一种异羟肟酸类衍生物、其药物组合物、制备方法及用途

摘要

本发明涉及一种异羟肟酸类衍生物、其药物组合物、制备方法及用途。本发明的化合物能够有效地调节CLA‑1的活性和/或水平，具有作为防治心脑血管疾病(例如动脉粥样硬化)、抗炎、体重控制(减轻体重、维持体重)或者抗肿瘤药物的前景。所述化合物结构如下式所示：其中，R’选自C6－12芳基、取代的C6－12芳基、C6－12芳氧基、和取代的C6－12芳氧基，m为1、2、或3；所述的取代各自独立地为被选自卤素原子、C1－6烷基、C1－6烷氧基、氨基、和C1－6烷基氨基中的任意一个或多个取代基所取代。

权利要求

1.式Ⅱ所示的化合物，或其可药用盐，

其中，

R’选自取代的苯基、苄基、取代的苄基、苯乙基、取代的苯乙基、苯丙基、以及取代的苯丙基；

m为1、2、或3；

所述取代基在苯环上的邻位、间位、或对位；

所述的取代各自独立地为被选自氯原子、甲氧基或乙氧基、二甲氨基或二乙氨基所取代。

2.根据权利要求1所述的化合物，或其可药用盐，其选自如下的化合物:N-羟基-4-{[2-氯苯胺基甲酰基甲氨基]甲基}苯甲酰胺，N-羟基-4-{[3-氯苯胺基甲酰基甲氨基]甲基}苯甲酰胺，N-羟基-4-{[4-氯苯胺基甲酰基甲氨基]甲基}苯甲酰胺，N-羟基-4-{[2-甲氧基苯胺基甲酰基甲氨基]甲基}苯甲酰胺，N-羟基-4-{[3,4-二甲氧基苯胺基甲酰基甲氨基]甲基}苯甲酰胺，N-羟基-4-{[4-二甲胺基苯胺基甲酰基甲氨基]甲基}苯甲酰胺，N-羟基-4-{[2-氯苯胺基甲酰基乙氨基]甲基}苯甲酰胺，N-羟基-4-{[4-氯苯胺基甲酰基乙氨基]甲基}苯甲酰胺，N-羟基-4-{[4-甲氧基苯胺基甲酰基乙氨基]甲基}苯甲酰胺，N-羟基-4-{[3,4-二甲氧基苯胺基甲酰基乙氨基]甲基}苯甲酰胺，和N-羟基-4-{[4-甲氧基苯乙胺基甲酰基乙氨基]甲基}苯甲酰胺；

或其可药用盐。

3.权利要求1或2任一所述的化合物的制备方法，包括下述步骤：其中，a表示1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，与产物相对应的胺类化合物，CH2Cl2；b表示NH2OH·HCl，NaOH，MeOH；c表示NaHCO3，与产物相对应的胺类化合物，CH3CN，回流；R’、m分别如权利要求1或2中所述。

4.一种药物组合物，其包含权利要求1或2任一项所述的化合物或其可药用盐及药学上可接受的载体或辅料。

5.权利要求1或2任一项所述的化合物或其可药用盐在制备调节CLA-1活性或CLA-1水平的药物或者调节血脂水平或总胆固醇水平的药物中的用途。

6.权利要求1或2任一项所述的化合物或其可药用盐在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗心脑血管疾病的药物中的用途；所述心脑血管疾病选自动脉粥样硬化、高血脂症、高胆固醇血症、急性心肌梗死、脑卒中以及冠心病。

说明书

一种异羟肟酸类衍生物、其药物组合物、制备方法及用途

技术领域

[0001] 本发明属于医药化工领域，涉及一种异羟肟酸类衍生物、其药物组合物、制备方法及用途。

背景技术

[0002] 心脑血管疾病是当今我国和世界发达国家发病率最高的疾病，其致死致残率高居各类疾病之首，而动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是心脑血管疾病的主要病理基础。脂质代谢紊乱尤其是胆固醇代谢紊乱是公认的主要危险因子。据WHO预测，到2020年因心血管疾病而引起死亡的人数将增加到约250万/年，其中大多直接与血脂异常有关。在过去十多年间，在降低血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平、减少与心血管疾病有关的症状和降低重大心血管事件的风险中，他汀类药物都表现出重要作用。此类药物包括许多重磅炸弹级产品，如辉瑞公司(Pfizer)的阿托伐他汀(atorvastatin，立普妥，Lipitor)和默克公司(Merck)的辛伐他汀(simvastatin，舒降之，Zocor)。但他汀类药物也仅能降低20％－
40％的心血管事件(Brugts JJ,YetginT,Hoeks SE,et al.The benefits of statins in people without established cardiovascular disease but with cardiovascular risk factors:meta-analysis of randomised controlled trials[J].BMJ,2009,338:
b2376.)，所以，心血管疾病仍是危害人类健康的主要杀手。要进一步降低心血管疾病的危害，在降低LDL-C的同时必须从预防和/或逆转AS的新的治疗靶点出发来寻找具有新作用机制的药物。

