一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法

摘要

本发明属于微生物技术领域，涉及一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法；包括以下步骤：（1）培养基及显色液的配制：所用的培养基为含色氨酸浓度0.5‑2 g/L的改良的R2A分离鉴定培养基，生长素显色液为2 mL的0.5 M氯化铁溶液以及98 mL的体积分数为25~35%的高氯酸混匀；（2）植物组织的预处理：用体积分数为70~75%的乙醇和5~8%的次氯酸钠溶液分别浸泡后，用蒸馏水冲洗；（3）产生长素内生细菌的鉴定；本发明将分离培养基与产生长素鉴定培养基改良整合，在培养基中添加生产生长素的前体色氨酸，在分离菌株后立即施用生长素显色液，在5~10 min内快速辨别出产生长素的内生细菌；简化鉴定工序，操作方便，缩短时间，是一种能简单、快速、有效鉴定产生长素内生菌的方法。

权利要求

1.一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）培养基及显色液的配制：

配制含有不同色氨酸浓度的改良的R2A分离鉴定培养基和生长素显色液；其中改良的R2A分离鉴定培养基每1L含0.5~2g色氨酸；

（2）植物组织的预处理：

选取生长良好的植物组织用蒸馏水冲洗干净后，置于无菌操作台中进行植物组织的表面消毒；然后用剪刀将植物组织边缘剪去，露出新鲜切口，并将切口贴在已倒好的改良R2A分离鉴定培养基上，将培养皿封口放入30 ℃的培养箱中暗培养；

（3）产生长素的内生细菌的分离与快速鉴定：

将植物组织切口附近生长出的单一植物内生细菌菌落标上序号，用接种环蘸取不同序号菌体，用划线培养法得到单菌落；之后立即在长内生细菌的植物组织切口周围喷施生长素显色液，在30 ℃中进行暗反应，观察周围有粉红色物质产生的菌落，此即是可产生长素的内生细菌；

步骤（1）中所述的改良的R2A分离鉴定培养基配方如下：称取0.5 g酵母提取物、0.5 g胰蛋白胨、0.5 g酪蛋白酸水解物、0.5 g葡萄糖、0.5 g可溶性淀粉、0.3 g磷酸二氢钾、0.024 g无水硫酸镁、0.3 g丙酮酸钠、15 g琼脂粉、0.5 2 g色氨酸，用双蒸水定容至1 L，并调pH至~

7.2，配成改良的R2A分离鉴定培养基，经115℃高压灭菌15 min后，分装倒入无菌培养皿中，冷却备用。

2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的生长素显色液按以下方法配制：2 mL的0.5 M氯化铁溶液以及98 mL的体积分数为25 35%的高氯酸充分混匀。

~

3.根据权利要求1所述的一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法，其特征在于，步骤（2）中所述的植物组织的表面消毒具体操作为：用体积分数为70 75%的乙醇浸泡消毒~约1 min，并不断搅拌，倒掉乙醇，加入体积分数为5 8%的次氯酸钠溶液浸泡约6 10 min，并~ ~不断震荡，倒掉次氯酸钠溶液，用灭菌蒸馏水冲洗后，置于无菌培养皿中。

说明书

一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法

技术领域

[0001] 本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法。

背景技术

[0002] 大量研究证明有些植物内生细菌能够通过生物固氮、产生植物激素等方式，促进宿主植物对营养物质的吸收并促进宿主植物生长发育及其他生理活动（（1）Ansari, M. W., D. K. Trivedi, et al. (2013). A critical review on fungi mediated plant responses with special emphasis to Piriformospora indica on improved production and protection of crops. Plant Physiology and Biochemistry 70: 403-410.；（2）Rout, M. E. and T. H. Chrzanowski (2009). The invasive Sorghum halepense  harbors endophytic N2-fixing  bacteria and alters soil biogeochemistry. Plant and Soil 315(1-2): 163-172.；（3）Rout, M. E., T. H. Chrzanowski, et al. (2013). Bacterial Endophytes Enhance Competition by Invasive Plants. American Journal of Botany 100(9): 1726-1737.；（4）Waqas, M., A. L. Khan, et al. (2012). Endophytic Fungi Produce Gibberellins and Indoleacetic Acid and Promotes Host-Plant Growth during Stress. Molecules 17(9): 10754-10773.）。

