一种控制水稻叶片直立性发育的基因及其应用

摘要

本发明提供了一种控制禾本科作物株型建成的基因及其应用，本发明的公开的基因CYC U4;1（Os10g41430）特异在水稻叶枕表达（相信也特意在其他禾本科作物表达），其CDS序列为SEQ ID NO.2所示，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。本发明还提供了该基因的启动子序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。将CYC U4;1的启动子和全长CDS克隆到pCAMBIA1301上，转入日本晴中，所获得的转基因系均表现为茎叶夹角比野生型要小，因此通过基因工程技术提高或减弱CYC U4;1基因的表达量能够控制植物株型发育，从而改善植物株型提高种质密度。

权利要求

1.SEQ ID NO.3所示的蛋白质或编码SEQ ID NO.3所示蛋白质的基因在控制水稻植物叶片直立性发育中的应用。

2.SEQ ID NO.3所示的蛋白质或编码SEQ ID NO.3所示蛋白质的基因在改善水稻品种的株型和提高单位面积的种植密度中的应用。

3.SEQ ID NO.3所示的蛋白质或SEQ ID NO.2所示基因和SEQ ID NO.1所述的启动子在减小水稻茎叶夹角中的应用。

4.SEQ ID NO.3所示的蛋白质或SEQ ID NO.2所示基因和SEQ ID NO.1所述的启动子在水稻株型改良中的应用。

说明书

一种控制水稻叶片直立性发育的基因及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种控制水稻叶片直立性发育的基因，采用反向遗传学的方法，从水稻叶片、叶枕特异基因表达芯片分析中筛选特异在叶枕部位表达的基因，利用pCYCU4-GUS转基因系证明CYC U4；1的启动子特异在叶枕处表达；通过转基因提高CYC U4；1的表达量和RNAi技术降低CYC U4；1的表达量均证明CYC U4；1基因为控制水稻叶片直立性发育的基因。本发明还涉及含有该基因或其同源基因的载体和涉及利用该基因或其功能类似物调控植物叶片直立性在农业生产中的应用。

背景技术

[0002] 作物的株型发育是高产育种的关键性状。叶片直立性(茎叶夹角的大小)是株型发育的重要性状之一，合适的茎叶夹角能使我们通过提高作物的田间种植密度，进而促进光能利用率，增加作物产量(Sakamoto et al.,2006；Sinclair et al.,1999)。叶枕是影响叶片直立性发育的关键部位，叶枕的发育程度直接影响茎叶夹角的大小。因此，发现和利用影响叶片直立性(茎叶夹角大小)的关键基因的最终目是改进水稻株型，促进分子设计育种，提高水稻单位面积产量。

[0003] 单子叶植物的叶枕部位是连接叶片和叶鞘的中间枢纽，是形成茎叶夹角的基础结构。叶枕作为机械组织，当叶片和叶鞘伸长完毕后，促使叶片向远轴方向弯曲,所以叶枕区域的发育与叶片直立性密切相关(Hoshikawa,1989)。油菜素甾醇的合成和信号通路在调控单子叶植物茎叶夹角发育中具有重要而独特的作用，但其下的细胞学和分子机制还不清楚。已报道的BR合成相关的突变体d2、dwarf4、,d11和brd2均表现为茎叶夹角变小，叶片直立(Li et al.,2013；Hong et al.,2003,2005；Tanabe et al.,2005)。BR信号通路中的正调控因子的缺失突变体也表现为茎叶夹角变小，叶片直立。如受体突变体d61，dlt,d1和tud1(Yamamuro et al.,2000；Tong et al.,2012；Oki et al.，2009；Hu et al.,2013)。利用同源克隆的方法得到的OsBAK1、OsGSK2的转基因植株的茎叶夹角大小也发生变化(Li et al.,2009；Tong et al.,2012)。利用RNAi技术抑制水稻BR信号通路下游的正调节因子OsBZR1基因的表达，也会促进叶片直立(Bai et al.,2007)。而BR信号通路的负调节因子LIC的功能获得型突变体lic-1也表现为茎叶夹角变小，叶片直立(Zhang et al.,2012)。而被OsBZR1调节的ILI1的功能获得型突变体ili1-D,由于BR信号被放大，则表现为叶夹角增大(Zhang et al.,2009)。另外，水稻OsBZR1的靶基因OsIBH1也直接参与了对水稻叶片直立性的调节(Zhang et al.,2009)；外施BR处理导致野生型和BR合成途径突变体的叶片倾角变大，而BR信号突变体如受体突变体d61的叶片倾角几乎不受外源BR的影响。

