一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量检测方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量检测方法。本发明构建了包含EGFP和RFP不同荧光蛋白报告基因的HPV假病毒，建立了包含不同报告基因假病毒混合检测不同中和抗体的检测方法。该方法操作简便、检测周期短(72小时)、灵敏度高、可重复性好、结果判读客观、高通量、样品需求量少、检测成本低、方法可标准化，便于实验室间推广、可同时检测针对多种型别病毒的中和抗体，更接近疫苗免疫后的真实状况。

权利要求

1.一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量非诊断性检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：获得结构基因表达质粒p16LLw和p18LLw；

步骤2：将步骤1所述结构基因表达质粒p16LLw与荧光蛋白报告质粒PCDNA3-GFP共转染真核表达细胞，所述结构基因表达质粒p18LLw与荧光蛋白报告质粒pRwB共转染真核表达细胞，获得两种假病毒；

步骤3：将待测样本和步骤2获得的两种假病毒分别稀释，混合，假病毒感染真核细胞，表达荧光蛋白，经荧光斑点计数，获得检测样本斑点数；

步骤4：步骤2获得的两种假病毒稀释后与培养基混合，假病毒感染真核细胞，表达荧光蛋白，经荧光斑点计数，获得病毒对照斑点数；

步骤5：将培养基加入真核细胞，经荧光斑点计数，获得细胞对照斑点数；

步骤6：获得感染抑制率(％)＝[1-(检测样本斑点数-细胞对照斑点数)/(病毒对照斑点数-细胞对照斑点数)]×100；

步骤7：以所述待测样本的稀释度作为X，以所述感染抑制率作为Y，用Reed-Muench法获得所述待测样本的中和滴度IC50；

步骤8：所述待测样本的中和滴度IC50＞40时，为HPV型特异性中和抗体阳性。

2.根据权利要求1所述的高通量非诊断性检测方法，其特征在于，步骤2所述真核表达细胞为293FT细胞。

3.根据权利要求1所述的高通量非诊断性检测方法，其特征在于，步骤2所述共转染真核表达细胞具体为：步骤(1)：胰酶消化293FT细胞，于37℃，5％CO2的条件下培养；

步骤(2)：利用Lipofectamine2000将结构基因表达质粒p16LLw和荧光蛋白报告质粒PCDNA3-GFP共转染293FT细胞，将结构基因表达质粒p18LLw和荧光蛋白报告质粒pRwB共转染293FT细胞。

4.根据权利要求3所述的高通量非诊断性检测方法，其特征在于，步骤(2)具体为：步骤①：待细胞汇合率达50％时，取结构基因表达质粒p16LLw和荧光蛋 白报告质粒PCDNA3-GFP各15μg，溶于1.875ml无抗性、无牛血清的培养基中，混匀；取结构基因表达质粒p18LLw和荧光蛋白报告质粒pRwB各15μg，溶于1.875ml无抗性、无牛血清的培养基中，混匀；

步骤②：取75μl Lipofectamine2000，溶于1.875ml无抗性、无牛血清的培养基中，混匀，室温静置5min，获得Lipofectamine2000混合液；此步骤不超过25min；

步骤③：将所述Lipofectamine2000混合液加入质粒混合液中，轻柔混匀，室温孵育

20min；

步骤④：将步骤③获得的孵育好的混合液与步骤(1)培养获得的293FT细胞混匀；

步骤⑤：于37℃、5％CO2的条件下，孵育6小时后，换液；

步骤⑥：转染48小时后收集细胞。

5.根据权利要求4所述的高通量非诊断性检测方法，其特征在于，步骤⑥具体为：步骤(A)：转染后48小时，弃去细胞的培养基上清；

步骤(B)：用胰酶消化步骤(A)获得的细胞，完全培养基终止，收集细胞悬液；

步骤(C)：离心210×g，5min，弃上清；

步骤(D)：用1ml DPBS-Mg将细胞重悬，将细胞悬液离心，弃上清。

6.根据权利要求3至5任一项所述的高通量非诊断性检测方法，其特征在于，步骤(1)具体为：胰酶消化293FT细胞，计数，按照4×105个细胞/ml培养液的浓度接种于75cm2细胞培养瓶中，每瓶接种15ml，于37℃，5％CO2的条件下培养。

7.根据权利要求1至5任一项所述的高通量非诊断性检测方法，其特征在于，步骤2所述获得假病毒包括细胞裂解、盐抽提、假病毒的滴定。

8.根据权利要求7所述的高通量非诊断性检测方法，其特征在于，细胞裂解具体为向共转染后的真核表达细胞加入等体积的细胞裂解液，混匀，37℃孵育24小时；所述细胞裂解液为：1/20体积的体积分数为10％Triton X-100，体积分数为0.1％的Benzonase，体积分数为

0.1％的Plasmid Safe，1/40 体积1mol/L的pH 9的硫酸铵溶液；所述盐抽提具体为：步骤(1)：弃去所述细胞裂解液，冰浴5min；

步骤(2)：加入细胞0.17倍体积的5M的NaCl溶液，使盐浓度调整为850mmol/L；

步骤(3)：冰浴10～20min；

步骤(4)：离心5000×g，10min；

步骤(5)：取上清，分装、-70℃冻存。

9.根据权利要求7所述的高通量非诊断性检测方法，其特征在于，所述假病毒的滴定具体为：步骤(1)：预先6小时铺293FT细胞于96孔细胞培养板中，按照1.5×105个/ml的浓度接种于96孔细胞培养板，每孔100μl，于37℃，5％CO2的条件下培养；

