桑黄菌丝体多糖、制备方法及其在抗肿瘤的应用转让专利
申请号 : CN201510271870.7
文献号 : CN104892793B
文献日 : 2017-11-17
发明人 : 马海乐 , 杨小明 , 李世超 , 王振斌 , 任晓锋
申请人 : 江苏大学
摘要 :
本发明公开了桑黄菌丝体多糖、制备方法及其在抗肿瘤中的应用，属于天然产物开发领域。包括如下步骤制备的：通过摇瓶发酵收集桑黄菌丝体，冷冻干燥后，粉粹，经热水提取和乙醇分级沉淀得到桑黄菌丝体粗多糖，DEAE‑52纤维素离子交换层析柱和Sephacryl S‑400凝胶层析柱进一步分离纯化得到桑黄菌丝体多糖IPSW‑1、IPSW‑2、IPSW‑3和IPSW‑4。本发明所制备的桑黄菌丝体多糖IPSW‑1、IPSW‑2、IPSW‑3和IPSW‑4体外可有效地抑制人体肝癌细胞HepG2和肠癌细胞SW480的增殖。本发明所制备的桑黄菌丝体多糖对于制备抗肿瘤药物具有重要的意义。
权利要求 :
1.桑黄菌丝体多糖，为IPSW-1、IPSW-2或IPSW-3，其一级结构重复单元如通式（1）： (1)；
其中，Glc代表葡萄糖，Rha代表鼠李糖，1,3,4,6代表取代基的位置；
其中，IPSW-1、IPSW-2和IPSW-3的分子量分别为34.1 kDa、17.7 kDa和15.1 kDa ；
其中，IPSW-1、IPSW-2和IPSW-3 均为α型D-葡萄吡喃糖；
其中，IPSW-1、IPSW-2和IPSW-3均只包含葡萄糖。
2.权利要求1所述的桑黄菌丝体多糖，来自于桑黄（Phellinus igniarius），属于担子菌亚门（Basidiomycotina）、层菌纲（Hymenomycetes）、非褶菌目（Polyporaceae）、锈革孔菌科（Hymenochaetaceae）、木层孔菌属（Phellinus）、火木层孔菌种（Phellinus igniarius）；
该菌丝体是采用中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心编号为5.95的Phellinus igniarius菌株发酵而获得的。
3.权利要求1所述的桑黄菌丝体多糖，其特征在于：IPSW-1、IPSW-2和IPSW-3都不具有规则的三股螺旋结构。
4.权利要求1所述的桑黄菌丝体多糖的制备方法，其特征在于：桑黄菌丝体经沸水提取，分别采用30%、60%和80%的乙醇分级沉淀得到桑黄菌丝体粗多糖IPS30、IPS60和IPS80，粗多糖分别经DEAE-52纤维素离子层析柱和Sephacryl S-400凝胶层析柱分离纯化得到桑黄菌丝体多糖。
5.权利要求1所述的桑黄菌丝体多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.权利要求5所述的桑黄菌丝体多糖在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：桑黄菌丝体多糖体外可有效地抑制人体肝癌细胞HepG2和肠癌细胞SW480的增殖。
说明书 :
桑黄菌丝体多糖、制备方法及其在抗肿瘤的应用
技术领域
[0001] 本发明属于天然产物开发领域，涉及桑黄菌丝体多糖在抗肿瘤药物中的应用，具体是桑黄菌丝体多糖的制备及结构和其可抑制肿瘤细胞的生长。
背景技术
[0002] 桑黄(Phellinus igniarius)作为珍稀的药用真菌，多糖为其主要活性成分，且由于其良好的抗肿瘤、抗氧化和增强机体免疫功能的作用而得到大量的关注。
[0003] 由于桑黄子实体特殊的生长环境和外部环境条件的限制，使得自然形成的桑黄子实体很少，同时也给人工栽培加大了难度，造成桑黄资源的开发研究缓慢。经研究发现，桑黄菌丝体多糖在抗肿瘤方面和桑黄子实体具有相当的活性。因此采用液体发酵，通过摇瓶发酵得到桑黄(P.igniarius)菌丝体，并对桑黄菌丝体粗多糖进行分离纯化，得到纯度较高的桑黄菌丝体多糖。同时对其进行活性研究和结构分析，使其能够更好地应用于保健品、抗癌药物治疗的开发。
[0004] 本发明所涉及的桑黄(Phellinus igniarius)菌丝体均一多糖的结构，迄今未见相关报道。发明内容：
[0005] 本发明提供桑黄菌丝体均一多糖的制备及结构分析，同时提供了桑黄菌丝体均一多糖的抗肿瘤活性研究。
[0006] 本发明所述的桑黄菌丝体均一多糖是从桑黄菌丝体中获得，其一级结构重复单元如通式(1)：
[0007]
[0008]
[0009] 其中，Glc代表葡萄糖，Rha代表鼠李糖，1,3,4,6代表取代基的位置。
[0010] 本发明的桑黄菌丝体均一多糖的制备方法，按照下述步骤进行：
[0011] 1)桑黄Phellinus igniarius菌种，菌株编号为5.95，购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，桑黄菌丝体摇瓶发酵显示：在接种量10％，温度28℃，转速135r/min，培养8天，得到桑黄菌丝体干重为4.53g/L。
[0012] 2)桑黄菌丝体经热水提取，乙醇分级沉淀得到桑黄菌丝粗多糖IPS30、IPS60和IPS80。
[0013] 3)桑黄菌丝体粗多糖经DESE-52纤维素离子交换柱分离和Sephacryl S-400凝胶柱纯化后得到桑黄菌丝体均一多糖IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4，且经HPSEC-RI-MALLS检测分子量分别为34.1kDa、17.7kDa、15.1kDa和21.7kDa。
[0014] 4)桑黄菌丝体均一多糖IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4的红外光谱分析表明四种均一多糖均为α型D-葡萄吡喃糖。
[0015] 5)桑黄菌丝体均一多糖IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4的气相色谱显示IPSW-1、IPSW-2和IPSW-3都只包含葡萄糖，而IPSW-4含有鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，摩尔比为1.29:1.21:1.0:43.86:1.86。
