影响断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病抗性的主效SNP标记及应用

摘要

本发明涉及影响断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病抗性的主效SNP标记及应用，所述主效SNP标记位于猪4号染色体上的ST3GAL1基因上，包括主效SNP标记Ⅰ和/或主效SNP标记Ⅱ；其中，所述主效SNP标记Ⅰ的位点为如SEQ ID NO:1所示的DNA序列的第513位，其为T与A的突变。所述主效SNP标记Ⅱ的位点为如SEQ ID NO:2所示的DNA序列的第173位，其为A与G的突变。本发明通过现代分子生物学技术检测该两个主效SNP标记，利用标记辅助选择(MAS)选择有利的等位基因型个体留种，可以显著提高种群断奶仔猪的抗产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病的能力，大大减少仔猪死亡率。

权利要求

1.检测影响断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病抗性的主效SNP标记的引物，其特征在于，

所述主效标记位于猪4号染色体上的ST3GAL1基因上，包括主效SNP标记Ⅰ和/或主效SNP标记Ⅱ；主效SNP标记Ⅰ的位点为如SEQ ID NO:1所示的DNA序列的第513位；主效SNP标记Ⅱ的位点为如SEQ ID NO:2所示的DNA序列的第173位；所述主效SNP标记Ⅰ为T与A的突变；所述主效SNP标记Ⅱ为A与G的突变；

SNP标记I上游引物序列为5’-TCC TCA ACT ACT CGC ACA CCG-3’，下游引物序列为5’-AAC AGA TGC TGA ACG GGT GA-3’，以及SnaPshot反向延伸引物序列为5’-TTT TTT TTT TTT TTT TTG TAA GTG TCT TCC TCC AGG-3’；

SNP标记II上游引物序列为5’-CGT GAC GTG CGT GTA TCC TTC-3’，下游引物序列为

5’-GAG CAG GTG GTT TCG GTA GAG-3’。

2.影响断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病抗性的主效SNP标记在与抗断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病性状相关的种猪选育改良中的应用；其中，所述主效标记位于猪4号染色体上的ST3GAL1基因上，包括主效SNP标记Ⅰ和/或主效SNP标记Ⅱ；主效SNP标记Ⅰ的位点为如SEQ ID NO:1所示的DNA序列的第513位；主效SNP标记Ⅱ的位点为如SEQ ID NO:2所示的DNA序列的第173位；所述主效SNP标记Ⅰ为T与A的突变；所述主效SNP标记Ⅱ为A与G的突变；所述种猪是以白色杜洛克和中国二花脸猪为祖代亲本的猪资源家系的猪。

3.一种种猪遗传改良的方法，其特征在于，种猪继代选育猪4号染色体上的ST3GAL1基因中的SEQ ID NO:1上的第513位的AA型个体和/或其SEQ ID NO:2上的第173位的GG型个体，淘汰SEQ ID NO:1上的第513位的AT基因型和TT基因型个体和/或淘汰SEQ ID NO:2上的第173位的AG基因型和AA基因型个体；其中，所述种猪是以白色杜洛克和中国二花脸猪为祖代亲本的猪资源家系的猪。

4.一种检测猪的抗断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病性状的方法，包括检测如SEQ ID NO:1所示的DNA序列中的5’端第513位核苷酸为A还是T，或者检测如SEQ ID NO:2所示的DNA序列中的5’端第173位核苷酸为A还是G，确定基因型，然后通过基因型确定猪的抗断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病性状；其中，所述猪是以白色杜洛克和中国二花脸猪为祖代亲本的猪资源家系的猪。

5.位于猪4号染色体上的ST3GAL1基因上的DNA序列，其特征在于，所述序列为SEQ ID NO:1的第513位核苷酸为A的DNA序列，或所述序列为SEQ ID NO:2的第173位核苷酸为G的DNA序列。

6.一种如权利要求5所述的DNA序列在与抗断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病性状相关的种猪选育中的应用；其中，所述种猪是以白色杜洛克和中国二花脸猪为祖代亲本的猪资源家系的猪。

说明书

影响断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病抗性的主效

SNP标记及应用

技术领域

[0001] 本发明属于动物分子生物学技术及育种领域，涉及影响断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病抗性的主效SNP标记及其应用。