步骤(2)：将所述假病毒进行起始稀释度为1000倍的倍比稀释，获得假病毒稀释液；

步骤(3)：在所述96孔细胞培养板中，每孔加入100μl假病毒稀释液；

步骤(4)：置于37℃，5％CO2的条件下培养72小时；

步骤(5)：用Florospot荧光斑点计数仪扫描计数每孔荧光斑点数；

步骤(6)：用Reed－Muench方法计算获得组织细胞培养半数感染量(TCID50)，即病毒感染一半组织细胞时的病毒稀释度；

所述用Reed－Muench方法计算获得组织细胞培养半数感染量(TCID50)具体为：步骤①：计算各病毒稀释度阳性孔数目(a)和阴性孔数目(b)；

步骤②：计算阳性和阴性孔的累积数：阳性孔累积数由下向上累计(c)，阴性孔累积数由上向下累计(d)；

步骤③：计算阳性孔的百分比：比率＝(c)/〔(c)+(d)〕×100；

步骤④：计算距离比例：距离比例＝(大于50％的阳性百分比－50)/(大于50％的阳性百分比－小于50％的阳性百分比)；

步骤⑤：TCID50的对数＝大于50％的阳性百分比的最高稀释倍数的对数+距离比例×稀释系数的对数。

10.根据权利要求1至5任一项所述的高通量非诊断性检测方法，其特 征在于，步骤3具体为：4

步骤(1)：预先6小时铺293FT细胞于96孔板，每孔细胞浓度为1.5×10 个/100μl，于37℃，5％CO2的条件下培养；

步骤(2)：将假病毒按照固定的假病毒接种量进行稀释，接种浓度为200TCID50/孔，将包含绿色荧光蛋白报告基因的HPV16和包含红色荧光蛋白报告基因的HPV18的两种假病毒等量混合，终体积为60μl的假病毒稀释液；

步骤(3)：将待测样本做初始稀释度为1:40的4倍倍比稀释，获得待测样本稀释液；

步骤(4)：在96孔稀释板中，将所述假病毒稀释液和所述待测样本稀释液等体积混合，各取60μl，每份样品作双复孔；

步骤(5)：于4℃放置1小时；

步骤(6)：从稀释板各孔中吸取100μl的所述假病毒稀释液和所述待测样品稀释液的混合液贴壁缓缓加入预先已铺好细胞的培养板对应孔中，混匀；

步骤(7)：置于37℃，5％CO2的条件下培养72小时；

步骤(8)：用Fluorospot荧光斑点计数仪扫描计数每孔荧光斑点数。

说明书

一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量检测方法。

背景技术

[0002] 人乳头瘤病毒(HPV)属于乳头瘤病毒科(papillomaviridae)，为无包膜的双链环状DNA病毒，现在经过完全测序后归类的HPV可分为100多个基因型。根据其致癌性可分为“低危”型和“高危”型。前者包括HPV6、HPV11等，主要引起良性的生殖器疣和低度的宫颈上皮坏死(CIN)；后者包括HPV16、HPV18等，它们的感染是引发宫颈癌的主要原因。在大多数情况下，免疫系统能在HPV造成伤害之前将其清除，95％以上的生殖道感染能在3到5年内痊愈。但也有少数HPV感染不能被清除，经过多年的一系列的病变发展为宫颈癌。宫颈癌是危害女性健康的第二大恶性肿瘤，95％以上的宫颈癌病理组织中能够检测到HPV DNA，超过15个HPV型与宫颈癌的发病有关，因而宫颈癌成为第一个由世界卫生组织(WHO)确认的完全由病毒感染所引起的癌症。全球每年发病50万例，主要发生于发展中国家，我国每年新发病例约13.5万，约占世界宫颈癌新发病例总数的1/4，死亡人数约为5万人。开发、研制HPV预防性疫苗被认为是预防HPV感染及宫颈癌的最根本手段。而预防性疫苗成功与否的关键是其能否诱导有效的的体液免疫，只有产生高滴度针对HPV的中和抗体才能抵抗外来HPV的感染。因此建立稳定、有效的疫苗评价系统，检测疫苗免疫反应的保护效果，对于疫苗的研制和质控具有重要意义。

[0003] 但由于HPV的生命周期与细胞的分化状态密切相关，无法在体外通过传统的细胞培养系统进行生长繁殖，且从被感染的病理组织中提取的病毒量太少，不能满足中和试验的需要。Buck等利用乳头瘤病毒(PV)能非特异包装DNA的特性，将含密码子优化的PV晚期蛋白L1、L2基因的质粒与表达GFP的报告质粒共转染，48小时后收取细胞裂解液，成功产生了高滴度的假病毒，这种假病毒与天然病毒结构和抗原表位类似，可体外模拟HPV感染，对于HPV的生物学研究、抗体中和活性的鉴定和疫苗开发都有重要意义。Pastrana等用优化的基因共转染产生了包裹分泌性碱性磷酸酶(SEAP)报告基因的假病毒，并在此基础上建立了基于SEAP的检测HPV中和抗体的方法。

