为6，空白对照为2，则一共为n+8个反应体系。具体如下：将表1的miR-21、miR-210、miR-205、miR-125b、miR-155、miR-375、miR-31这7种miRNA对应的7种 -TAGTM微球每种(n+8)μl混合，在磁性分离板上放置两分钟使微球沉到官底，弃上清，再用[(n+8)×4]μl 1.5×TMAC杂交缓冲液重悬微球，漩涡混匀后即为微球反应液。
[0099] 将4μl微球反应液加入上述1)得到的miRNA-嵌合探针复合物所在96孔板的各孔中(使每个孔中需要每种微球的数目为2500个)，封膜，漩涡混匀15s，然后快速离心2s使混合反应液都沉到管底，37℃孵育杂交30min，得到杂交产物，即为微球-miRNA-嵌合探针复合物。
[0100] 3)酶切
[0101] 上述2)得到的微球-miRNA-嵌合探针复合物所在96孔板的各孔中加入2.5μl配好的Rnase A酶切反应液，轻柔混匀，封膜后30℃孵育30min。
[0102] 4)洗板
[0103] 3)的孵育完成后，将96孔板置于磁性分离板上2min，用移液枪小心移去上清。加入200μl1.5×TMAC杂交缓冲液重悬微球，然后将96孔板再次置于磁性分离板上2min，用移液枪小心移去上清。
[0104] 5)微球-miRNA-嵌合探针复合物的荧光标记
[0105] SAPE溶液：将SAPE(链亲和素偶联的藻红素，产品目录号：S-866规格：2ML，Invitrogen公司)用TE缓冲液按1:500(2ng/μl)进行稀释，使SAPE的浓度为2ng/μl。每次实验需新鲜配制。
[0106] 荧光标记：向上述4)处理后的96孔板每孔加入75ul SAPE溶液重悬微球，漩涡混匀15s，快速离心2s，然后封膜，室温下水平振荡30min，实现荧光标记，得到SAPE-微球-miRNA-嵌合探针复合物。
[0107] 6)洗板
[0108] 上述5)的孵育完成后，将96孔板置于磁性分离板上2min，用移液枪小心移去上清。加入200μl杂交缓冲液重悬微球，然后将96孔板再次置于磁性分离板上2min，用移液枪小心移去上清。重复两次。最后加入100μl1.5×TMAC杂交缓冲液重悬微球，小心避免气泡的产生。
[0109] 7)仪器检测
[0110] 使用Luminex 200机器和xPONENT 3.1软件进行数据的检测和标准曲线的绘制。主要参数设置：吸取反应液体积：80μl；Time out：60s；DD gate：13500；High PMT；Standard：6。
[0111] 用Rnase free ddH2O作为空白对照，每次实验设两个空白对照，每个样本重复三次。
[0112] 将上述1得到的6种浓度miRNAs参比品混合工作液采用上述2中的1)-7)方法进行检测，作标准曲线(图4)。
[0113] 根据上述各RNA检测结果和标准曲线，得出各样本RNA中的各miRNA的表达量，结果如表3、图1和图2所示，图1是癌组织和病变组织的对比，图2是癌组织和癌旁组织的对比；可以看出，与病变组织或与癌旁组织相比，miR-21、miR-210、miR-205、miR-125b、miR-155、miR-375、miR-31的表达量均提高。
[0114] 表3为癌组织、癌旁组织和肺部良性病变组织中miRNAs的表达量(amol/μl)[0115]
[0116] Note：miRNA的表达量以中位数和四分位间距表示,与癌旁组织比较*P<0.05，**P<0.01；与肺部良性病变组织比较#P<0.05，##P<0.01；“—”代表无法检测。
[0117] 根据上述表2中的表达量绘制NSCLC肺癌患者癌组织miR-21、miR-205、miR-125b、miR-155、miR-31、miR-375、miR-210的工作曲线(Receiver Operator Characteristic Curve，ROC，图3)，曲线下面积(Area Under the Curve，AUC)判断其临床诊断价值。AUC越接近1，证明该指标的诊断价值越大。