[0003] 长期的临床研究表明，高密度脂蛋白的胆固醇含量(HDL-C)与动脉粥样硬化的发生发展呈反向相关。HDL的抗动脉粥样硬化作用除其具有的抗氧化、抗炎作用外，很重要的一个原因是HDL是胆固醇逆转运(reverse cholesterol transfer,RCT)的主要携带者。1996年Acton等发现肝细胞上的膜受体SR-BI可选择性摄取利用HDL-C中的胆固醇酯，第一次确认B族I型清道夫受体(Scavenger receptor class B type I,SR-BI)是具有功能的高密度脂蛋白受体(Acton SL,RigottiA,Landschulz KT,et al.Identification of scavenger receptor SR-BI as a high density lipoprotein receptor[J].Science,
1996,271(5248):518-520.)。人类SR-BI(hSR-BI)是作为CD36膜蛋白超家族以及溶酶体整合膜蛋白相关蛋白被独立发现的，所以又称为CLA-1(CD36and LIMPII Analogous-1)。近年来，高密度脂蛋白在动脉粥样硬化中的作用已成为研究热点，相关研究逐步揭示HDL受体介导的胆固醇逆转运机制使得外周组织中不便于调节和利用的的胆固醇可以转运到肝脏进行处置代谢，进而可能使动脉粥样硬化脂质斑块的形成通过胆固醇的逆转运方式得到缓解甚至逆转。近年来的研究结果表明，SR-BI/CLA-1参与外周组织中胆固醇的流出和肝脏中胆固醇的选择性摄取，在胆固醇逆转运的初始和终末步骤中都起着关键作用，被认为是发现新型心血管药物的潜在靶标(Acton SL,Kozarsky KF,Rigotti A.The HDL receptor SR-BI:a new therapeutic target for atherosclerosis[J].Mol Med Today,1999,5(12):
518-524)。

发明内容

[0004] 本发明人经过深入的研究和大量的实验，发现了一类异羟肟酸类衍生物，并且惊奇地发现，这些化合物能够有效地调节CLA-1的活性和/或水平，具有作为防治心脑血管疾病(例如动脉粥样硬化)药物的前景。由此提供了下述发明：

[0005] 本发明的一个方面涉及式Ⅰ或式Ⅱ所示的化合物，或其可药用盐，

[0006]

[0007] 其中，

[0008] R选自C6－12芳基、取代的C6－12芳基、C6－12芳氧基、和取代的C6－12芳氧基，[0009] n为0、1、2、或3；

[0010]

[0011] 其中，

[0012] R’选自C6－12芳基、取代的C6－12芳基、C6－12芳氧基、和取代的C6－12芳氧基，[0013] m为1、2、或3；

[0014] 所述的取代基选自卤素原子、C1－6烷基、C1－6烷氧基、氨基、和C1－6烷基氨基，并且所述取代基为一个或多个(即所述的取代各自独立地为被选自卤素原子、C1－6烷基、C1－6烷氧基、氨基、和C1－6烷基氨基中的任意一个或多个相同或不同的取代基所取代)。

[0015] 根据本发明的任一项所述的化合物，或其可药用盐，其中，

[0016] R和R’分别独立地选自苯基、取代的苯基、苄基、取代的苄基、苯乙基、取代的苯乙基、苯丙基、以及取代的苯丙基。

[0017] 根据本发明的任一项所述的化合物，或其可药用盐，其中，其中所述取代基在苯环上的邻位、间位、或对位。

[0018] 根据本发明的任一项所述的化合物，或其可药用盐，其中，

[0019] 所述卤素为氟、氯、溴、或碘，所述C1－6烷氧基为甲氧基或乙氧基，所述C1－6烷基氨基为二甲氨基或二乙氨基。

[0020] 根据本发明的任一项所述的化合物，或其可药用盐，其选自如下的表1或表2所示化合物，或其可药用盐:

[0021] 表1：符合式Ⅰ的部分具体化合物

[0022]

[0023] 表2：符合式Ⅱ的部分具体化合物

[0024]

[0025]

[0026]

[0027] 本发明的另一方面涉及上面任一项所述的化合物的制备方法，包括下述步骤：

[0028]