背景技术

[0002] 畜禽传染病每年给全世界畜禽生产造成巨额的经济损失，发达国家由此造成的损失占年交易额的17％(17亿英磅)，在发展中国家高达35％-50％。仔猪腹泻病是养猪生产中的常见疾病，因腹泻病引起的仔猪死亡率达11.5％-29.5％，其中因大肠杆菌引起的发病率和死亡率占整个猪腹泻发病率与死亡率的56.2％和24.7％。大肠杆菌病严重影响仔猪生长发育，导致生长效率下降，生长发育停滞，有的形成僵猪，给养猪业造成巨大经济损失。虽然药物治疗及传统的免疫接种对预防和治疗断奶前仔猪腹泻病取得了一定的效果，但随着人们对动物福利和绿色环境保护意识的增强，世界各国开始逐步重视健康养殖业生产，同时药物和疫苗在疾病控制中所带来的诸如耐药性和有害残留等负面效应问题也越来越受到人们的关注。此外，致病性大肠杆菌(Eschoerchia coli，E.coli)的抗原特性是可变的，已发现的E.coli菌体O抗原血清型就有164种，给研制疫苗及药物治疗带来很大困难。因此，从根本上开展猪对E.coli抗性的遗传机制研究，将开辟仔猪腹泻抗病育种新途径。

[0003] 产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是引发新生及断奶前仔猪腹泻的主要致病菌，根据其菌毛所产生的黏附素主要有K88、F41、K99、987P、F18等亚型(Moon et al.1999,Journal of Veterinary Diagnostic Investigation.6,557-560)。ETEC F41是其中的一个亚型，是引起仔猪腹泻的重要病原菌之一。ETEC F41利用其菌毛黏附素结合到小肠上皮细胞特异性受体上，在体内大量繁殖、分泌肠毒素，肠毒素通过胞吞作用渗入小肠细胞，导致小肠上皮细胞分泌功能亢进，大量水和电解质溶液渗入肠腔，致使肠腔中大量液体积蓄，超过肠细胞的重吸收能力从而引发腹泻疾病。

[0004] Morris(Morris et al.Journal of General Microbiology,1978,107:173-175)于1978年首次报道了F41菌毛，该菌毛主要黏附幼畜(仔猪、羔羊等)的空肠和回肠。De Graaf等(De Graaf et al.Infection and Immunity,1982,36:751-758)于1982年从B41菌株的突变株中提纯了该菌毛并命名为F41抗原，F41菌毛呈细丝状结构，平均直径为3.2nm，其分子质量约30kDa，等电点为pH4.6，能凝集豚鼠、绵羊、人和马的红细胞。van Zijderveld等(van Zijderveld et al.Vet Q.1998,20Suppl 3:S73-8)用单克隆抗体鉴别出5种F41菌毛抗原决定簇(F41-1～F41-5)，同时证实F41-1抗原决定簇介导了F41菌对猪小肠上皮细胞的黏附和猪红细胞的凝集，受体性质是血型糖蛋白和D-半乳糖。

[0005] 上述研究均是主要针对病原体的，并没有针对动物主体从遗传的角度进行研究，不能从根本上解决仔猪腹泻病的问题。因此，目前存在的问题是需要寻找影响仔猪腹泻病性状的基因以及单核苷酸多态性(SNPs)位点，以期建立标记辅助选择技术从而通过开展断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病的抗病育种工作来从根本上解决仔猪腹泻病的问题。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种影响断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病抗性的主效SNP标记，该主效SNP标记位于猪4号染色体上的ST3GAL1基因上；同时本发明还提供了鉴定上述主效SNP标记的引物；并且本发明还提供了上述主效SNP标记在抗断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病性状相关的种猪选育中的应用。

[0007] 为此，本发明第一方面提供了影响断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病抗性的主效SNP标记，其位于猪4号染色体上的ST3GAL1基因上，包括主效SNP标记Ⅰ和/或主效SNP标记Ⅱ；其中，主效SNP标记Ⅰ的位点为如SEQ ID NO:1所示的DNA序列(核苷酸序列)的第513位；主效SNP标记Ⅱ的位点为如SEQ ID NO:2所示的DNA序列的第173位。

