本发明涉及一种巨芒化学消毒组培方法，包括培养容器消毒、培养基配制、愈伤组织诱导培养、分化培养、生根培养和瓶苗移栽。本发明的巨芒化学消毒组培方法，利用化学试剂达到灭菌或抑菌的目的，在配制培养基的过程中，培养容器和培养基都无需高温高压灭菌，减少了工作量和能源消耗，简化了巨芒组培环节；并且操作简单，只要按不同的培养基配方配制即可；实用性强，推广性好，还可以有效降低巨芒的组培成本，一般可降低成本10％以上。
1.一种巨芒化学消毒组培方法，包括培养容器消毒、培养基配制、愈伤组织诱导培养、分化培养、生根培养和瓶苗移栽，其特征在于：(1)培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的不锈钢盘在100mg/L次氯酸钠+10mg/L乳酸链球菌素+100mg/L丙酸钙的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；
(2)培养基配制：愈伤组织诱导培养基为MS+2～5mg/L 2，4-D+0.5～2g/L AC+50～
100mg/L次氯酸钠+50～100mg/L特美汀+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；分化培养基为：MS+3～8mg/L 6-BA+0.1～0.5mg/L NAA+50～100mg/L次氯酸钠+50～100mg/L特美汀+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；
生根培养基为1/2MS+0.1～0.5mg/L NAA+50～100mg/L次氯酸钠+50～100mg/L特美汀+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；所述MS为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述6-BA，指6-苄氨基嘌呤；所述NAA，指〆-萘乙酸；所述AC，指活性炭；配制培养基时，先称各培养基配方中蔗糖和琼脂粉，加培养基总体积1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或
1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒过的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；
(3)愈伤组织诱导培养：于巨芒的旗叶期，截取幼穗的长度为10-20cm，去除外层苞叶，仅留一片内叶；先用体积比为70％的酒精表面消毒1min，蒸馏水清洗3次，再用镊子剥去内叶，体积比为2％的次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗3-4次，在超净工作台上将幼穗切成2mm的小段，放在愈伤组织诱导培养基上培养，每周转接一次；培养室温度为25～28℃，暗培养；
4周后转到光照培养，光照强度为1500～2000lx；
(4)分化培养：挑取诱导培养获得的部分黄绿色愈伤组织，接种到分化培养基中，培养4周成为不具根的小苗，每30d转接一次；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为2000～
(5)生根培养：将分化培养的不具根小苗，接种到生根培养基上，培养25d后成为完整植株；培养室温度为25℃，光照16h，光照强度为2000～3000lx；
(6)瓶苗移栽：将生根培养获得的完整植株取出，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后移栽至大棚的耕作土中，大棚上层用遮光网遮盖，移栽的环境温度为22～28℃。
2.根据权利要求1所述的一种巨芒化学消毒组培方法，其特征在于所述愈伤组织诱导培养基为MS+3mg/L 2，4-D+1g/L AC+70mg/L次氯酸钠+60mg/L特美汀+0.3mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8。
3.根据权利要求1所述的一种巨芒化学消毒组培方法，其特征在于所述分化培养基为：
MS+5mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+70mg/L次氯酸钠+60mg/L特美汀+0.3mg/L十二烷基磺酸钠+
4.根据权利要求1所述的一种巨芒化学消毒组培方法，其特征在于所述生根培养基为
1/2MS+0.3mg/L NAA+70mg/L次氯酸钠+60mg/L特美汀+0.3mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8。
一种巨芒化学消毒组培方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种植物组织培养方法，具体涉及一种巨芒化学消毒组培方法，属生物技术领域。
背景技术