[0004] 直接ELISA法是检测抗体最常用的方法，该方法首先将主要衣壳蛋白L1形成的病毒样颗粒(VLP)做适当稀释后包被ELISA板，封闭后加入倍比稀释的待测血清，再加入酶标的二抗，底物显色，通过酶标仪读取每孔光密度值，判断血清中的中和抗体滴度。该方法的缺点是：直接ELISA只能初步测定总抗体滴度，而非中和抗体滴度。葛兰素史克(GSK)公司HPV疫苗临床试验免疫学检测所用的是该方法，所用的包被抗原是GSK公司生产的抗原，与其他企业的检测结果缺乏可比性。

[0005] 竞争抑制ELISA是用VLP包被封闭后，加入待测血清与辣根过氧化物酶(HRP)标记的中和单抗的混合物，室温反应后洗涤，然后加入底物进行显色检测。该方法的缺点是：利用该方法检测中和抗体时，待测血清中不与HRP标记的中和单抗竞争VLP中特定表位的中和抗体不能被检测到，因此在竞争抑制ELISA法中HRP标记的中和单抗应是针对VLP主要中和表位的单抗。另外，待测血清中存在的某些非中和抗体可能会在构象上阻止VLP与HRP标记的中和单抗结合，造成假阳性结果，默沙东(Merck)公司HPV疫苗临床试验免疫学检测所用的是在该方法基础上改进的Luminex方法，所用的包被抗原和抑制性中和单抗都是公司特有的，该检测结果与其他企业的检测结果缺乏可比性。

[0006] 基于SEAP(分泌性碱性磷酸酶)的假病毒中和抗体检测方法：该方法通过化学发光检测仪细胞表达分泌的SEAP来确定样本中和抗体的水平。缺点：靶细胞SEAP的本底值较高，难于制备高滴度的假病毒，虽然能实现高通量，但操作相对较复杂，且试验成本较高，不适用于大规模的临床试验或临床样本的流行病学调查。

[0007] 基于Gluc(长腹水蚤荧光素酶)的假病毒中和抗体检测方法：该方法，利用了Gluc表达产物稳定和易于检测的特点，克服了基于SEAP方法的缺点，可以制备高滴度的假病毒，并能初步实现高通量检测。缺点：该方法一次只能检测针对一种型别假病毒的中和抗体，而现在的HPV疫苗都是多种型别抗原组成的多价疫苗(GSK的2价疫苗，Merck的4价及9价疫苗，我国在研的多种疫苗有2价、3价、4价、6价、9价和13价疫苗)，对于不同型别抗体的检测只能分别制备改型别假病毒，进行单独检测。用该方法对于上万份的临床样本进行多种中和抗体检测的工作量将会非常巨大。

[0008] 世界卫生组织(WHO)在其发布的《HPV VLP疫苗质量、安全性及效力评价指导原则》指出中和实验是评价HPV疫苗诱导的抗体是否具有保护作用的“金标准”。目前的试验方法难于检测大规模临床样本的中和抗体水平，特别是对于多价HPV疫苗临床评价中和抗体检测，亟需开发一种灵敏度高、特异性好、周期短且能实现高通量检测的方法。

发明内容

[0009] 有鉴于此，本发明提供一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量检测方法。该方法操作简便、检测周期短(72小时)、灵敏度高、可重复性好、结果判读客观、高通量、样品需求量少、检测成本低、方法可标准化，便于实验室间推广、可同时检测针对多种型别病毒的中和抗体，更接近疫苗免疫后的真实状况。

[0010] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0011] 本发明提供了一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量检测方法，包括如下步骤：

[0012] 步骤1：获得结构基因表达质粒p16LLw和p18LLw；

[0013] 步骤2：将步骤1所述结构基因表达质粒p16LLw和结构基因表达质粒p18LLw与荧光蛋白报告质粒PCDNA3-GFP、荧光蛋白报告质粒pRwB共转染真核表达细胞，获得假病毒；

[0014] 步骤3：将待测样本和步骤2获得的假病毒分别稀释，混合，假病毒感染真核细胞，表达荧光蛋白，经荧光斑点计数，获得检测样本斑点数；

[0015] 步骤4：将培养基和步骤2获得的假病毒分别稀释，混合，假病毒感染真核细胞，表达荧光蛋白，经荧光斑点计数，获得病毒对照斑点数；

[0016] 步骤5：将培养基稀释，经荧光斑点计数，获得细胞对照斑点数；

[0017] 步骤6：获得感染抑制率(％)＝[1-(检测样本斑点数-细胞对照斑点数)/(病毒对照斑点数-细胞对照斑点数)]×100；

[0018] 步骤7：以所述待测样本的稀释度作为X，以所述感染抑制率作为Y，用Reed-Muench法获得所述待测样本的中和滴度IC50；

[0019] 步骤8：所述待测样本的中和滴度IC50＞40时，为HPV型特异性中和抗体阳性。

[0020] 基于GFP的检测方法是经典的HPV中和抗体检测方法，其结果的判定方式主要有两种：一是流式细胞仪读取GFP阳性细胞比例，计算抗体对病毒感染的抑制率；二是通过荧光显微镜观察，估算GFP阳性细胞比例，计算抗体对病毒感染的抑制率。前一种方法操作繁琐，以检测一块96孔板为例，需要90分钟左右，而且细胞消化后，会出现细胞活力降低，表达荧光的淬灭，产生检测误差。后一种方法通过荧光显微镜观察，主观性强，并且原始检测结果无法保留。由于上述两种结果判定方法的缺陷，国外已基本不采用该方法。荧光斑点计数(Fluorospot)方法，虽然已被应用于细胞免疫分析，主要通过检测分泌到细胞外的细胞因子，来分析机体的细胞免疫水平，并未应用于活细胞直接表达荧光蛋白的检测，在HPV中和抗体检测中也未见报道。