[0029] 其中，a表示1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，与产物相对应的胺类化合物，CH2Cl2；b表示NH2OH·HCl，NaOH，MeOH；c表示NaHCO3，与产物相对应的胺类化合物，CH3CN，回流；R、R’、n、m分别如上面的任一项所述。

[0030] 本领域人员能够理解，术语“与产物相对应的胺类化合物”或“相应的胺”是化学合成中相关反应过程的通用和惯常描述，亦可见于本领域文献的报道；对该术语的理解，应结合前后反应过程，即根据目的产物的不同，用于给合成的产物引入R-胺基或R’-胺基，其中符号R或R’具有本发明上述的任一项的含义；“产物相对应的胺类化合物”或“相应的胺”包括但不限于本发明的实施例中所描述的苯胺、3-氯苯胺、4-甲氧基苄胺，等等。

[0031] 另外，如文中所述“a表示1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，与产物相对应的胺类化合物，CH2Cl2”实际上表示反应加入了EDC，与产物相对应的胺类化合物和CH2Cl2。对于b和c也可做类似理解。

[0032] 本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明中任一项所述的化合物或其可药用盐；可选地，还包括药学上可接受的载体或辅料。

[0033] 通常本发明的药物组合物含有0.1－90重量％的式Ⅰ或式Ⅱ化合物和/或其药学上可接受的盐。药物组合物可根据本领域已知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将式Ⅰ或式Ⅱ化合物和/或其药学上可接受的盐与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人用的适当的施用形式或剂量形式。

[0034] 本发明的式Ⅰ或式Ⅱ化合物和/或其药学上可接受的盐或者本发明的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将给药单元制成胶囊，将有效成分式Ⅰ化合物或其立体异构体与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明明胶囊或软胶囊中。也可将有效成分式Ⅰ或式Ⅱ化合物和/或其药学上可接受的盐或者本发明的药物组合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。为了将给药单元制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。

[0035] 此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

[0036] 本发明的式Ⅰ或式Ⅱ化合物和/或其药学上可接受的盐或者本发明的药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体化合物，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。

[0037] 本文所用的术语“组合物”意指包括包含指定量的各指定成分的产品，以及直接或间接从指定量的各指定成分的组合产生的任何产品。

[0038] 可改变本发明药物组合物中各活性成分的实际剂量水平，以便所得的活性化合物量能有效针对具体患者、组合物和给药方式得到所需的治疗反应。剂量水平须根据具体化合物的活性、给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是，本领域的做法是，化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

[0039] 本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的化合物或其可药用盐在制备调节CLA-1活性或CLA-1水平的药物或试剂或者调节血脂水平或总胆固醇水平的药物中的用途。所述调节CLA-1活性包括上调CLA-1活性。所述调节CLA-1水平包括提高CLA-1水平。所述调节血脂水平包括降低血脂水平。所述调节总胆固醇水平包括降低总胆固醇水平。

[0040] 本发明的再一方面涉及一种在体内或体外调节CLA-1活性或CLA-1水平的方法，包括使用有效量的本发明中任一项所述的化合物或其可药用盐的步骤。

[0041] 本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的化合物或其可药用盐在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗心脑血管疾病、抗炎、体重控制(减轻体重、维持体重)或者抗肿瘤的药物中的用途；具体地，所述心脑血管疾病选自动脉粥样硬化、高血脂症、高胆固醇血症、急性心肌梗死、脑卒中以及冠心病。

[0042] 本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防和/或辅助治疗心脑血管疾病、抗炎、体重控制(减轻体重、维持体重)或者抗肿瘤的方法，包括给予有效量的本发明中任一项所述的化合物或其可药用盐的步骤。具体地，所述心脑血管疾病选自动脉粥样硬化、高血脂症、高胆固醇血症、急性心肌梗死、脑卒中以及冠心病。

[0043] 当用于上述治疗和/或预防和/或辅助治疗时，治疗和/或预防有效量的一种本发明的化合物或其可药用盐可以以纯形式应用，或者以药学可接受的酯或前药形式(在存在这些形式的情况下)应用。或者，所述化合物可以以含有该目的化合物与一种或多种药物可接受赋形剂的药物组合物给药。词语“预防和/或治疗有效量”的本发明化合物指以适用于任何医学预防和/或治疗的合理效果/风险比治疗障碍的足够量的化合物。但应认识到，本发明化合物和组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体化合物的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体化合物组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。一般说来，本发明的化合物用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于0.001-1000mg/kg体重/天，例如介于0.01-100mg/kg体重/天，例如介于0.01-10mg/kg体重/天。

[0044] 根据本发明的化合物可以有效地预防和/或治疗本发明所述的各种疾病或病症。

[0045] 在本发明中，术语“C1-6烷基”是指具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、2-戊基、异戊基、新戊基、己基、2-己基、3-己基、3-甲基戊基等。