[0002] 巨芒(Miscanthus giganteus)亦称奇岗，是禾本科芒属多年生C4禾草，植株高度可达4m所以称其为巨芒。原产于日本，40年代引进丹麦，后被欧洲多个国家、美国引进作为能源植物研究种植。近年来国内许多单位包括中国农大、中科院等先后引进作为能源植物进行研究。巨芒之所以在欧洲、美国被认为是最具潜力的能源作物，被赋予解决未来能能源与环境问题的希望之星，其主要特点为：1、为C4植物，具有高光效、低呼吸、CO2补偿点等高产作物的理想特性；2、多年生草本，一年种植，可以连续收获12-20年；3、产量高，干物质产量达12-20吨/亩。在欧洲、美国及国内等试验中都显著高于其他作物；4、枝叶成熟后,体内主要的营养成分将回流至根部,可以节约肥料，能源投入产出比效率是小麦、玉米等主要作物的3-5倍；5、易燃烧且乙醇转化率高达50％。芒草不仅具有很高的生物质产量，而且其收获时水分含量仅有20％一30％，低水分含量有利于燃烧。此外，它的挥发性物质是煤的3倍，它具有比煤炭更好的点火稳定性；6、抗逆性强，耐旱、耐寒能力显著强于主要作物。且病虫害发生少。，近年来，欧洲各国已广泛种植巨芒，主要是利用其燃烧发电。目前芒草发电量占欧盟15国总产电量的9％，其中爱尔兰芒草产电量占全国产电总量的37％，为欧盟各国最高。美国也在Illinois州和Michigan州大田种植。由于巨芒对自然条件要求不高，能在边际土地上生长并获得较高产量，利用其进行能源生产不仅不会占耕地还充分利用了边际土地，在我国应用前景巨大。目前国内已有浙江、福建、广西、山东等地已有少量种植。
[0003] 由于巨芒属于三倍体，无可育的种子。生产上只能利用其地下根茎作为种子。但以其地下根茎作为种苗，其繁殖系数极低，同时，种茎体积大，运输不仅不方便，且易损伤。这成为规模化种植的最大障碍。目前，最好的解决办法就是利用组织培养技术大量生产种苗，但组织培养生产种苗的关键又在于降低成本。组织培养的各个环节均需配置相应的设施设备及常规耗材，成本较高，能源消耗较大，同时整个流程要在无菌条件下操作，人工操作成本高。如果能通过培养基改造，获得既保证组培苗的正常生长，又具有杀菌、抗菌或抑菌功能的培养基，这样可以大幅度节约组培苗等生产成本，是解决巨芒种苗的生产应用成本高的难题。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种巨芒化学消毒组培方法。
[0005] 本发明的目的是通过以下方法实现的。
[0006] 本发明的一种巨芒化学消毒组培方法，包括培养容器消毒、培养基配制、愈伤组织诱导培养、分化培养、生根培养和瓶苗移栽，其特征在于：
[0007] 1.培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的不锈钢盘在100mg/L次氯酸钠+10mg/L乳酸链球菌素+100mg/L丙酸钙的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；
[0008] 2.培养基配制：愈伤组织诱导培养基为MS+2～5mg/L 2，4-D+0.5～2g/L AC+50～100mg/L次氯酸钠+50～100mg/L特美汀+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；分化培养基为：MS+3～8mg/L 6-BA+0.1～0.5mg/L NAA+50～100mg/L次氯酸钠+50～100mg/L特美汀+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；
生根培养基为1/2MS+0.1～0.5mg/L NAA+50～100mg/L次氯酸钠+50～100mg/L特美汀+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；所述MS培养基为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述6-BA，指6-苄氨基嘌吟；所述NAA，指〆-萘乙酸；所述AC，指活性炭；配制培养基时，先称各培养基配方中蔗糖和琼脂粉，加培养基总体积1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒过的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；
[0009] 3.愈伤组织诱导培养：于巨芒的旗叶期，截取幼穗的长度为10-20cm，去除外层苞叶，仅留一片内叶；先用体积比为70％的酒精表面消毒1min，蒸馏水清洗3次，再用镊子剥去内叶，体积比为2％的次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗3-4次。在超净工作台上将幼穗切成2mm的小段，放在愈伤组织诱导培养基上培养，每周转接一次；培养室温度为25～28℃，暗培养；4周后转到光照培养，光照强度为1500～2000lx；
[0010] 4.分化培养：挑取诱导培养获得的部分黄绿色愈伤组织，接种到分化培养基中，培养4周成为不具根的小苗，每30d转接一次；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为2000～3000lx；
[0011] 5.生根培养：将分化培养的不具根小苗，接种到生根培养基上，培养25d后成为完整植株；培养室温度为25℃，光照16h，光照强度为2000～3000lx；
[0012] 6.瓶苗移栽：将生根培养获得的完整植株取出，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵 浸泡30min后移栽至大棚的耕作土中，大棚上层用遮光网遮盖，移栽的环境温度为22～28℃。
[0013] 本发明的应用效果：
[0014] 由于本发明的化学消毒组培方法，是利用化学试剂添加到各种培养基中，达到灭菌或抑菌的作用。所以，配制的培养基是无需高温高压灭菌。因此，对巨芒愈伤组织诱导培养、分化培养、生根培养各个阶段的影响，除了要考虑常用的评价指标外，还要考虑污染率的问题。
[0015] 1.愈伤组织诱导培养：本发明的一种巨芒的化学消毒组培方法与常规的巨芒组培方法相比，在愈伤组织诱导培养阶段的外植体培养的成活率、污染率和死亡率，如表1所示，都没有太大差异。
[0016] 表1 本发明的化学消毒组培方法对巨芒茎尖诱导培养的影响