[0021] 在本发明的一些具体实施方案中，高通量检测方法中步骤2所述真核表达细胞为293FT细胞。

[0022] 在本发明的一些具体实施方案中，高通量检测方法中步骤2所述共转染真核表达细胞具体为：

[0023] 步骤(1)：胰酶消化293FT细胞，于37℃，5％CO2的条件下培养；

[0024] 步骤(2)：利用Lipofectamine2000将结构基因表达质粒p16LLw和p18LLw分别与荧光蛋白报告质粒PCDNA3-GFP和pRwB共转染293FT细胞。

[0025] 在本发明的一些具体实施方案中，高通量检测方法中步骤(2)具体为：

[0026] 步骤①：待细胞汇合率达50％时，取所述结构基因表达质粒和所述荧光蛋白报告质粒各15μg溶于1.875ml无抗性、无牛血清的培养基中，混匀；

[0027] 步骤②：取75μl Lipofectamine2000，溶于1.875ml无抗性、无牛血清的培养基中，混匀，室温静置5min，获得Lipofectamine2000混合液；此步骤不超过25min；

[0028] 步骤③：将所述Lipofectamine2000混合液加入质粒混合液中，轻柔混匀，室温孵育20min；

[0029] 步骤④：将步骤③获得的孵育好的混合液与步骤1培养获得的293FT细胞混匀；

[0030] 步骤⑤：于37℃、5％CO2的条件下，孵育6小时后，换液；

[0031] 步骤⑥：转染48小时后收集细胞。

[0032] 在本发明的一些具体实施方案中，高通量检测方法中步骤⑥具体为：

[0033] 步骤(A)：转染后48小时，弃去细胞的培养基上清；

[0034] 步骤(B)：用胰酶消化步骤(A)获得的细胞，完全培养基终止，收集细胞悬液；

[0035] 步骤(C)：离心210×g，5min，弃上清；

[0036] 步骤(D)：用1ml DPBS-Mg将细胞重悬，将细胞悬液离心，弃上清。

[0037] 在本发明的一些具体实施方案中，高通量检测方法中步骤(1)具体为：胰酶消化293FT细胞，计数，将6×106个细胞/15ml接种于75cm2细胞培养瓶中，于37℃，5％CO2的条件下培养。

[0038] 在本发明的一些具体实施方案中，高通量检测方法中步骤2所述获得假病毒包括细胞裂解、盐抽提、假病毒的滴定。

[0039] 在本发明的一些具体实施方案中，高通量检测方法中细胞裂解具体为向共转染后的真核表达细胞加入与等体积的细胞裂解液，混匀，37℃孵育24小时；所述细胞裂解液为：1/20体积的10％Triton  X-100(Pierce#28314)(终浓度为0.5％)，0.1％的
Benzonase.0.1％的Plasmid Safe，1/40体积1mol/L的硫酸铵(pH 9)。；

[0040] 所述盐抽提具体为：

[0041] 步骤(1)：弃去所述细胞裂解液，冰浴5min；

[0042] 步骤(2)：加入细胞0.17倍体积的5M的NaCl溶液，使盐浓度调整为850mmol/L；

[0043] 步骤(3)：冰浴10～20min；

[0044] 步骤(4)：离心5000×g，10min。

[0045] 步骤(5)：取上清，分装、-70℃冻存。

[0046] 在本发明的一些具体实施方案中，高通量检测方法中所述假病毒的滴定具体为：

[0047] 步骤(1)：预先6小时铺293FT细胞于96孔细胞培养板中，每孔细胞数为1.5×104个/100μl，于37℃，5％CO2的条件下培养；

[0048] 步骤(2)：将所述假病毒进行起始稀释度为1000倍的倍比稀释，获得假病毒稀释液；

[0049] 步骤(3)：在所述96孔细胞培养板中，每孔加入100μl假病毒稀释液；

[0050] 步骤(4)：置于37℃，5％CO2的条件下培养72小时；

[0051] 步骤(5)：用Florospot荧光斑点计数仪扫描计数每孔荧光斑点数；

[0052] 步骤(6)：用Reed－Muench方法计算获得组织细胞培养半数感染量(TCID50)，即病毒感染一半组织细胞时的病毒稀释度；

[0053] 所述用Reed－Muench方法计算获得组织细胞培养半数感染量(TCID50)具体为：

[0054] 步骤①：计算各病毒稀释度阳性孔数目(a)和阴性孔数目(b)；

[0055] 步骤②：计算阳性和阴性孔的累积数：阳性孔累积数由下向上累计(c)，阴性孔累积数由上向下累计(d)；

[0056] 步骤③：计算阳性孔的百分比：比率＝(c)/〔(c)+(d)〕×100；

[0057] 步骤④：计算距离比例：距离比例＝(大于50％的阳性百分比－50)/(大数于50％的阳性百分比－小于50％的阳性百分比)；

[0058] 步骤⑤：TCID50的对数＝大于50％的阳性百分比的最高稀释倍数的对数+距离比例×稀释系数的对数。

[0059] 在本发明的一些具体实施方案中，高通量检测方法中步骤3具体为：

[0060] 步骤(1)：预先6小时铺293FT细胞于96孔板，每孔细胞数为1.5×104个/100μl，于37℃，5％CO2的条件下培养；

[0061] 步骤(2)：将假病毒按照固定的假病毒接种量(200TCID50/孔)进行稀释，将包含绿色荧光蛋白的HPV16和包含红色荧光蛋白的HPV18的两种假病毒等量混合，终体积为60μl的假病毒稀释液；