[0008] 本发明中，所述主效SNP标记Ⅰ为T与A的突变；所述主效SNP标记Ⅱ为A与G的突变。

[0009] 在本发明的一个实施例中，所述主效SNP标记Ⅰ的位点为猪4号染色体上的ST3GAL1基因上的如SEQ ID NO:1所示的DNA序列的第513位(即如SEQ ID NO:1所示的DNA序列中标记为w加方框的位置)，且其为T与A的突变(对应于国际猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第7762963个核苷酸位点[T∣A]突变，即g.7762963[T∣A])。

[0010] 在本发明的另一个实施例中，所述主效SNP标记Ⅱ的位点为猪4号染色体上的ST3GAL1基因上的如SEQ ID NO:2所示的DNA序列的第173位(即如SEQ ID NO:2所示的DNA序列中标记为r加方框的位置)，且其为A与G的突变(对应于国际猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第7768128个核苷酸位点[A∣G]突变，即g.7768128[A∣G]。

[0011] 本发明第二方面提供了鉴定本发明第一方面所述的主效SNP标记的引物，其中，SNP标记I上游引物序列为5’-TCC TCA ACT ACT CGC ACA CCG-3’，下游引物序列为5’-AAC AGA TGC TGA ACG GGT GA-3’，以及SnaPshot反向延伸引物序列为5’-TTT TTT TTT TTT TTT TTG TAA GTG TCT TCC TCC AGG-3’；SNP标记II上游引物序列为5’-CGT GAC GTG CGT GTA TCC TTC-3’，下游引物序列为5’-GAG CAG GTG GTT TCG GTA GAG-3’。

[0012] 本发明第三方面提供了鉴定本发明第一方面所述的主效SNP标记在与抗断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病性状相关的种猪选育改良中的应用。

[0013] 本发明中，优选所述猪为杜洛克猪或含有杜洛克血缘的猪。

[0014] 本发明第四方面提供了一种种猪遗传改良的方法，其中，种猪继代选育猪4号染色体上的ST3GAL1基因中的SEQ ID NO:1上的第513位的AA型个体和/或其SEQ ID NO:2上的第173位的GG型个体，淘汰SEQ ID NO:1上的第513位的AT基因型和TT基因型个体和/或淘汰SEQ ID NO:2上的第173位的AG基因型和AA基因型个体。

[0015] 本发明第五方面提供了一种检测猪的抗断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病性状的方法，包括检测如SEQ ID NO:1所示的DNA序列中的5’端第513位核苷酸为A还是T，或者检测如SEQ ID NO:2所示的DNA序列中的5’端第173位核苷酸为A还是G，确定基因型，然后通过基因型确定猪的抗断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病性状。

[0016] 本发明第六方面提供了位于猪4号染色体上的ST3GAL1基因上的DNA序列，其中，所述序列为SEQ ID NO:1的第513位核苷酸为A的DNA序列，或所述序列为SEQ ID NO:2的第173位核苷酸为G的DNA序列。

[0017] 本发明第七方面提供了一种本发明第六方面所述的DNA序列在与抗断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病性状相关的种猪选育中的应用。

[0018] 本发明中，优选所述猪为杜洛克猪或含有杜洛克血缘的猪。

附图说明

[0019] 下面将结合附图来说明本发明。

[0020] 图1为本发明鉴别的猪ST3GAL1SNP A513T突变位点的序列峰图。

[0021] 图2为本发明鉴别的猪ST3GAL1SNP A173G突变位点的序列峰图。

[0022] 图3为SNP A513T位点的SNaPshot判型图；图中附图标记的含义如下：a AA型；b AT型；c TT型。

[0023] 图4为SNP A173G位点的PCR-BcII-RFLP琼脂糖凝胶电泳判型图；图中附图标记的含义如下：1、2、3和10GG型；4和5AA型；6、7、8、9和11GA型；12分子量标记。

[0024] 图5为ETEC F41与刷状缘(小肠上皮细胞组织)的黏附检测结果；图中附图标记的含义如下：(a)不黏附细菌的刷状缘显微照片；(b)黏附细菌的刷状缘显微照片。

具体实施方式

[0025] 为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。

[0026] 如前所述，现有的研究均是主要针对病原体的，并没有针对动物主体从遗传的角度进行研究，不能从根本上解决仔猪腹泻病的问题。本发明的发明人为了开辟解决仔猪腹泻病的问题的新途径，尝试利用现代分子生物学技术寻找影响仔猪腹泻病性状的基因以及单核苷酸多态性(SNPs)位点，并对其与仔猪腹泻病性状的关联性进行了深入的研究，获得两个影响断奶仔猪对产肠毒素大肠杆菌F41腹泻病抗性的主效SNP标记。