[0017]
[0018] 2.分化培养：从表2可以看出，本发明的巨芒化学消毒组培方法的每团愈伤组织平均分化苗数明显高于常规的巨芒组培方法，污染率更低，瓶苗也更壮、更绿。
[0019] 表2 本发明的化学消毒组培方法对巨芒增殖倍数和污染率的影响
[0020]组培方式 平均分化苗数/团 平均污染率(％) 生长状况
常规组培方法 5.6 0.3 苗浅绿、弱
化学消毒组培方法 5.8 0.1 苗绿、壮
[0021] 3.本发明的化学消毒组培方法对巨芒生根率和污染率的影响：在生根过程中，本发明的化学消毒组培方法与常规的巨芒组培方法相比，结果如表3所示，生根率和污染率都没有太大差异；从瓶苗的生长状况看，用本发明的方法，巨芒组培苗茎更粗，叶片更大，叶色浓绿。
[0022] 表3 本发明的化学消毒组培与常规组培的巨芒瓶苗生根情况比较结果[0023]组培方式 平均生根率 平均污染率 生长状况
[0024] (％) (％)
常规组培方法 100 0.3 茎细，叶片小，叶色绿
化学消毒组培方法 100 0 茎粗，叶片大，叶色浓
绿
[0025] 4.成本分析：本发明的化学消毒组培方法与常规组培的成本分析见表4。
[0026] 本发明的化学消毒组培方法省去了高压灭菌环节，简化了组培程序，提高了工作效率。从可以直接计算出来的费用来算，每年可以节约5万元左右(以每天配制50L培养基计算)。另外，还有一些不容易计算的项目，如高压锅维修，安全，节约空间等：
[0027] 表4本发明的巨芒简便组培方法培养与常规组培的成本分析表
[0028]
[0029] 由于本发明的培养基不需要进行高温高压灭菌，一方面可以降低巨芒组织培养对设施设备的要求，尤其不需要高温高压灭菌所需配置的高压锅设备，节约了投资成本，电能消耗也将大幅度降低；另一方面，采用这种培养基开展巨芒脱毒种苗生产，组培环节大为简化，人工操作的速度大幅提高，从而降低了人工成本。此外，由于改造后的培养基自身具有杀菌、抗菌或抑菌作用，能有效控制组织培养过程中的污染问题，又不会对巨芒生长产生毒害或抑制，即不影响巨芒的正常生长，从根本上简化了巨芒组织培养。
[0030] 本发明具有如下有益效果：
[0031] 1.本发明的巨芒化学消毒组培方法中，培养容器和培养基都无需高温高压灭菌，减少了工作量和能源消耗，简化了巨芒组培环节，降低了巨芒组培成本。
[0032] 2.本发明的巨芒化学消毒组培方法，操作简单，只要按不同的培养基配方配制后即可，实用性强，推广性好。
[0033] 3.本发明的巨芒化学消毒组培方法与常规的巨芒组培方法对比，可以降低成本10％以 上。
具体实施方式
[0034] 为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。
[0035] 实施例一：一种巨芒化学消毒组培方法
[0036] 一种巨芒化学消毒组培方法，包括以下步骤：
[0037] 1.培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的不锈钢盘在100mg/L次氯酸钠+10mg/L乳酸链球菌素+100mg/L丙酸钙的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；
[0038] 2.培养基配制：愈伤组织诱导培养基为MS+3mg/L 2，4-D+1g/L AC+70mg/L次氯酸钠+0.3mg/L+60mg/L特美汀十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；分化培养基为：MS+5mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+70mg/L次氯酸钠+60mg/L特美汀+0.3mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为1/2MS+0.3mg/L NAA+70mg/L次氯酸钠+60mg/L特美汀+0.3mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；配制培养基时，先称各培养基配方中蔗糖和琼脂粉，加培养基总体积1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒过的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；
[0039] 3.愈伤组织诱导培养：于巨芒的旗叶期，截取幼穗的长度为10-20cm，去除外层苞叶，仅留一片内叶。先用70％的酒精表面消毒1min，蒸馏水清洗3次，再用镊子剥去内叶，2％的次氯酸钠消毒10min,无菌水冲洗3-4次。在超净工作台上将幼穗切成2mm的小段，放在愈伤组织诱导培养基上培养，每周转接一次。培养室温度为25～28℃，暗培养；4周后转到光照培养，光照强度为1500～2000lx。
[0040] 4.分化培养：挑取诱导培养的部分黄绿色愈伤组织，接种到分化培养基中，培养4周成为不具根的小苗，每30d转接一次；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为2000～3000lx；
[0041] 5.生根培养：将分化培养获得的不具根小苗，接种到生根培养基上，培养25d后成为完整植株；培养室温度为25℃，光照16h，光照强度为2000～3000lx；
[0042] 6.瓶苗移栽：将生根培养获得的完整植株取出，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后移栽至大棚的耕作土中，大棚上层用遮光网遮盖，移栽的环境温度为22～28℃。