[0003] 因此，现如今，越来越多的学者开始分离筛选植物内生细菌，并研究其生物功能。其中，能够产生促进植物生长的生长素的内生细菌受到包括农业在内众多研究领域的关注。通常，对产生长素的植物内生菌进行筛选的方法需经过分离、纯化培养、再活化、发酵、显色鉴定等过程。其中从再活化、发酵到最后的混合显色鉴定，这个过程极其繁琐，中间需更换多次不同成分的培养基及复杂的取样步骤，而且此过程菌体生长缓慢，往往会消耗大量时间（约5 10天）。因此，传统的植物内生细菌产生长素菌株的筛选方法既繁琐又需耗费~
大量时间。

[0004] 那么，一种能够快速、有效地鉴定产生长素的植物内生菌的方法在农业生产及相关科学研究中很有必要。本发明提出了一种简单直观且快速的鉴定产生长素的植物内生细菌的方法，有目的地将能产生生长素的植物内生菌快速分离鉴定出来，能够大大缩短其研究周期、实验成本，使之能尽快被应用到农业作物等实际生产中，能有效提高作物产量，从而极大促进农业生产水平。

发明内容

[0005] 本发明提出了一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法，能在短时间内有效鉴定出产生长素的植物内生细菌。本发明具有针对性强、周期短的特点。

[0006] 本发明的技术方案通过以下方式实现的：

[0007] 一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法，包括以下步骤：

[0008] （1）培养基及显色液的配制：

[0009] 配制含有不同色氨酸浓度的改良的R2A分离鉴定培养基，具体配方如下：称取0.5 g酵母提取物、0.5 g胰蛋白胨、0.5 g酪蛋白酸水解物、0.5 g葡萄糖、0.5 g可溶性淀粉、0.3 g磷酸二氢钾、0.024 g无水硫酸镁、0.3 g丙酮酸钠、15 g琼脂粉、0.5 2 g色氨酸，用双蒸水~定容至1 L，并调pH至7.2，配成改良的R2A分离鉴定培养基，经115 ℃高压灭菌15 min后，分装倒入9 cm的无菌培养皿中，冷却备用。

[0010] 配制生长素显色液：2 mL的0.5 M氯化铁溶液以及98 mL的体积分数为25 35%的高~氯酸充分混匀。

[0011] （2）植物组织的预处理：

[0012] 选取生长良好的植物组织用蒸馏水冲洗干净后，置于无菌操作台中进行植物组织的表面消毒。由于消毒溶液浓度不够或者消毒时间较短，不能完全杀死植物组织表面的微生物，从而影响内生细菌的筛选；而浓度过高或时间太长，则容易损坏植物组织甚至是杀死植物内生菌，因此，我们选用体积分数为70 75%的乙醇浸泡消毒约1 min，并不断搅拌，倒掉~乙醇，加入体积分数为5 8%的次氯酸钠溶液浸泡约6 10 min，并不断震荡，倒掉次氯酸钠溶~ ~
液，用灭菌蒸馏水冲洗约5次，置于无菌培养皿中，用剪刀将植物组织边缘剪去，露出新鲜切口，并将切口贴在已倒好的改良R2A分离鉴定培养基上。将培养皿封口放入30 ℃的培养箱中暗培养。

[0013] （3）产生长素的内生细菌的分离与快速鉴定：

[0014] 将植物组织切口附近生长出的单一植物内生细菌菌落标上序号，用接种环蘸取不同序号菌体，用划线培养法得到单菌落；之后在长内生细菌的植物组织切口周围喷施生长素显色液，在30 ℃中进行暗反应，观察周围有粉红色物质产生的菌落，此即是可产生长素的内生细菌。