[0027] 首先，本发明的发明人利用现代分子生物学技术搜寻影响断奶仔猪对产肠毒素大肠杆菌F41腹泻病抗性的基因，具体方法如下：

[0028] 本发明的发明人前期利用151个微卫星标记在大规模白色杜洛克×二花脸资源家系群体中开展全基因组扫描，将ETEC F41受体基因初步定位在猪4号染色体Sw2509和S0301标记间约5.04Mb的区域(Animal,2009,3:946-950)。在此基础上，本发明的发明人通过在目标区域增加7个微卫星标记，并对白色杜洛克×二花脸资源家系群体的903个体(包括816个F2个体，68个F1个体和19个F0个体)中开展基因分型，进一步将ETEC F41受体基因初步精细定位至标记SW2509至KVL2754之间约2.42Mb的区域。

[0029] 为了获得更高的基因定位精度，本发明的发明人采用猪全基因组高通量60K SNP芯片技术，对上述白色杜洛克×二花脸资源家系群体903个个体判定了62193个SNP标记的基因型，开展深入全基因组关联分析(GWAS)，结果表明：与ETEC F41黏附表型具有最显著关联的SNP位点为H3GA0011673([C]∣T突变)。该SNP位点位于猪4号染色体的6167551bp处(国际猪基因组10.2版本参考序列)，处于ST3GAL1和ZFAT基因之间的间隔区，其P值为1.09E-09。进一步通过连锁不平衡-连锁(LDLA)精细定位分析，最终将F41的受体位点定位于猪4号染色体一段1.23Mb的区间内。

[0030] 已有的研究表明ETEC F41受体为糖蛋白，ST3β-半乳糖α-2，3唾液酸转移酶1基因(ST3bata-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase1，ST3GAL1)属于β-1,3-半乳糖基转移酶(beta3GalT)基因家族成员。该基因编码Ⅱ型膜蛋白，能促进CMP-唾液酸与半乳糖基团结合，其糖基转移酶活性在ETEC F41受体蛋白糖基转移过程中发挥重要作用，而糖蛋白糖基化位点是产肠毒素大肠杆菌菌毛的黏附位点，而且该基因位于ETEC F41受体精细定位的1.23Mb区域内，且紧邻GWAS分析关联性最强的分子标记H3GA0011673。因此，将ST3GAL1基因作为ETEC F41受体的重要位置候选基因开展进一步研究。

[0031] 其次，本发明的发明人利用现代分子生物学技术鉴别影响断奶仔猪对产肠毒素大肠杆菌F41腹泻病抗性的主效SNP标记的位点，具体方法如下：

[0032] 本发明的发明人基于上述发现，在明确了目的基因后根据Ensemble(http://www.ensembl.org/Sus_scrofa)公布的猪ST3GAL1基因部分序列(登录号ENSSSCG00000005943)，采用公用的Primer 5.0或Oligo 6.0分别设计引物对F1/R1(F1：5’-CTC CTG GTC CTC TTC ATC TTC-3’和R1:5’-AGG GTC CTT GCG GAT GTA A-3’)及F2/R2(F2：5’-CGT GAC GTG CGT GTA TCC TTC-3’和R2:5’-GAG CAG GTG GTT TCG GTA GAG-3’)扩增猪基因组DNA(脱氧核糖核酸)。25μl的聚合酶链式反应(PCR)反应体系中，包括30ng猪基因组DNA，2.0mM MgCl2，200mM dNTP(合成DNA的四种脱氧核苷酸底物)，正反向引物各
10pmol，2单位DNA聚合酶(Taq酶)及1×PCR buffer(缓冲液)(上海生物工程公司，中国)。扩增条件为：95℃3min；94℃30s，最佳退火温度(F1/R1及F2/R2引物对的退火温度分别为57℃和60℃)30s，72℃40s，共36个循环；最后在72℃延伸10min。1045bp及293bp扩增片段均采用QIAquick PCR产物纯化试剂盒(QIAGEN，德国)纯化，由华大基因上海测序中心测序。采用美国国家生物技术信息中心(NCBI,National Center for Biotechnology Information,http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理生化功能基因进行序列同源性比较，发现这两段序列与人、牛ST3GAL1基因同源性均在85％以上，由此说明这两段序列均是猪的ST3GAL1基因的一部分。
使用公用的DNAStar软件包中的SeqMan软件分析测序结果时，发现在这两段序列分别在第
513个及第173个核苷酸处存在一个单核苷酸多态位点(SNPs)，即SNP A513T和SNP A173G位点。