[0004] 除了油菜素甾醇途径，其他信号途径也参与了茎叶夹角的调控。虽然BR相关途径基因在参与调控水稻叶片倾角变化方面具有显著作用，但是还存在其它独立途径参与此生物性状的调控。负调控赤霉素(GAs)信号的基因SPINDLY(SPY)的表达量下降后茎叶夹角增大(Shimada et al.,2006)。而生长素信号途径负调节因子Aux/IAA家族成员OsIAA1过表达植株茎叶片夹角变大(Song et al.,2009)。调控生长素体内平衡的编码生长素偶联氨基酸的合成酶基因LC1通过调节叶枕部位细胞伸长决定水稻叶夹角大小(Zhao et al.，2013)。水稻rice leaf inclination2(LC2)，一个VIN3-类似蛋白，突变后也能使茎叶夹角变大(Zhao et al.，2010)。MAPKKK家族C组成员的基因ILA1在叶枕的维管束中高表达，其基因T-DNA插入突变引起叶枕部位细胞壁主要成分纤维素和木聚糖含量下降，从而导致叶枕部位机械强度降低，叶夹角增大(Ning et al.，2011)。水稻中Loose Plant Architecture1(LPA1)基因的突变体lpa1表现为株型松散，其分蘖角和茎叶夹角均增大(Wu et al.,
2013)。

[0005] 育种实践证明，水稻茎叶夹角与产量密切相关。利用BR相关途径的基因作为改良水稻株型的靶基因，在生产上具有广阔的应用前景。例如，Morinaka等(2006)利用共抑制的策略，通过导入水稻肌动蛋白启动子驱动的OsBRI1的胞内区(OsACTIN::OsBRI1-KD)，部分抑制水稻内源OsBRI1的表达，从而在后代中分离出直叶型的转基因系；据估算它们通过密植可分别增产约35％和26％。Sakamoto等(2006)通过田间实验证实合理密植水稻BR合成途径OsDWARF4的突变体可增产达32％。通过对剑叶角度与主穗产量进行遗传剖析，应用244个珍汕97B/密阳46RIL群体，在1、3、5和11染色体上共检测到5个控制剑叶角度的QTL，其中在第1染色体RM24-RM294A区间同时检测到了控制剑叶角度(FLA)和结实率(SF)的QTL，且加性效应方向相反，表明剑叶角度与产量呈负相关，适当减小水稻剑叶夹角有利于结实率的提高，并最终提高产量(zhang et al.,2008)。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种控制水稻叶片直立性发育的基因CYC U4；1，该基因从水稻叶枕处特异表达芯片中鉴定并分离克隆，该基因包含有SEQ.ID.No.1所示的启动子区域、具有SEQ ID No.2核苷酸所示的CDS序列，该基因编码SEQ.ID.No.3所示的氨基酸序列。

[0007] 本发明的另一个目的是提供CYC U4；1基因在控制水稻叶片直立性中的应用，通过CYC U4；1基因启动子(SEQ ID.NO：1所示序列)驱动CYC U4；1基因在水稻植株中超量表达可达减小茎叶夹角，从而改善水稻品种的株型和提高单位面积的种植密度。

[0008] 为了实现上述目的，本发明采取以下技术措施：

[0009] 发明人构建水稻叶片和叶枕部位的基因特异表达芯片，通过反向遗传学的方法，从芯片的差异表达基因中挑选在叶枕处特异表达的基因CYC U4；1，利用real-time qRT-PCR验证了CYC U4；1在叶枕处表达的特异性。