[0062] 步骤(3)：将待测样本做初始稀释度为1:40的4倍倍比稀释，获得待测样本稀释液；

[0063] 步骤(4)：在96孔板中，将所述假病毒稀释液和所述待测样本稀释液等体积混合(60μl+60μl)，每份样品作双复孔；

[0064] 步骤(5)：于4℃放置1小时；

[0065] 步骤(6)：从各孔中吸取100μl的假病毒血清混合物贴壁缓缓加入预先已铺好细胞的培养板对应孔中，混匀；

[0066] 步骤(7)：置于37℃，5％CO2的条件下培养72小时；

[0067] 步骤(8)：用Fluorospot荧光斑点计数仪扫描计数每孔荧光斑点数。

[0068] 具体的，本发明提供的一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量检测方法具体为：

[0069] 假病毒的制备：

[0070] 结构基因表达质粒和报告质粒共转染293FT细胞：

[0071] (1)胰酶消化293FT细胞，计数，将6×106个细胞/15ml接种于75cm2细胞培养瓶中，37℃，5％CO2的孵箱中培养。

[0072] (2)待细胞汇合率达50％左右时，利用Lipofectamine2000将结构基因表达质粒(p16LLw和p18LLw)分别与荧光蛋白报告质粒(PCDNA3-GFP和pRwB)共转染293FT细胞。

[0073] (3)取结构基因表达质粒和报告质粒各15μg溶于1.875ml无抗性、无牛血清的培养基中，轻柔混匀。

[0074] (4)取75μl Lipofectamine2000，溶于1.875ml无抗性、无牛血清的培养基中，轻柔混匀，室温静置5min，此过程不宜超过25min。

[0075] (5)将Lipofectamine2000混合液加入质粒混合液中，轻柔混匀，室温孵育20min，此时溶液可能出现轻微浑浊。

[0076] (6)将孵育好的混合液加入已接种好细胞的培养瓶中，轻柔的前后左右混匀。

[0077] (7)将细胞培养瓶重新置于细胞培养箱中，37℃、5％CO2，孵育6小时后为细胞换液。

[0078] (8)转染48小时后收集细胞。

[0079] 转染细胞的收集：

[0080] (1)转染后48小时，弃去细胞培养瓶中的培养基上清。

[0081] (2)用胰酶消化细胞，完全培养基终止，将细胞悬液转移至50ml离心管中。

[0082] (3)离心210×g，5min，弃上清。

[0083] (4)用1ml DPBS-Mg将细胞重新悬起，将细胞悬液转移至1.5ml离心管中，离心，弃上清。

[0084] 细胞的裂解：

[0085] 向含细胞沉淀的离心管中加入与细胞沉淀等体积的细胞裂解液，混匀，放至培养箱中，37℃孵育24小时。

[0086] 盐抽提：

[0087] (1)取出细胞裂解液，冰浴5min。

[0088] (2)加入0.17倍体积的5M的NaCl溶液，使盐浓度调整为850mmol/L。

[0089] (3)冰浴10～20min。

[0090] (4)离心5000×g，10min。

[0091] (5)取上清，分装、-70℃冻存。

[0092] 假病毒的滴定：

[0093] (1)预先6小时铺293FT细胞于96孔细胞培养板中，每孔细胞数为1.5×104个/100μl，37℃，5％CO2孵箱中培养。

[0094] (2)将各型假病毒分别进行起始稀释度为1000倍的倍比稀释，共9个稀释度。

[0095] (3)在96孔细胞培养板中，每孔加入100μl假病毒稀释液，每型假病毒每种稀释度8个复孔。

[0096] (4)将细胞培养板置于37℃，5％CO2的孵箱中培养72小时。

[0097] (5)用Florospot荧光斑点计数仪扫描计数每孔荧光斑点数。

[0098] (6)计算组织细胞培养半数感染量(TCID50)，即病毒感染一半组织细胞时的病毒稀释度，用Reed－Muench方法计算：

[0099] ①计算各病毒稀释度阳性孔数目(a)和阴性孔数目(b)；

[0100] ②计算阳性和阴性孔的累积数：阳性孔累积数由下向上累计(c)，阴性孔累积数由上向下累计(d)；

[0101] ③计算阳性孔的百分比：比率＝(c)/〔(c)+(d)〕×100；

[0102] ④计算距离比例：距离比例＝(大于50％的阳性百分比－50)/(大数于50％的阳性百分比－小于50％的阳性百分比)；

[0103] TCID50的对数＝大于50％的阳性百分比的最高稀释倍数的对数+距离比例×稀释系数的对数；

[0104] 待测血清中和抗体的检测：

[0105] (1)预先6小时铺293FT细胞于96孔板，每孔细胞数为1.5×104个/100μl，37℃，5％CO2孵箱中培养。

[0106] (2)将假病毒按照固定的假病毒接种量(200TCID50/孔)进行稀释，将两种假病毒(包含绿色荧光蛋白的HPV16和包含红色荧光蛋白的HPV18)等量混合，终体积为60μl。