[0046] 术语“C1-6烷氧基”，是指具有1-6个碳原子的直链或支链烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-氧戊基、异氧戊基、新戊氧基、己氧基、2-己氧基、3-氧己基、3-甲基戊氧基等。

[0047] 术语“C1-6烷基氨基”，是指C1-6烷基上任一碳位或多碳位上含有一个或多个氨基。C1-4烷基氨基或C1-3烷基氨基也可做类似理解。

[0048] 术语“C6－12芳基”术语“C5-20芳基”的例子包括苯基、苄基、苯乙基、苯丙基，等等。这些芳基可以被烷基(例如C1-6烷基)或烷氧基(例如C1-6烷氧基)或卤素原子取代。取代基可以在苯环的邻位、间位、或对位。

[0049] 术语“C6－12芳氧基”的例子包括苄氧基等。这些芳氧基可以被一个或多个烷氧基(例如C1-6烷氧基)或烷基(例如C1-6烷基)或卤素原子取代。取代基可以在苯环的邻位、间位、或对位。

[0050] 发明的有益效果

[0051] 本发明的化合物能够有效地调节CLA-1的活性和/或水平，具有作为防治心脑血管疾病(例如动脉粥样硬化)、抗炎、体重控制(减轻体重、维持体重)或者抗肿瘤药物的前景。

附图说明

[0052] 图1：化合物对HepG2细胞中CLA-1表达的影响。图1(A)：化合物7对CLA-1mRNA水平的影响；图1(B)：流式细胞技术检测化合物7对CLA-1蛋白表达的影响；图1(C)：Western Blot检测化合物7对CLA-1蛋白表达的影响；图1(D)：Western Blot检测化合物7对CLA-1蛋白表达影响的定量化结果。

[0053] 图2：化合物对HepG2细胞DiI-HDL摄取能力的影响。图2(A)：0.3μM化合物7对HepG2细胞摄取DiI-HDL能力的影响；图2(B)：0.75μM化合物7对HepG2细胞摄取DiI-HDL能力的影响；图2(C)：1.5μM化合物7对HepG2细胞摄取DiI-HDL能力的影响；图2(D)：0.3μM SAHA对HepG2细胞摄取DiI-HDL能力的影响；图2(E)：0.6μM SAHA对HepG2细胞摄取DiI-HDL能力的影响；图2(F)：化合物7和SAHA对HepG2细胞DiI-HDL摄取能力的定量化结果。

[0054] 图3：化合物对小鼠体重的影响。

[0055] 图4：化合物对小鼠主动脉斑块的影响(*代表P＜0.05)。图4(A)：高脂饮食对照(HFC)的小鼠主动脉斑块形成情况；图4(B)：化合物7(25mg/Kg)对小鼠主动脉的保护情况；图4(C)：小鼠主动脉斑块面积的定量结果(n＝4)。

具体实施方式

[0056] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0057] 实施例1：己二酰苯胺异羟肟酸(化合物1)的制备

[0058] 1)5-苯胺基甲酰-戊酸甲酯的制备。

[0059] 己二酸单乙酯(3.20g,20.0mmol)溶于CH2Cl2(20.0ml)中，冷至-5℃，加入EDC.HCl(3.84g,20.0mmol)，然后滴加入苯胺(1.86g,20.0mmol)的CH2Cl2(10.0ml)溶液，反应液自然升至室温，搅拌过夜。

[0060] 反应液中加入1mol/L HCl(30ml)洗,5％Na2HCO3(30ml)洗，饱和食盐水洗。有机相用无水硫酸钠干燥。浓缩得到粗产物，收率约60％。不必纯化，直接用于下步反应。

[0061] 2)己二酰苯胺异羟肟酸(化合物1)的制备

[0062] 5-苯胺基甲酰-戊酸甲酯(1.18g,5.0mmol)溶于甲醇中(50mL)，加入盐酸羟胺(1.40g,20.0mmol)降温至至0℃，滴加入8mol/L的NaOH(10mL)溶液，室温搅拌1－2小时。

[0063] 0℃下向溶液中滴加入1mol/L HCl(50mL)调Ph＝7－8，溶液减压浓缩，过MCI GEL 20Y柱(水/甲醇)纯化，得到黄色固体698mg,收率:59.2％；m.p.180-181.5℃.1HNMR(DMSO-d6,400MHz,δppm)1.52(4H,m,2CH2),℃1.96(2H,t,J＝6.8,CH2),2.28(2H,t,J＝6.8,CH2),
7.00(1H,t,J＝8.0,Ar-H),7.27(2H,t,J＝8.0,Ar-H),7.55(2H,d,J＝8.0,Ar-H),8.65(1H,s,CONHOH),9.84(1H,s,NHCO),10.34(1H,s,CONHOH).MS(ESI)m/z:237(M+H)+.HRMS(ESI)m/z:(M+H)+calcd.for C12H17N2O3,237.1234；found,237.1227。