[0118] 统计AUC值结果如表4所示，AUC值大于0.8的有miR-21、miR-210和miR-31三种miRNAs。因此，用于诊断NSCLC最佳的前三种miRNAs为miR-21、miR-210和miR-31。
[0119] 表4为miRNAs表达在NSCLC肺癌诊断中的价值
[0120]
[0121] 因此miR-21、miR-210和miR-31的表达量辅助鉴定待测组织是否为NSCLC癌组织，具体如下：
[0122] 提取待测组织的RNA，用miR-21的 -TAGTM微球、miR-210的 -TAGTM微球、miR-31的 -TAGTM微球、miR-21嵌合探针(序列1)、miR-210嵌合探针(序列2)和miR-31嵌合探针(序列3)与RNA杂交，得到杂交产物，将杂交产物进行液相芯片检测，得到待测组织RNA中miR-21、miR-210和miR-31的表达量；
[0123] 若miR-21、miR-210和miR-31的表达量满足如下标准：待测组织RNA中miR-21的表达量大于1478.3amol/μl，且miR-210的表达量大于2.49amol/μl，且miR-31的表达量大于2.57amol/μl，则待测组织为或候选为NSCLC癌组织；若待测组织RNA中miR-21、miR-210和miR-31的表达量不满足上述标准，则待测组织不为或候选不为NSCLC癌组织。
[0124] 实施例2、miR-21、miR-31、miR-222组合标志物在检测NSCLC癌组织中的应用[0125] 一、RNA的提取
[0126] 提取实施例1的一中的26例NSCLC肺癌患者癌组织和癌旁组织以及17例肺部良性病变癌患者病变组织的RNA。
[0127] 二、液相芯片miRNA检测
[0128] 按照实施例1的二的方法用miR-21的 -TAGTM微球、miR-210的-TAGTM微球、miR-31的 -TAGTM微球、miR-21嵌合探针(序列1)、miR-
210嵌合探针(序列2)和miR-31嵌合探针(序列3)与上述一的各RNA杂交，得到杂交产物。
[0129] 将杂交产物进行液相芯片检测，根据检测得到的荧光强度与实施例1二中的标准曲线计算各个待测组织RNA中miR-21、miR-210和miR-31的表达量；
[0130] 根据下述判断待测组织是否为NSCLC癌组织：若miR-21、miR-210和miR-31的表达量满足如下标准：待测组织RNA中miR-21的表达量大于1478.3amol/μl，且miR-210的表达量大于2.49amol/μl，且miR-31的表达量大于2.57amol/μl，则待测组织为或候选为NSCLC癌组织；若待测组织RNA中miR-21、miR-210和miR-31的表达量不满足上述标准，则待测组织不为或候选不为NSCLC癌组织。
[0131] 上述各组织结果如下：
[0132] 26例NSCLC肺癌患者癌组织中，有21例NSCLC肺癌患者癌组织满足上述标准：miR-21表达量大于1478.3amol/μl，且miR-210的表达量大于2.49amol/μl，且miR-31的表达量大于2.57amol/μl，判断为NSCLC癌组织(临床检测为NSCLC癌组织)；有5例NSCLC肺癌患者癌组织不符合上述标准，判断其不为NSCLC癌组织(临床检测为NSCLC癌组织)。根据实际组织样本临床检测结果，本发明方法判断准确率达81％。
[0133] 26例NSCLC肺癌患者癌旁组织，有26例NSCLC肺癌患者癌组织不符合上述标准，判断其不为NSCLC癌组织(临床检测为NSCLC癌旁组织)；有26例NSCLC肺癌患者癌组织满足上述标准，判断其为NSCLC癌组织(临床检测为NSCLC癌旁组织)。根据实际组织样本临床检测结果，本发明方法判断准确率达100％。
[0134] 17例肺部良性病变癌患者病变组织中，有13例患者病变组织不符合上述标准，判断其为NSCLC癌组织(临床检测为肺部良性病变癌患者病变组织)；有4例患者符合上述标准(临床检测为肺部良性病变癌患者病变组织)。根据实际组织样本临床检测结果，本发明方法判断准确率达76％。
[0135] 上述方法和判断标准也可以用来辅助鉴定待测患者是否为NSCLC患者或辅助鉴定待测组织样本是否为NSCLC癌组织。