[0015] 本发明的有益效果：

[0016] 本发明提供的产生长素的植物内生细菌的分离方法，可以快速、直观、有效鉴定出产生长素的内生细菌。传统的产生长素的植物内生细菌的分离鉴定方法需经历分离、纯化培养、再活化、发酵以及显色鉴定等过程，菌株分离纯化与菌株产生长素能力鉴定两部分被分割进行，即使除去分离纯化步骤，菌株产生长素能力的鉴定步骤仍需耗费约5 10天。而本~发明将分离培养基与产生长素鉴定培养基进行改良整合，在培养基中添加了生产生长素的前体——色氨酸，并且在分离菌株后立即采用喷施法施用生长素显色液（传统方法需先对菌株进行发酵，之后对发酵液进一步处理后，才与显色液混合反应），一旦有内生细菌在培养过程分泌生长素，则显色液可迅速与之发生颜色反应，能在5 10 min内快速辨别出能产~
生长素的内生细菌。

[0017] 本发明在菌株分离纯化的基础上，同时可进行菌株产生长素能力的鉴定，极大简化了菌株产生长素能力的鉴定工序，最后菌株产生长素能力的鉴定步骤仅在5 10 min内即~可完成。

[0018] 相比传统的分离鉴定方法，本方法不仅由于简化了鉴定工序而使得操作更为方便，也极大缩短了时间（仅大概为传统鉴定方法所用时间的0.1%），还因此可以减少相应的实验成本。所以，本发明是一种能简单、快速、有效地对产生长素内生细菌进行鉴定的方法。

附图说明

[0019] 图1 为产生长素内生细菌的快速筛选结果，其中(a)为植物内生细菌的生长；（b）为分泌生长素的内生细菌经显色后可在周围形成红色物质。

[0020] 具体实施方法

[0021] 下面根据具体实施例和附图内容对本发明更好的说明，以便本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案。

[0022] 实施例1：

[0023] （1）培养基及显色液的配制

[0024] 配制含有0.05%色氨酸的改良的R2A分离鉴定培养基，具体配方如下：称取0.5 g酵母提取物、0.5 g胰蛋白胨、0.5 g酪蛋白酸水解物、0.5 g葡萄糖、0.5 g可溶性淀粉、0.3 g磷酸二氢钾、0.024 g无水硫酸镁、0.3 g丙酮酸钠、15 g琼脂粉、0.5 g色氨酸，用双蒸水定容至1 L，并调pH至7.2，配成改良的R2A分离鉴定培养基，经115 ℃高压灭菌15 min后，分装倒入9 cm的无菌培养皿中，冷却备用。

[0025] 配制生长素显色液：2 mL的0.5 M氯化铁溶液以及98 mL的体积分数为25%高氯酸充分混匀。

[0026] （2）植物组织的预处理

[0027] 选取生长良好的植物组织用蒸馏水冲洗干净后，置于无菌操作台中；用体积分数为70%的乙醇浸泡消毒约1 min，并不断搅拌，倒掉乙醇，加入体积分数为5%的次氯酸钠溶液浸泡约6 min，并不断震荡，倒掉次氯酸钠溶液，用灭菌蒸馏水冲洗5次，置于无菌培养皿中，用剪刀将植物组织边缘剪去，露出新鲜切口，并将切口贴在已倒好的改良R2A分离鉴定培养基上。将培养皿封口放入30 ℃的培养箱中暗培养。

[0028] （3）产生长素的内生细菌的分离与快速鉴定

[0029] 将植物组织切口附近生长出的单一植物内生细菌菌落标上序号，用接种环蘸取不同序号菌体，用划线培养法得到单菌落；之后在长内生细菌的植物组织切口周围喷施1 mL生长素显色液，在30 ℃中进行暗反应，观察周围有粉红色物质产生的菌落，即是可产生长素的内生细菌。

[0030] （4）若菌株可分泌生长素，暗反应约15  20min后，即可在该菌株周围产生较淡的~红色物质。

[0031] 实施例2：

[0032] （1）培养基及显色液的配制

[0033] 配制含有0.1%色氨酸的改良的R2A分离鉴定培养基，具体配方如下：称取0.5 g酵母提取物、0.5 g胰蛋白胨、0.5 g酪蛋白酸水解物、0.5 g葡萄糖、0.5 g可溶性淀粉、0.3 g磷酸二氢钾、0.024 g无水硫酸镁、0.3 g丙酮酸钠、15 g琼脂粉、1 g色氨酸，用双蒸水定容至1 L，并调pH至7.2，配成改良的R2A分离鉴定培养基，经115 ℃高压灭菌15 min后，分装倒入9 cm的无菌培养皿中，冷却备用。