[0107] (3)将待测血清做初始稀释度为1:40的4倍倍比稀释。

[0108] (4)在96孔稀释板中，将假病毒稀释液和待测血清稀释液等体积混合(60μl+60μl)，每份样品作双复孔，同时设立培养基替代血清的病毒对照孔及只加培养基细胞对照孔。

[0109] (5)将稀释板4℃放至1小时。

[0110] (6)从稀释板各孔中吸取100μl的假病毒血清混合物(或培养基)贴壁缓缓加入预先已铺好细胞的培养板对应孔中，轻拍培养板四周混匀。

[0111] (7)将细胞培养板置于37℃，5％CO2的孵箱中培养72小时。

[0112] (8)用Fluorospot荧光斑点计数仪扫描计数每孔荧光斑点数，公式为：感染抑制率(％)＝[1-(检测样本斑点数-细胞对照斑点数)/(病毒对照斑点数-细胞对照斑点数)]×100。

[0113] (9)用Reed-Muench法计算样本的中和滴度IC50(半数抑制剂量)，中和滴度高于40的样本被认为是HPV型特异性中和抗体阳性样本。

[0114] 本发明提供的方法基于血清样品中针对人乳头瘤病毒(HPV)特异性中和抗体可以阻断假病毒感染细胞而建立的。首先，利用lipofectamine2000脂质体共转染技术，分别将不同型别HPV晚期蛋白L1L2表达质粒与荧光蛋白表达质粒共转染真核表达细胞，48小时后收获假病毒。假病毒感染真核细胞(293TT或293FT)后，表达荧光蛋白，通过荧光斑点计数仪(Fluorospot)可以得到感染细胞的数量(图1A)。若待测血清中含有的HPV特异性中和抗体，可以与病毒表面相应表位结合，从而阻断病毒进入细胞内，导致细胞不被感染或感染细胞数量降低(图1B)。将检测的血清样本斑点数和病毒对照斑点数之间对比分析，得到待测样本对于HPV的中和抑制率＝(1-样本斑点数/病毒对照斑点数)×100％。通过对每份样品的倍比稀释，根据检测结果通过Reed-Muench法计算，可以得到样本中和抗体滴度。

[0115] 本发明构建了包含EGFP和RFP不同荧光蛋白报告基因的HPV假病毒，建立了包含不同报告基因假病毒混合检测不同中和抗体的检测方法，并进行了标准化研究。

[0116] 本专利方法的特点：1、操作简便；2、检测周期短(72小时)；3、灵敏度高；4、可重复性好；5、结果判读客观；6、高通量；7、样品需求量少；8、检测成本低；9、方法可标准化，便于实验室间推广；10、可同时检测针对多种型别病毒的中和抗体，更接近疫苗免疫后的真实状况。

附图说明

[0117] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

[0118] 图1示基于双色荧光蛋白的HPV中和抗体检测方法的原理；

[0119] 图2示Fluorospot与流式细胞仪检测结果的相关性；

[0120] 图3示病毒量对检测结果的影响；其中，A示用不同量HPV16-EGFP假病毒检测同一份HPV16L1免疫后血清的结果；B示用不同量HPV18-RFP假病毒检测同一份HPV18L1免疫后血清的结果；

[0121] 图4示灵敏度设置值对检测结果的影响；具体为灵敏度设置值在170～215之间变动时，三个细胞培养孔中斑点数的变化；

[0122] 图5示灵敏度设置值对检测结果的影响；

[0123] 图6示疫苗免疫后临床样本的检测；

[0124] 图7示疫苗免疫后小鼠样本的检测；

[0125] 图8示HPV16和HPV18中和抗体检测结果的相关性；其中，图8(A)示HPV16中和抗体检测结果的相关性；图8(B)示HPV16中和抗体检测结果的相关性。

具体实施方式

[0126] 本发明公开了一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0127] 本发明提供的一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量检测方法中所用原料及试剂均可由市场购得。其中，疫苗免疫后临床样本的检测中所用样本为上海泽润生物技术有限公司生产的重组人乳头瘤病毒双价(16/18型)疫苗一期临床试验(ClinicalTrials.gov ID:2011L01085)样本，每剂疫苗中含有40μg HPV16和20μg HPV18，免疫程序为0,2,6月三针免疫，第三针免疫后一个月采血，分离血清，-20℃保存备用。结构基因表达质粒p16LLw和p18LLw来源于美国国立癌症研究所。

[0128] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0129] 实施例1

[0130] 假病毒的制备

[0131] 结构基因表达质粒和报告质粒共转染293FT细胞

[0132] (1)胰酶消化293FT细胞，计数，将6×106个细胞/15ml接种于75cm2细胞培养瓶中，37℃，5％CO2的孵箱中培养。

[0133] (2)待细胞汇合率达50％左右时，利用Lipofectamine2000将结构基因表达质粒(p16LLw和p18LLw)分别与荧光蛋白报告质粒(PCDNA3-GFP和pRwB)共转染293FT细胞。

[0134] (3)取结构基因表达质粒和报告质粒各15μg溶于1.875ml无抗性、无牛血清的培养基中，轻柔混匀。

[0135] (4)取75μl Lipofectamine2000，溶于1.875ml无抗性、无牛血清的培养基中，轻柔混匀，室温静置5min，此过程不宜超过25min。