[0064] 实施例2-9：化合物2－9的制备

[0065] 实施例2－9分别制备了化合物2－9。化合物2－9的制备步骤与实施例1中化合物1的制备步骤相同，除了所用原料有所区别。不同之处如下面的表3所示：

[0066] 表3：化合物2－9的制备步骤与实施例1的区别

[0067]

[0068] 实施例10：N-羟基-4-{[苯胺基甲酰基甲基]甲基}苯甲酰胺(化合物10)的制备[0069] 1)溴乙酰苯胺的制备

[0070] 溴乙酸(2.78g,20.0mmol)溶于CH2Cl2(20.0ml)中，冷至-5℃，加入EDC.HCl(3.84g,20.0mmol)，然后滴加入苯胺(1.86g,20.0mmol)的CH2Cl2(10.0ml)溶液，反应液自然升至室温，搅拌过夜。

[0071] 反应液中加入1mol/L HCl(30ml)洗,5％Na2HCO3(30ml)洗，饱和食盐水洗。有机相用无水硫酸钠干燥。浓缩得到粗产物，收率约60％。不必纯化，直接用于下步反应。

[0072] 2)4-[(苯甲酰甲胺基)-甲基]-苯甲酸甲酯的制备

[0073] 5-苯胺基甲酰-戊酸甲酯(1.18g,5.0mmol)溶于甲醇中(50mL)，加入盐酸羟胺(1.40g,20.0mmol)降温至至0℃，滴加入8mol/L的NaOH(10mL)溶液，室温搅拌1－2小时。

[0074] 0℃下向溶液中滴加入1mol/L HCl(50mL)调Ph＝7－8，溶液减压浓缩，过MCI GEL 20Y柱(水/甲醇)纯化，得到黄色固体。

[0075] 溴乙酰苯胺(10.0mmol)，4-(胺甲基)苯甲酸甲酯盐酸盐(2.02g,10.0mmol)和碳酸氢钾(1.50g,15.0mmol)溶于乙腈(100ml)中，溶液回流搅拌3－4小时。

[0076] 减压浓缩，残余物加入水和乙酸乙酯分液，有机相中加入HCl溶液(1mol/L)，析出沉淀，过滤，固体用水洗，得到粗产物，收率约50％。不必纯化，直接用于下步反应。

[0077] 3)N-羟基-4-{[苯胺基甲酰基甲基]甲基}苯甲酰胺的制备

[0078] 4-[(苯甲酰甲胺基)-甲基]-苯甲酸甲酯(149mg,0.5mmol)溶于甲醇中(5mL)，加入盐酸羟胺(140mg,2.0mmol)降温至至0℃，滴加入8mol/L的NaOH(1mL)溶液，室温搅拌1－2小时。

[0079] 0℃下向溶液中滴加入1mol/L HCl(50mL)调Ph＝7－8，溶液减压浓缩，过MCI GEL 1
20Y柱(水/甲醇)纯化，得到白色固体71.3mg，收率:47.7％；m.p.124-126℃.HNMR(DMSO-d6,400MHz,δppm)3.26(2H,s,CH2CO),3.77(2H,s,NHCH2),7.01-7.71(9H,m,Ar-H),9.80(1H,s,CONH).MS(ESI)m/z:300(M+H)+.HRMS(ESI)m/z:(M+H)+calcd.for C16H18N3O3,334.0953；
found,334.0952。

[0080] 实施例11-24：化合物11－24的制备

[0081] 实施例11－24分别制备了化合物11－24。化合物11－24的制备步骤与实施例10中化合物10的制备步骤相同，除了所用原料有所区别。不同之处如下面的表4所示：

[0082] 表4：化合物11－24的制备步骤与实施例10的区别

[0083]

[0084]

[0085] 实施例25：化合物1－24的结构验证

[0086] 如下面的表5所示。

[0087]

[0088]

[0089]

[0090]

[0091]

[0092] 实施例26：肝细胞HepG2中CLA-1启动子活性上调实验

[0093] 1.试剂和材料

[0094] 试验样品：化合物1－24。

[0095] 阳性对照：SAHA和TSA(均购自Sigma公司)。

[0096] 所有测试的化合物都经过HPLC筛选，纯度大于95％，试验浓度均为10μg/mL。

[0097] CLAP-Luc HepG2细胞为本实验室构建的含有CLA-1的启动子的荧光素酶报告基因的HepG2细胞(构建方法可以采用本领域人员知悉的方法，例如可以参考刘晓辉，洪斌，王丽非，杨媛，司书毅，李元；人高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型的建立[J].中国医学科学院学报，2004，26(4)：354-358。)。