[0010] 一种控制水稻叶片直立性发育的基因CYC U4；1，利用下述方法得到：

[0011] 反应体系的总体积为50μl，模板为日本晴CDNA 1ul(约50ng)、10×KOD酶反应缓冲液5μl、25mM MgCL2 2μl、5mM dNTP 5μl、5uM引物5μl(采用分步PCR方式，第一次使用引物CYCU4-U和CYCU4-L-1，第二次使用引物CYCU4-U和CYCU4-L-2，每条引物均为2.5μl)、1μl KOD酶，加ddH2O(无菌去离子水)至50μl。

[0012] 反应程序为：94℃变性5min，94℃30s、55℃1min、68℃2min 35cycles，68℃延伸10min。

[0013] 所述引物为：

[0014] CYCU4-U:ATATgagctcATGAGGACGGGGGAGGTGGCGGAGGCGGTG；

[0015] CYCU4-L-1:CGTCTTTGTAGTCGACGGCGAGCTGATGCTGCTGCTG；

[0016] CYCU4-L-2：ATATtctagactaCTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGACGGCGAG。

[0017] 最终获得包含有SEQ ID NO.2所述核苷酸的基因序列，该基因编码的蛋白质为SEQ ID NO.3所示。

[0018] 本发明的保护内容还包括SEQ ID NO.3所示氨基酸序列对应的核苷酸序列，还包括SEQ ID NO.3所示序列经过改造修饰的具有相同功能的蛋白。

[0019] CYC U4；1基因在控制水稻叶片直立性中的应用，包括将CYC U4的启动子和全长CDS克隆到pCAMBIA1301上，转入日本晴中，所获得的转基因系均表现为茎叶夹角比野生型(日本晴)变小，因此可通过该方法减小茎叶夹角，以提高种植密度。

[0020] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：

[0021] 1、CYC U4；1是一个在水稻苗期只在叶枕部位特异表达的基因，这使利用该基因只改变作物茎叶夹角大小，而不影响其它性状成为可能。

[0022] 2、CYC U4；1是一个改变茎叶夹角大小的有效基因，它可以通过直接影响叶枕处的特异类型细胞分裂，进而改变作物的茎叶夹角大小。

[0023] 3、目前，对油菜素甾醇调控叶片直立性进而提高作物产量的分子机制并不清楚，该基因揭示了其介导的油菜素甾醇调控叶片直立性的分子机制。

附图说明

[0024] 图1为Realtime qRT-PCT验证CYC U4；1在水稻叶枕中特异表达。

[0025] 图2为pCYCU4：：GUS转基因水稻GUS染色结果。

[0026] 图3为pCYCU4::CYC U4；1转基因水稻幼苗和成熟期表型和转基因的表达水平。

[0027] 图4为RNAi-CYC U4；1转基因水稻幼苗和成熟期表型和基因表达水平。

[0028] 图5为多个独立的pCYCU4：：CYCU4；1和RNAi-CYC U4；1转基因株系的表型和表达量分析。

具体实施方式

[0029] 本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或生物材料，如未特别说明，均已公开。

[0030] 实施例1：

[0031] 一种控制水稻叶片直立性发育的基因CYC U4；1的获得：

[0032] 发明人构建水稻叶片和叶枕部位的基因特异表达芯片，通过反向遗传学的方法，从芯片的差异表达基因中挑选在叶枕处特异表达的基因CYC U4；1，利用real-time qRT-PCR验证了CYC U4；1在叶枕处表达的特异性。具体如下：

[0033] 一种控制水稻叶片直立性发育的基因CYC U4；1，利用下述方法得到：

[0034] 反应体系的总体积为50μl，模板为日本晴CDNA 1ul(约50ng)、10×KOD酶反应缓冲液5μl、25mM MgCL2 2μl、5mM dNTP 5μl、5uM引物5μl(采用分步PCR方式，第一次使用引物CYCU4-U和CYCU4-L-1，第二次使用引物CYCU4-U和CYCU4-L-2，每条引物均为2.5μl)、1μl KOD酶，加ddH2O(无菌去离子水)至50μl。

[0035] 反应程序为：94℃变性5min，94℃30s、55℃1min、68℃2min 35cycles，68℃延伸10min。

[0036] 所用引物如下：

[0037] CYCU4-U:ATATgagctcATGAGGACGGGGGAGGTGGCGGAGGCGGTG；

[0038] CYCU4-L-1:CGTCTTTGTAGTCGACGGCGAGCTGATGCTGCTGCTG；

[0039] CYCU4-L-2：ATATtctagactaCTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGACGGCGAG。