[0033] 本发明鉴别的猪ST3GAL1SNP A513T突变位点的序列峰图如图1所示。

[0034] 图1中单峰为纯合子，双峰为杂合子。

[0035] 本发明鉴别的猪ST3GAL1SNP A173G突变位点的序列峰图如图2所示。

[0036] 图2中单峰为纯合子，双峰为杂合子。

[0037] 再其次，本发明的发明人使用SNaPshot试剂盒(ABI公司，美国)开展基因型判定，具体方法如下：

[0038] 1.SNP A513T的判型：

[0039] 1)引物设计

[0040] 设计引物对F3和R3(F3:5’-TCC TCA ACT ACT CGC ACA CCG-3’和R3:5’-AAC AGA TGC TGA ACG GGT GA-3’)扩增包含要检测SNP A513T位点的DNA片断以及一条SnaPshot反向延伸引物(5’-TTT TTT TTT TTT TTT TTG TAA GTG TCT TCC TCC AGG-3’)。

[0041] 2)PCR扩增条件及产物纯化

[0042] 使用上述引物对F3和R3扩增猪基因组DNA。25μl的PCR反应体系中，包括25ng猪基因组DNA，1.0mM MgCl2，100mM dNTP，正反向引物各10pmol，2单位Taq酶及1×PCR buffer(上海生物工程公司，中国)。扩增条件为：95℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共32个循环；最后在72℃延伸10min。PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。取2μl PCR产物，加入1μl ExoSAP-IT酶(上海国药集团公司，中国)37℃孵育15min，然后80℃处理15min灭活酶。PCR产物纯化后稀释4倍备用。

[0043] 3)SNaPshot反应及产物纯化

[0044] SNaPshot反应体系为：SNaPshot反应混合物(Multiplex Ready Reaction Mix)2μl；SNaPshot延伸引物0.5μl(引物终浓度为0.2μmol/L)；上述纯化稀释PCR产物1.5μl；去离子水2μl。SNaPshot循环参数为96℃10s，50℃5s，60℃30s，共25循环。取5μl SNaPshot反应产物加入0.57μl 10×buffer和0.1μl CIP(SNaPshot反应产物纯化酶)在37℃下孵育1h，然后75℃处理15min灭活酶达到产物纯化效果，-20℃保存备用。

[0045] 4)3130遗传分析仪电泳：

[0046] 电泳混合体系包括：7.62μl Hi-Di formamide(甲酰胺变性剂)；2.0μl上述经纯化后的SNaPshot反应产物；0.38μL GeneScan 120LIZ size standard(电泳分子内标)。体系混合后于95℃变性6min然后立即置于冰上处理2min。离心上样。

[0047] 具体判型方法如附图3所示。

[0048] 2.SNP A173G的判型：

[0049] 该多态位点改变了BcII限制性内切酶的酶切位点，可采用PCR-BcII-RFLP(Restriction fragment length polymorphism，RFLP限制性片段长度多态性)法判定该位点的基因型。BcII限制性内切酶酶切F2/R2引物扩增个体基因组DNA所得目的片段，12μL酶切体系中含4.5μL PCR产物，0.3μL(10U/μL)HhaI限制性内切酶，1.2μL 10×buffer(100mM Tris-HCl pH 7.5，100mM MgCl2，10mM DTT，500mM NaCl)，6.0μL dd-H2O(双蒸水)。体系混匀后，置于55℃温浴6小时。向每管酶切反应体系中加入2μL内切酶试剂盒附带的10×loading buffer，混匀，于2.0％琼脂糖凝胶上以5V/cm电压电泳0.5～1hr，紫外透照台观察结果并拍照。

[0050] 具体判型方法如附图4所示，图4中显示泳道1、2、3和10的样本基因型为GG型；泳道样4和5的样本基因型为AA型；泳道6、7、8、9和11的样本基因型GA型。