[0098] 2.实验方法和步骤

[0099] 检测化合物对CLA-1的启动子(CLA-1promoter，CLAP)活性的影响。

[0100] 将CLAP-Luc HepG2细胞以5×104个/孔接种于96孔细胞培养板中，约6h待细胞贴壁后，分别换为含浓度为10μg/ml化合物1-24的无血清培养液。另设含终浓度0.1％DMSO(溶剂)培养基的孔做空白对照。继续于37℃，5％CO2条件下培养18h后，通过测定各化合物组处理细胞的荧光素酶表达活性，计算化合物对CLA-1启动子的平均上调倍数。对上调倍数明显的化合物进行量效关系研究，分析系列稀释的化合物浓度与启动子活性(荧光素酶表达活性)之间的关系，计算EC50。具体操作步骤参考Luciferase Assay System(Promega)的说明书。

[0101] 3.实验结果

[0102] 结果如下面的表6和表7所示。

[0103] 表6：化合物1－24对CLA-1启动子活性的平均上调倍数

[0104]

[0105]

[0106] 表7：化合物1－9对CLA-1启动子活性的最大上调倍数和EC50

[0107]

[0108]

[0109] 表6和表7的结果显示，本发明的化合物都能够有效地上调CLA-1的活性/水平。

[0110] 实施例27：化合物7对肝细胞HepG2高密度脂蛋白受体CLA-1表达和功能的影响[0111] 一、试剂和材料

[0112] 试验样品：化合物7(庚二酰3－氯苯胺异羟肟酸，本发明中有时也简称为“Cpd-7”)。

[0113] 阳性对照：SAHA和TSA(均购自Sigma公司)。

[0114] MEM-EBSS培养基(Hyclone公司)(含10％标准胎牛血清)用于肝细胞HepG2(购自美国模式菌种收藏中心，ATCC)的培养。

[0115] 二、实验方法和实验结果

[0116] 1.实时定量RT-PCR方法研究Cpd-7对CLA-1转录水平的影响

[0117] (1)细胞总RNA的提取

[0118] 人肝细胞HepG2以5×105个接种60mm细胞培养板，37℃，5％CO2条件下培养24小时后，用冰预冷的PBS漂洗细胞2次，分别加入含0.75、1.5μM(DMSO含量为0.1％)Cpd-7的无血清MEM-EBSS培养基，阳性对照加入含0.6μM(含0.1％DMSO)的TSA。37℃，5％CO2条件下培养24小时后，用Trizol试剂(Invitrogen公司)进行细胞总RNA的提取(具体操作步骤按照试剂盒的说明书进行)并测定所提取RNA的浓度。

[0119] (2)逆转录反应──cDNA的合成

[0120] 采用ThermoScriptTM RT-PCR System试剂盒(Invitrogen公司)进行，具体操作步骤按照试剂盒说明书所述。模板RNA各4μg分别与ThermoScriptTM和引物RT Oligo(dT)20混合，55℃保温60min进行逆转录反应，反应结束后于85℃加热5min以终止反应。所得cDNA可于-20℃保存或继续行以下的PCR反应。

[0121] (3)Real-time PCR检测

[0122] 采用SYBR Green PCR Master Mix将获得的cDNA样品分别配制Real-Time PCR反应体系。体系配置如下：

[0123] 2×PCR Master Mix缓冲液12.5μl；上、下游引物(2μM)各2.5μl；模板7.5μl；总体积25μl。将溶液混合，5000rpm短暂离心。

[0124] 将PCR反应液置于Real-time PCR仪上，按下列反应条件进行PCR反应：

[0125] 95℃，10分钟，1个循环；95℃，15秒，60℃，30秒，78℃，15秒(收集荧光)，40个循环；55℃，1分钟，95℃，1分钟，1个循环；55到95℃，每5秒升高1℃，81个循环检测溶解曲线(Melting Curve)。

[0126] 各样品的目的基因和持家基因磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH,内参)分别进行Real-time PCR反应。每个样品中目的基因的相对含量利用△△Ct法计算，计算公式为：

[0127]

[0128] 实验结果见图1(A)，化合物7能够上调HepG2细胞中CLA-1基因的mRNA水平，0.75μM及1.5μM的Cpd-7作用后，其上调率分别为89.6％和74.4％。