[0136] (5)将Lipofectamine2000混合液加入质粒混合液中，轻柔混匀，室温孵育20min，此时溶液可能出现轻微浑浊。

[0137] (6)将孵育好的混合液加入已接种好细胞的培养瓶中，轻柔的前后左右混匀。

[0138] (7)将细胞培养瓶重新置于细胞培养箱中，37℃、5％CO2，孵育6小时后为细胞换液。

[0139] (8)转染48小时后收集细胞。

[0140] 转染细胞的收集

[0141] (1)转染后48小时，弃去细胞培养瓶中的培养基上清。

[0142] (2)用胰酶消化细胞，完全培养基终止，将细胞悬液转移至50ml离心管中。

[0143] (3)离心210×g，5min，弃上清。

[0144] (4)用1ml DPBS-Mg将细胞重新悬起，将细胞悬液转移至1.5ml离心管中，离心，弃上清。

[0145] 细胞的裂解

[0146] 向含细胞沉淀的离心管中加入与细胞沉淀等体积的细胞裂解液，混匀，放至培养箱中，37℃孵育24小时。

[0147] 盐抽提

[0148] (1)取出细胞裂解液，冰浴5min。

[0149] (2)加入0.17倍体积的5M的NaCl溶液，使盐浓度调整为850mmol/L。

[0150] (3)冰浴10～20min。

[0151] (4)离心5000×g，10min。

[0152] (5)取上清，分装、-70℃冻存。

[0153] 假病毒的滴定

[0154] (1)预先6小时铺293FT细胞于96孔细胞培养板中，每孔细胞数为1.5×104个/100μl，37℃，5％CO2孵箱中培养。

[0155] (2)将各型假病毒分别进行起始稀释度为1000倍的倍比稀释，共9个稀释度。

[0156] (3)在96孔细胞培养板中，每孔加入100μl假病毒稀释液，每型假病毒每种稀释度8个复孔。

[0157] (4)将细胞培养板置于37℃，5％CO2的孵箱中培养72小时。

[0158] (5)用Florospot荧光斑点计数仪扫描计数每孔荧光斑点数。

[0159] (6)计算组织细胞培养半数感染量(TCID50)，即病毒感染一半组织细胞时的病毒稀释度，用Reed－Muench方法计算：

[0160] ①计算各病毒稀释度阳性孔数目(a)和阴性孔数目(b)；

[0161] ②计算阳性和阴性孔的累积数：阳性孔累积数由下向上累计(c)，阴性孔累积数由上向下累计(d)；

[0162] ③计算阳性孔的百分比：比率＝(c)/〔(c)+(d)〕×100；

[0163] ④计算距离比例：距离比例＝(大于50％的阳性百分比－50)/(大数于50％的阳性百分比－小于50％的阳性百分比)；

[0164] TCID50的对数＝大于50％的阳性百分比的最高稀释倍数的对数+距离比例×稀释系数的对数

[0165] 待测血清中和抗体的检测

[0166] (1)预先6小时铺293FT细胞于96孔板，每孔细胞数为1.5×104个/100μl，37℃，5％CO2孵箱中培养。

[0167] (2)将假病毒按照固定的假病毒接种量(200TCID50/孔)进行稀释，将两种假病毒(包含绿色荧光蛋白的HPV16和包含红色荧光蛋白的HPV18)等量混合，终体积为60μl。

[0168] (3)将待测血清做初始稀释度为1:40的4倍倍比稀释。

[0169] (4)在96孔稀释板中，将假病毒稀释液和待测血清稀释液等体积混合(60μl+60μl)，每份样品作双复孔，同时设立培养基替代血清的病毒对照孔及只加培养基细胞对照孔。

[0170] (5)将稀释板4℃放至1小时。

[0171] (6)从稀释板各孔中吸取100μl的假病毒血清混合物(或培养基)贴壁缓缓加入预先已铺好细胞的培养板对应孔中，轻拍培养板四周混匀。

[0172] (7)将细胞培养板置于37℃，5％CO2的孵箱中培养72小时。

[0173] (8)用Fluorospot荧光斑点计数仪扫描计数每孔荧光斑点数，公式为：感染抑制率(％)＝[1-(检测样本斑点数-细胞对照斑点数)/(病毒对照斑点数-细胞对照斑点数)]×100。

[0174] (9)用Reed-Muench法计算样本的中和滴度IC50(半数抑制剂量)，中和滴度高于40的样本被认为是HPV型特异性中和抗体阳性样本。

[0175] 试验分组具体为：

[0176] 将待测样本和获得的假病毒分别稀释，混合，假病毒感染真核细胞，表达荧光蛋白，经荧光斑点计数，获得检测样本斑点数；

[0177] 将培养基和假病毒分别稀释，混合，假病毒感染真核细胞，表达荧光蛋白，经荧光斑点计数，获得病毒对照斑点数；

[0178] 将培养基稀释，经荧光斑点计数，获得细胞对照斑点数；

[0179] 获得感染抑制率(％)＝[1-(检测样本斑点数-细胞对照斑点数)/(病毒对照斑点数-细胞对照斑点数)]×100；

[0180] 以所述待测样本的稀释度作为X，以所述感染抑制率作为Y，用Reed-Muench法获得所述待测样本的中和滴度IC50；

[0181] 所述待测样本的中和滴度IC50＞40时，为HPV型特异性中和抗体阳性。

[0182] 以检测样本的稀释度作为X，以感染抑制率作为Y，导入Graphpad Prism 6软件，依次选择Analyze→XY analyses→Nonlinear regression(curve fit)→Dose-response-inhibition→log(inhibitor)vs.response—Variable slope(four parameters)→OK，查看结果中的IC50即为样本中和抗体滴度。