[0040] 最终获得包含有SEQ ID NO.2所述核苷酸的CYC U4；1基因序列，该基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。

[0041] Real time qRT-PCT验证CYC U4；1在水稻叶枕中特异表达：

[0042] 生长1周的水稻日本晴苗，分别取叶片和夹角，利用Tiangen RNApre Plant Kit(Tiangen)提取总RNA，然后利用Takara PrimeScript First-strand cDNA synthesis kit(TaKaRa)合成第一链cDNA，然后利用实时定量PCR检测叶片和叶枕中的CYCY U4；1的相对表达量。实时定量PCR引物：CYCU4；1:R-TGAGGTGGACTTCCTCTTTG；F-CCAGGTAGGTCATCTCGCTC。发现基因CYC U4；1在叶枕处特异性表达(图1)。

[0043] 实施例2：

[0044] CYC U4；1基因在控制水稻叶片直立性中的应用，应用过程如下：

[0045] 1)植物表达载体pCYCU4；1-GUS的构建

[0046] 扩增CYC  U4；1启动子区，利用HindIII/BamH1酶切位点将片段克隆到pCAMBIA1300GN GUS(Ren Z H,Gao J P,Li L G,et al.A rice quantitative trait locus for salt tolerance encodes a sodium transporter[J].Nature genetics,2005,37(10):1141-1146.)载体上。

[0047] 所述的CYC U4；1启动子区通过以下方式获得：

[0048] 反应体系的总体积为50μl，模板为日本晴基因组DNA1ul(约50ng)、1×KOD酶反应缓冲液5μl、25mM MgCL2 2μl、5mM dNTP 5μl、5uM引物5μl(引物pCYCU4-U和pCYCU4-L分别2.5μl)、1μl KOD酶，加ddH2O(无菌去离子水)至50μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃30s、
55℃1min、68℃2min 35cycles，68℃延伸10min。

[0049] 所用引物如下：

[0050] pCYCU4-U:atatAAGCTTacttgtactacctcattggcacaggcac；

[0051] pCYCU4-L：atatGGATCCcgatcgctcgccacgaggaggaagg。

[0052] 最终获得含有SEQ.ID.No.1所示的CYC U4；1基因启动子区域。

[0053] 2)植物表达载体pCYCU4::CYC U4；1的构建

[0054] 利用分步法先将CYC U4；1启动子区(启动子区的扩增方法同步骤1))，利用HindIII/BamH1酶切位点将片段克隆到pCAMBIA1301，获得pCAMBIA1301-pCYCU4；1，然后再将连有FLAG标签的CYC U4；1全长cDNA(SEQ ID NO.2所示)利用Sac1/Xba1克隆到pCAMBIA1301-pCYCU4；1上，获得植物表达载体pCYCU4::CYC U4；1，转入日本晴中。

[0055] 3)植物表达载体RNAi-CYC U4；1的构建

[0056] 将CYC U4；1(345-639bp)利用Kpn1/BamH1和Sac1/Spe1酶切位点克隆到RNAi载体pTCK303上，转入日本晴中。

[0057] 4)水稻遗传转化

[0058] 步骤1)-3)中的水稻转化均采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，具体如下：

[0059] ①愈伤诱导。将水稻种子去壳，取饱满清亮的籽粒先用70％乙醇浸泡1min，无菌水冲洗1-2次；再用含2％活性氯的NaClO溶液(40ml含>5.2％活性氯的NaClO溶液加60ml水)，加1-3滴Tween 20，浸泡30min以上(一般40min，最长可至1h)。不时摇动，然后用无菌水冲洗4-5次。倒在灭菌的平板和滤纸上吸干，约1h左右。将之置入N6D固体培养基上(10粒/25ml/瓶)，种胚朝上或接触培养基，28℃，暗培养25～30d。N6D2培养基：N6盐分和维生素,0.5g/l酪蛋白水解物,30g/l蔗糖,2mg/l 2,4-D,2.5g/l Phytagel(Sigma),pH5.8。