[0129] 2.采用流式细胞仪检测Cpd-7对CLA-1蛋白水平的影响

[0130] (1)HepG2细胞按5×105个/孔接种6孔板；

[0131] (2)37℃，5％CO2条件下培养24h后以PBS漂洗细胞2次，每孔分别加入以无血清培养基稀释的相应浓度的化合物7及SAHA与TSA，同时做无化合物对照；

[0132] (3)24h后以胰酶消化各孔细胞，PBS漂洗细胞1次；

[0133] (4)以4％(w/v)多聚甲醛(用PBS配制，65℃水浴不断搅拌至完全溶解，0.22μm滤膜过滤，4℃保存，2周内有效)2ml，4℃固定细胞过夜或室温固定40min；

[0134] (5)固定结束后，1000rpm离心5min，弃多聚甲醛，并用PBS漂洗细胞1次；

[0135] (6)用1ml含5％FBS的PBS重悬细胞，4℃放置15min；

[0136] (7)1ml PBS洗细胞1次，将细胞均分为两份；

[0137] (8)一抗孵育(1﹕50稀释)：相应的对照管不加一抗稀释液，只加入相同体积的PBS，混匀，4℃放置50min后，1ml PBS洗细胞2次；

[0138] (9)二抗孵育(FITC标记，1:100－1:150稀释)：加入二抗稀释液后将细胞混匀，4℃放置50min后，1ml PBS漂洗细胞2次；

[0139] (10)每管样品加入0.5ml PBS重悬细胞，300目尼龙膜过滤，流式细胞仪检测。

[0140] 实验结果见图1(B)，化合物7能够上调HepG2细胞中CLA-1蛋白水平，0.3μM的Cpd-7作用后，上调率为224.6％，强于0.3μM的SAHA(63.5％)和TSA(135.4％)。

[0141] 3.采用Western Blot检测Cpd-7对CLA-1蛋白水平的影响

[0142] (1)人肝癌HepG2细胞以6×105个接种6孔板，37℃，5％CO2条件下培养24h后，用PBS漂洗细胞2次，分别加入含相应浓度化合物Cpd-7和TSA的无血清MEM培养基1ml，同时对照皿加入含0.1％DMSO的无血清MEM培养基。37℃，5％CO2条件下培养24h～48h；

[0143] (2)冰预冷的PBS漂洗细胞2次，胰酶消化细胞；

[0144] (3)用含10％血清的MEM培养基中和胰酶的作用，将细胞悬液转移至1.5ml EP管中；

[0145] (4)4℃，800rpm离心5min，弃培养液，收集细胞，用冰预冷的PBS漂洗细胞1次，再次离心收集细胞；

[0146] (5)每管加入100μl的RIPA细胞裂解液(50mM Tris-HCL,pH7.4,150mM NaCl,1％NP40,0.1％SDS)，于冰上裂解细胞20min。每隔5min涡旋混合30s；

[0147] (6)4℃，12,000rpm离心5min。将上清转移到新的离心管中，即得细胞总蛋白产物。保存于-70℃；

[0148] (7)用BCA试剂盒对上清进行蛋白定量，将各组蛋白样品调整为同样的浓度。取一定量进行蛋白电泳。电泳完成后进行转膜反应(0.45μm PVDF膜)；

[0149] (8)室温封闭转印膜1h，相对应靶蛋白的PVDF膜与各自的一抗(1﹕1000)孵育过夜；

[0150] (9)用TBST洗膜三次，每次10min。洗涤后用各自对应的HRP标记的二抗室温孵育1h；

[0151] (10)充分洗涤后采用增强型发光检测系统(Millipore公司产品)进行成像，并将各自扫描条带的灰度值标准化到各自内参蛋白的灰度值进行计算。

[0152] 实验结果见图1(C)和1(D)，化合物7可剂量依赖性地上调HepG2细胞中CLA-1的蛋白表达水平，0.75μM及1.5μM的Cpd-7作用后，其上调率分别为91.2％和119.6％。

[0153] 4.采用流式细胞仪检测Cpd-7对细胞摄取DiI-HDL的影响

[0154] 1,1’-双十八烷-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青-高氯酸盐(1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，简称为DiI)是一种紫红色荧光示踪染色物质，属于亲脂性羰花青染料。利用它来标记HDL，可以通过检测胞内的荧光信号强度来研究细胞对高密度脂蛋白胆固醇的摄取能力。

[0155] (1)人肝细胞HepG2以5×104个接种24孔细胞培养板，37℃，5％CO2条件下培养24小时；

[0156] (2)用冰预冷的PBS漂洗细胞2次，分别加入含0.3、0.75、1.5μM(DMSO含量为0.1％)Cpd-7的无血清MEM-EBSS培养基，同时对照孔加入含0.1％DMSO的相应培养基。37℃，5％CO2条件下培养24小时；