[0034] 配制生长素显色液：2 mL的0.5 M氯化铁溶液以及98 mL的体积分数为30%高氯酸充分混匀。

[0035] （2）植物组织的预处理

[0036] 选取生长良好的植物组织用蒸馏水冲洗干净后，置于无菌操作台中；用体积分数为75%的乙醇浸泡消毒约1 min，并不断搅拌，倒掉乙醇，加入体积分数为6%的次氯酸钠溶液浸泡约8 min，并不断震荡，倒掉次氯酸钠溶液，用灭菌蒸馏水冲洗5次，置于无菌培养皿中，用剪刀将植物组织边缘剪去，露出新鲜切口，并将切口贴在已倒好的改良R2A分离鉴定培养基上。将培养皿放入30 ℃的培养箱中暗培养。

[0037] （3）产生长素的内生细菌的分离与快速鉴定

[0038] 将植物组织切口附近生长出的单一植物内生细菌菌落标上序号，用接种环蘸取不同序号菌体，用划线培养法得到单菌落；并在长内生细菌的植物组织切口周围喷施1.5 mL生长素显色液，在30 ℃中进行暗反应，观察周围有粉红色物质产生的菌落，即是可产生长素的内生细菌。

[0039] （4）若菌株可分泌生长素，暗反应约10 12 min后，即可以发现有内生细菌周围产~生清晰的颜色较深的红色物质。

[0040] 实施例3：

[0041] （1）培养基及显色液的配制

[0042] 配制含有0.2%色氨酸的改良的R2A分离鉴定培养基，具体配方如下：称取0.5 g酵母提取物、0.5 g胰蛋白胨、0.5 g酪蛋白酸水解物、0.5 g葡萄糖、0.5 g可溶性淀粉、0.3 g磷酸二氢钾、0.024 g无水硫酸镁、0.3 g丙酮酸钠、15 g琼脂粉、2 g色氨酸，用双蒸水定容至1 L，并调pH至7.2，配成改良的R2A分离鉴定培养基，经115 ℃高压灭菌15 min后，分装倒入9 cm的无菌培养皿中，冷却备用。

[0043] 配制生长素显色液：2 mL的0.5 M氯化铁溶液以及98 mL的体积分数为35%高氯酸充分混匀。

[0044] （2）植物组织的预处理

[0045] 选取生长良好的植物组织用蒸馏水冲洗干净后，置于无菌操作台中；用体积分数为75 %的乙醇浸泡消毒约1 min，并不断搅拌，倒掉乙醇，加入体积分数为8%的次氯酸钠溶液浸泡约10 min，并不断震荡，倒掉次氯酸钠溶液，用灭菌蒸馏水冲洗5次，置于无菌培养皿中，用剪刀将植物组织边缘剪去，露出新鲜切口，并将切口贴在已倒好的改良R2A分离鉴定培养基上。将培养皿封口放入30 ℃的培养箱中暗培养。

[0046] （3）产生长素的内生细菌的分离与快速鉴定

[0047] 将植物组织切口附近生长出的单一植物内生细菌菌落标上序号，用接种环蘸取不同序号菌体，用划线培养法得到单菌落；并在长内生细菌的植物组织切口周围喷施2 mL生长素显色液，在30 ℃中进行暗反应，观察周围有粉红色物质产生的菌落，即是可产生长素的内生菌。

[0048] （4）暗反应约5 8 min后，即可以发现有内生细菌周围产生清晰的颜色较深的红色~物质，如图1所示，图1（a）中的植物组织切口处有植物内生菌的菌落生成；经过显色后，可以很明显地看出在图1（b）中植物组织切口附近菌落周围有明显的红色物质产生（在图中显示为灰暗色，箭头所示），该实验充分说明本发明提供的快速鉴定产生长素的植物内生菌的方法可以快速筛选出产生长素的内生细菌。