[0060] ②农杆菌的培养及其与水稻愈伤组织的共培养。取灭菌小勺刮取农杆菌，用勺背面将菌体贴在管壁轻轻拍散，OD600＝0.8～1.0。将前培养的愈伤在无菌滤纸上晾一下，然后集中至一个平皿一次性转入菌液中，轻轻转动离心管使菌液均匀分布，静置时间约15～20min。将菌液倒出，愈伤在无菌滤纸上放约1.5h,保证菌液吸干，接至1/2N6D AS中，20℃、暗培养2～3天，看到愈伤与培养基接触部分有菌膜，就可以除菌了。1/2N6D AS培养基：
N6D2,10g/l葡萄糖,100～400μmol/l乙酰丁香酮(用时现加),pH5.2。

[0061] ③农杆菌的去除。将共培养的愈伤装入50ml的离心管，用无菌水清洗3次以上，至液体比较清亮。倒出无菌水，N6D+Cn500mg/L(或AP500ml/L)，100rpm,15-20min,2-3次。将愈伤倒在无菌滤纸上吸干2h左右，视情况而定。将干燥的愈伤转入N6D-AS中，加头孢霉素Cn250mg/L，28℃，暗培养7～10d。

[0062] ④愈伤组织的筛选。挑出没被农杆菌污染的愈伤，第一次加Cn250mg/L和Hn(50mg/L),15～20d。第二次同上，不加Cn，加潮霉素Hn，把所有的愈伤全部再转一次，15～20d。第三次选出新的愈伤，用Hn筛选，15～20d。次数部用一定按上述安排，但应保证愈伤在Hn上筛选的时间至少45d以上，第三次挑出的新长出的愈伤最好筛选20d。N6D筛选培养基：N6D+Cn250mg/L+Hn50mg/L,PH＝5.8～5.9。

[0063] ⑤分化和生根。将第四次筛选的全部愈伤组织移入MS中，Hn 50mg/L，暗培养，预分化(PH 5.9)12～15d。选出长势好的新鲜的愈伤，移入MS(PH 6.0)中，光培养15～20d，可看到有绿芽长出，一般15d换一次培养基。选长出1cm以上的绿芽，剥去周围多余的愈伤，剪去根(可留约0.5cm长)移入试管中，1/2MS生根培养。MS分化培养基：MS盐分和维生素,2g/l酪蛋白水解物,30g/l蔗糖,25g/L山梨醇，2mg/l 6-BA,0.5mg/l NAA,0.2mg/l玉米素(Zeatin),0.5mg/l KT,3.0g/l Phytagel,pH5.8,50mg/l潮霉素B,200mg/l头孢霉素；1/2MS生根培养基：1/2MS盐分,MS维生素,30g/l蔗糖,1mg/l多效唑，0.5mg/l NAA,50mg/l潮霉素,2.5g/l Phytagel,pH5.8。

[0064] 5)移栽、表达量鉴定和表型分析。

[0065] 将生根的转基因植株每个遗传构建40个系，移栽温室，取叶片进行realtime qRT-PCR表达量鉴定和GUS染色分析。RNAi-CYCU4；1:R-GTCGCCTACATCTACCTC；F-GATAATTCATCTCCATCAAGC。

[0066] 6)结果：

[0067] (1)将获得的载体转入水稻日本晴中，利用pCYCU4：：GUS转基因水稻报告系统表明CYC U4；1主要在叶枕部位表达(图2)。

[0068] (2)将CYC U4；1的启动子和全长CDS克隆到pCAMBIA1301上，转入日本晴中，所获得的转基因系均表现为茎叶夹角比野生型(日本晴)变小(图3)。说明CYC U4；1具有控制水稻叶片直立性发育(茎叶夹角大小)的功能

[0069] (3)将CYC U4；1(345-639bp)克隆到RNAi载体pTCK303上，在水稻日本晴中做RNAi(RNA interference)实验，结果发现成功被RNAi的转基因水稻的茎叶夹角均比野生型(日本晴)大(图4)。

[0070] (4)通过获得的多个独立的pCYCU4：：CYCU4；1和RNAi-CYC U4；1转基因株系的表型和表达量分析，表明CYC U4；1的表达量与水稻夹角的大小相关(图5)。