[0157] (3)每孔加入2μg/ml DiI-HDL，37℃孵育4h；

[0158] (4)以冷PBS漂洗细胞1次，各孔分别加入1ml含有0.5％BSA和2mM EDTA的PBS，于4℃放置1h；

[0159] (5)轻轻吹打并分散细胞，细胞悬液于4℃，800g离心3min；

[0160] (6)收集细胞重悬于0.5ml PBS中，过300目尼龙网后经流式细胞仪检测荧光值。

[0161] 实验结果见图2，化合物7对HepG2细胞摄取胆固醇的能力具有一定的上调作用(A)-(C)，0.3μM、0.75μM和1.5μM的Cpd-7对HepG2细胞摄取DiI-HDL分别上调了62.5％、60.3％和132.9％，见图2(F)。其中0.3μM的Cpd-7对细胞摄取DiI-HDL的作用要强于0.3μM的SAHA(图2(E)，24.1％)的作用。

[0162] 实施例28：化合物对Apo E基因缺陷小鼠体重、血脂水平及动脉粥样硬化的影响[0163] 1.试剂和材料

[0164] 试验样品：化合物7(Cpd-7)。

[0165] 阳性对照：辛伐他汀(购自上药集团上海信谊医药公司)。

[0166] 待测化合物经过HPLC检测，纯度大于95％，给药浓度经毒性预试验确定为25mg/kg和100mg/kg。

[0167] Apo E基因缺陷小鼠(Apo E-/-)，雄性，八周龄，体重22～25g，购自北京大学医学部实验动物部。

[0168] 血脂指标检测采用北京中生北控生物工程公司的试剂盒进行测定。

[0169] 2.实验方法和步骤

[0170] Apo E-/-小鼠随机分为四组，高脂对照组(High Fat Control，HFC)、低剂量化合物组(Cpd-7，25mg/Kg)、高剂量化合物组(Cpd-7，100mg/Kg)和阳性对照组(辛伐他汀，5mg/Kg)，每组5只。饲以高脂饲料(含20％猪油和0.15％的胆固醇)，同时灌胃给药8周，高脂对照组给予等体积的生理盐水。每三天称取体重一次。

[0171] 饲养期满后，禁食(不禁水)12h，小鼠眼眶静脉采血。分离血浆后,总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)以日立7060型自动生化仪加以测定。分离小鼠主动脉从主动脉弓至耻骨分叉段，剥去外层脂肪，油红O对动脉内壁斑块的脂肪进行染色。在体视显微镜下将主动脉对半剖开，进行en face(前位)分析。

[0172] 3.实验结果

[0173] 实验开始时，各组体重无显著差别。此后，各组动物体重均随着时间延长而缓慢上升。给药各组由于药物的作用，均能明显控制ApoE-/-小鼠体重的增长，其中化合物组(高剂量化合物组和低剂量化合物组)均与高脂对照组差异显著(P＜0.01)，图3显示给药各组都比高脂对照组体重低，且化合物7的效果优于阳性对照辛伐他汀，高低剂量之间呈现剂量依赖性。

[0174] 表8：化合物对ApoE缺陷小鼠血脂水平的影响(mean±SD)

[0175]

[0176] 与高脂对照组相比，*代表P＜0.01

[0177] 表8的结果显示，化合物7八周的药物治疗能使高脂饲料喂养的Apo E-/-小鼠总胆固醇(TC)水平显著下降25％-30％，药效强于辛伐他汀组，与高脂对照组相比具有明显的统计学差异(P＜0.01)。给药组的其他血脂指标同高脂对照组也存在下降的趋势。

[0178] 通过Apo E-/-小鼠en face主动脉脂质沉积染色分析，发现高脂对照组整个主动脉都出现明显的硬化斑块，在主动脉弓部位及其上缘的三大分支(头臂干，左颈总动脉和左锁骨下动脉)都有大量脂质积累，见图4(A)，斑块损伤面积百分比为10.2±2.2％；与此形成鲜明对比的是，化合物组(Cpd-7，25mg/Kg)小鼠病变程度较轻，见图4(B)，主动脉斑块面积明显减少(P＜0.05)，百分比为4.5±2.6％。说明化合物能对动脉硬化治疗发挥积极作用。

[0179] 以上研究结果表明，本发明的化合物能够有效地降低血浆总胆固醇,效果与辛伐他汀组药效相似,并能显著减少Apo E-/-动脉粥样硬化模型小鼠的斑块面积，具有抗动脉粥样硬化作用。

[0180] 尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。