[0183] 实施例2Fluorospot斑点计数与流式细胞仪阳性细胞比例的相关性

[0184] 基于绿色荧光蛋白的HPV假病毒中和抗体检测结果判定的经典方法是根据流式细胞仪阳性细胞比例来计算的，因此首先比较Fluorospot斑点计数仪和流式细胞仪检测结果的相关性，将实施例1制备的分别包含绿色荧光蛋白(EGFP)和红色荧光蛋白(RFP)的HPV16和HPV18假病毒进行病毒滴定，然后用Fluorospot和流式细胞仪分别进行计数，然后进行线2
性回归分析，4种假病毒的检测结果的线性相关系数R 值都在0.99以上(图2)，说明对于两种荧光蛋白假病毒的计数，荧光斑点计数和流式细胞仪具有较好的一致性。

[0185] 病毒量的选择：对两份不同的样本，在不同病毒量的情况下，检测样本的中和抗体滴度。随着假病毒加入量的减少，病毒对照(只加细胞和假病毒，不加血清样本的检测孔)检测值逐渐降低。对同一份血清样本，当病毒量逐渐降低时，其IC50的检测值逐渐升高，即检测灵敏度随病毒量的增加而降低。但是当假病毒加入量使阳性细胞百分比降低至约5％时，中和曲线的线性相关系数R2会显著减低，为0.9左右，如果病毒加入量增加至高于15％时，R2均高于0.99，因此建议加入病毒产生的阳性细胞百分比不低于15％，对应的HPV16-EGFP检测斑点数为300左右,对应的HPV8-RFP检测斑点数为400左右(Fluorospot灵敏度设置值为200)。

[0186] 灵敏度设置值对检测结果的影响：

[0187] Fluorospot检测仪可以通过调整灵敏度设置值来调整检测的灵敏度，如图4所示，当灵敏度设置值越高时，读出的斑点数越多，但当灵敏度设置值太高时，会出现失真的情况，没有斑点的孔中也会读出斑点数，而灵敏度设置值太低时，会出现斑点漏读的情况。对于EGFP病毒，灵敏度设置值对检测结果的影响更大，如图5所示，当随着灵敏度设置值的增大，流式细胞仪的检测结果与荧光斑点计数结果的线性相关系数R2先增大后减小，对于EGFP病毒，当设置值在200-230之间时，R2大于0.99，对于RFP病毒，当设置值在180-250之间时，R2大于0.99，最终将灵敏度设置值定为215。

[0188] 方法的重复性：对3份临床实验样本，用HPV16-EGFP和HPV18-RFP混合假病毒毒检测中和抗体滴度IC50，在不同时间重复3次实验，每次实验分别检测样本5次，计算实验内和实验间的变异度，CV值均小于30％，检测重复性较好(表1)。

[0189] 表1.重复性结果

[0190]

[0191]

[0192] 实施例3

[0193] 疫苗免疫后临床样本的检测：用实施例1获得的两种假病毒混合检测和一种假病毒单独检测方式，分别检测了10份临床疫苗免疫样品，并比较了两种方法检测结果的相关性，对于HPV16和HPV18中和抗体的检测，两种方法都表现出了较好的相关性，R2均大于0.95.

[0194] 实施例4

[0195] 疫苗免疫后小鼠样本的检测：用不同剂量的疫苗免疫小鼠后，用实施例1获得的两种病毒混合检测和一种假病毒单独检测方式，检测每个免疫剂量组小鼠中和抗体的阳转率，计算疫苗的半数有效剂量ED50，对于HPV16，两种方法的ED值分别为2.48ng和2.10ng，对于HPV18均为0.86ng，两种方法具有较好的一致性。

[0196] 实施例5

[0197] 分别制备包装有EGFP和RFP基因的HPV16假病毒：HPV16-EGFP和HPV16-RFP，分别检测HPV16抗体国际参考品(NIBSC code:05/134，抗体浓度为10IU/ml)，用Fluorospot和流式细胞仪检测方法分别定量，经Fluorospot方式定量结果，HPV16-EGFP检测滴度ID50为188，灵敏度为2.66mIU，HPV16-RFP检测滴度ID50为201，灵敏度为2.49；经流式细胞仪定量结果，HPV16-EGFP检测滴度ID50为165，灵敏度为3.03mIU，HPV16-RFP检测滴度ID50为173，灵敏度为2.89。包装不同报告基因的假病毒，用不同方式检测结果的灵敏度无明显差异，Fluorospot检测时间为流式细胞仪检测的三十分之一。

[0198] 实施例6

[0199] 本发明的优点主要是高通量检测，可同时检测针对两种型别假病毒的中和抗体，用HPV16-EGFP与HPV18-RFP混合假病毒，及HPV16-Gluc和HPV18-Gluc假病毒，分别检测50份HPV16/18疫苗免疫临床血清样本，分别计算样本中和抗体滴度(IC50)，将两种方法检测结果进行log转换后计算相关性，针对HPV16和HPV18中和抗体检测结果的相关性R2分别为0.918和0.922，新建检测方法的检测结果与经典的Gluc-PBNA方法具有较好的一致性(图
8)。

[0200] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。