[0051] 因此，本发明第一方面涉及影响断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病抗性的主效SNP标记，其位于猪4号染色体上的ST3GAL1基因上，包括主效SNP标记Ⅰ和/或主效SNP标记Ⅱ；其中，主效SNP标记Ⅰ的位点为如SEQ ID NO:1所示的DNA序列的第513位(对应于国际猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第7762963个核苷酸位点，即g.7762963)。所述主效SNP标记Ⅰ为T与A的突变。主效SNP标记Ⅱ的位点为如SEQ ID NO:2所示的DNA序列的第173位(对应于国际猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第7768128个核苷酸位点，即g.7768128)。所述主效SNP标记Ⅱ为A与G的突变。

[0052] 同时，本发明第二方面涉及检测如本发明第一方面所述的主效SNP标记的引物，其中，SNP标记I上游引物序列为5’-TCC TCA ACT ACT CGC ACA CCG-3’，下游引物序列为5’-AAC AGA TGC TGA ACG GGT GA-3’，以及SnaPshot反向延伸引物序列为5’-TTT TTT TTT TTT TTT TTG TAA GTG TCT TCC TCC AGG-3’；SNP标记II上游引物序列为5’-CGT GAC GTG CGT GTA TCC TTC-3’，下游引物序列为5’-GAG CAG GTG GTT TCG GTA GAG-3’。

[0053] 基于本发明上述主效SNP标记，本发明的发明人通过大量实验实现了利用这两个SNP标记及侧翼DNA序列信息，采用分子生物学技术来鉴别个体基因型，从而针对抗腹泻病性状选育种猪。

[0054] 本发明第三方面涉及如本发明第一方面所述的主效SNP标记在与抗断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病性状相关的种猪选育改良中的应用。

[0055] 本发明中，优选所述猪为杜洛克猪或含有杜洛克血缘的猪。

[0056] 本发明的发明人通过研究，选择种猪核心群个体，分别利用上述的SNaPshot方法鉴别ST3GAL1SNP A513T位点的基因型及PCR-BcII-RFLP方法鉴别ST3GAL1SNP A173G位点的基因型，选择有利的等位基因型个体留种，群体继代选育后改良种群的抗产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病性能。

[0057] 因此，本发明第四方面涉及一种种猪遗传改良的方法，其中，种猪继代选育猪4号染色体上的ST3GAL1基因中的SEQ ID NO:1上的第513位的AA型个体和/或其SEQ ID NO:2上的第173位的GG型个体，淘汰SEQ ID NO:1上的第513位的AT基因型和TT基因型个体和/或淘汰SEQ ID NO:2上的第173位的AG基因型和AA基因型个体。

[0058] 本发明第五方面涉及一种检测猪的抗断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病性状的方法，包括检测如SEQ ID NO:1所示的DNA序列中的5’端第513位核苷酸为A还是T，或者检测如SEQ ID NO:2所示的DNA序列中的5’端第173位核苷酸为A还是G，确定基因型，然后通过基因型确定猪的抗断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病性状。

[0059] 本发明第六方面涉及位于猪4号染色体上的ST3GAL1基因上的DNA序列，其中，所述序列为SEQ ID NO:1的第513位核苷酸为A的DNA序列，或所述序列为SEQ ID NO:2的第173位核苷酸为G的DNA序列。

[0060] 本发明第七方面涉及一种本发明第六方面所述的DNA序列在与抗断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病性状相关的种猪选育中的应用。

[0061] 本发明中，优选所述猪为杜洛克猪或含有杜洛克血缘的猪。

[0062] 本发明所述用语“产肠毒素大肠杆菌F41性腹泻病”是指由产肠毒素大肠杆菌F41引起的腹泻病。具体地说是由产肠毒素大肠杆菌F41引起的断奶仔猪腹泻病。

[0063] 如前所述，现有的研究均主要针对病原体的，并没有针对动物主体从遗传的角度进行，不能从根本上解决仔猪腹泻病的问题。本发明的发明人尝试利用现代分子生物学技术寻找并确定了影响仔猪腹泻病性状的基因，即猪ST3GAL1基因，并通过现代分子生物学技术深入开展了猪ST3GAL1基因的SNPs(单核苷酸多态性)的搜寻、鉴定及其影响仔猪腹泻病性状的研究，先进行单核苷酸多态性(SNP)A513T和A173G的鉴别，再分别采用SNaPshot方法进行SNP A513T基因型判定及PCR-BcII-RFLP方法进行SNP A173G基因型判定，从而获得了两个影响断奶仔猪F41腹泻抗性的主效SNP标记，并进一步基于这两个主效标记建立标记辅助选择技术开展断奶仔猪F41腹泻病的抗病育种工作。结果表明，基于本发明所确定的主效SNP标记，利用标记辅助选择(MAS)选择有利的等位基因型个体留种，可以显著提高种群断奶仔猪的抗F41腹泻病能力，大大减少仔猪死亡率。

[0064] 实施例

[0065] 实施例1：

[0066] 利用自身构建的、以白色杜洛克和中国二花脸猪为祖代亲本、用于功能基因定位的猪资源家系为实验动物。741头资源家系第二代(F2代)个体饲养到240日龄屠宰，取小肠空肠部分，提取小肠上皮细胞刷状缘，利用E.coli F41菌株黏附猪小肠上皮细胞刷状缘，通过相差显微镜检测细菌的黏附结果。每个样品检测20个以上的刷状缘，若有10％以上的刷状缘上至少有2个细菌黏附，判该样品为黏附型，若至少有2个细菌黏附的刷状缘不到10％，但有1-2个细菌黏附的刷状缘多于10％，判该样品为弱黏附型，否则判为不黏附型。ETEC F41与刷状缘的黏附检测结果如图5所示，从图5中可以看出黏附效果，在显微镜下(a)为不黏附细菌的刷状缘，(b)为黏附细菌的刷状缘。

[0067] 分别采用上述SnaPshot和PCR-BcII-RFLP方法对741头F2代和2头F0代白色杜洛克个体进行SNP A513T和SNP A173G基因型判定，发现两头白色杜洛克个体在两个SNP位点上均为杂合子，这表明该研究结果能在含有杜洛克血缘种猪选育中应用。用SAS软件包(SAS9.0.2002.SAS institute Ine.Cary.NC.USA.)的Freq过程，对各SNP位点的基因型与ETEC F41体外黏附猪小肠刷状缘的表型进行相关性统计分析(见表1和表2)。其中SNP A513T多态性与ETEC F41的侵染易感性呈极显著的相关，T等位基因为易感基因，A等位基因为抗性基因；基因型TT和AT个体对ETEC F41的侵染易感，AA型个体对ETEC F41的侵染具有抵抗性(p<0.0001)。AA型个体是抗腹泻病型猪的选育改良所需的基因型个体。在商业种猪核心群中，继代选育AA型个体，可以进一步改良种群的抗腹泻病性状，减少仔猪的死亡率。SNP A173G多态性与ETEC F41的侵染易感性呈极显著的相关，A等位基因为易感基因，G等位基因为抗性基因；基因型AG和AA个体对ETEC F41的侵染易感，GG型个体对ETEC F41的侵染具有抵抗性(p<0.0001)。GG型个体是抗腹泻病型猪的选育改良所需的基因型个体。在商业种猪核心群中，继代选育GG型个体，可以进一步改良种群的抗腹泻病性状，减少仔猪的死亡率。

[0068] 表1 SNP A513T多态性与ETEC F41黏附表型的相关性

[0069]

[0070] 续表1 SNP A513T多态性与ETEC F41黏附表型的相关性

[0071]

[0072] 注：χ2表示卡方值；df表示自由度；RR表示相对风险率；OR表示比数比，即等位基因A抗性个体的比率(P(Ar))与等位基因G(P(Gr))抗性的比率(OR＝P(Ar)/P(Gr)之比；95％L表示置信区间下限；95％U表示置信区间上限；p<0.01表示差异极显著；p>0.05表示差异不显著；+表示细菌黏附猪小肠的刷状缘；-表示细菌不黏附猪小肠的刷状缘。

[0073] 表2 SNP A173G多态性与ETEC F41黏附表型的相关性

[0074]

[0075] 续表2 SNP A173G多态性与ETEC F41黏附表型的相关性

[0076]

[0077] 注：χ2表示卡方值；df表示自由度；RR表示相对风险率；OR表示比数比，即等位基因A抗性个体的比率(P(Ar))与等位基因G(P(Gr))抗性的比率(OR＝P(Ar)/P(Gr)之比；95％L表示置信区间下限；95％U表示置信区间上限；p<0.01表示差异极显著；p>0.05表示差异不显著；+表示细菌黏附猪小肠的刷状缘；-表示细菌不黏附猪小肠的刷状缘。

[0078] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。