[0016] 6)桑黄菌丝体均一多糖IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4高碘酸氧化、Smith降解、甲基化和核磁共振分析显示：IPSW-1主链为Glc(1→6)和Glc(1→3,4)，非还原性末端为Glc；IPSW-2主链为Glc(1→6)、Glc(1→3,4)和Glc(1→3，6)，端基为Glc；IPSW-3主链为Glc(1→6)、Glc(1→3,4)和Glc(1→3，6)，非还原性末端为Glc；IPSW-4主链为Glc(1→6)和Glc(1→3,4)，支链为Rha(1→2)，非还原性末端为Glc。
[0017] 7)MTT试验结果显示：桑黄菌丝体均一多糖IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4对体外培养肝癌细胞HepG2和肠癌细胞SW480的增殖具有显著的抑制作用。
[0018] 包含本发明化合物的药物可以作为单独的抗肿瘤药物使用，也可以与其它药物联合使用。
[0019] 包含本发明化合物的药物可以制成各种药物剂型使用。
附图说明
[0020] 图1为均一多糖IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4的红外光谱图。
具体实施方式
[0021] 实施例1：桑黄菌丝体的发酵
[0022] 种子液培养 250mL摇瓶中装新鲜PDB培养基100mL，Phellinus igniarius NO.5.95(CGMCC)菌种接活化后的平板母种5块，每块0.25cm2。置于28℃、135r/min恒温摇床培养振荡8天。
[0023] 上述的1L种子液培养基：200g/L马铃薯，葡萄糖20g/L，KH2PO4 1g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L。
[0024] 摇瓶发酵培养 500mL摇瓶中装新鲜发酵培养基200mL，接种量10％，培养5天。培养条件同种子液培养，得桑黄菌丝体。
[0025] 上述的1L发酵培养基：小麦粉51.6g/L、麸皮13.8g/L、桑枝粉10g/L、KH2PO4 0.98g/L、MgSO4·7H2O 0.54g/L。
[0026] 实施例2；桑黄菌丝体多糖的提取、分离和纯化
[0027] 桑黄菌丝体粗多糖的提取 桑黄菌丝体用蒸馏水冲洗，冻干，粉碎，10倍体积乙醇脱脂两次。除去乙醇后得到的烘干的固体物加10倍体积的蒸馏水沸水浴提取3次，合并上清液，减压浓缩至1/4，加95％乙醇使乙醇最终浓度为30％，离心得到的沉淀冻干并命名为IPS30，继续加95％乙醇使浓度为60％，得沉淀，命名为IPS60，重复，使乙醇浓度为80％，沉淀命名为IPS80。
[0028] 桑黄菌丝体多糖的分离纯化 分别取桑黄粗多糖IPS30、IPS60和IPS80 10g，完全溶解于20mL蒸馏水，上于已经平衡好的DEAE-52纤维素离子交换柱，依次用蒸馏水，0.1、0.2、0.3、0.4mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，自动收集器收集，苯酚硫酸法和示差折光检测器同步检测，合并相同馏分，减压浓缩，透析，冷冻干燥，获得桑黄菌丝体多糖IPS30W、IPS60W和IPS80W。IPS30W、IPS60W和IPS80W复溶于蒸馏水，用Sephacryl S-400凝胶柱层析(1.5×100cm)对离子交换柱分离出的馏分进一步纯化。蒸馏水洗脱，自动收集器收集，RI和苯酚硫酸法同步检测，合并相同馏分，减压浓缩，冷冻干燥，得桑黄菌丝体纯化多糖IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4。
[0029] 桑黄菌丝体纯化多糖的纯度鉴定和分子量测定 高效液相色谱仪(HPLC)联合折光示差检测器(RI)和多角度光散射仪DAWN HELEOS-Ⅱ进行多糖的纯度鉴定和分子量测定，色谱柱：TSK-GEL 3000PW(7.5×300mm)，流动相：0.1mol/L的NaCl溶液，流速：0.5mL/min，柱温：30℃。检测结果表明，IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4都为均一多糖，且分子量分别为34.1kDa、17.7kDa、15.1kDa和21.7kDa。
[0030] 实施例3：桑黄菌丝体均一多糖的结构分析
[0031] 桑黄菌丝体均一多糖的红外光谱分析 取均一多糖IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4各3mg，用KBr压片进行红外光谱检测。图1为IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4的红外光谱图，表示四种均一多糖均为α型D-葡萄吡喃糖。
[0032] 桑黄菌丝体均一多糖的气相色谱分析 通过对桑黄菌丝体均一多糖IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4酸解、水解及乙酰化得到多糖的糖腈乙酸酯衍生物，用气相色谱仪7980A进行气相分析。HP-5石英毛细管柱(30m×320μm×0.25μm)，柱流量1mL/min，采用程序升温。
检测结果表明得出IPSW-1、IPSW-2和IPSW-3都只包含葡萄糖，IPSW-4含有鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，摩尔比为1.29:1.21:1.0:43.86:1.86。
检测结果表明得出IPSW-1、IPSW-2和IPSW-3都只包含葡萄糖，IPSW-4含有鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，摩尔比为1.29:1.21:1.0:43.86:1.86。
[0033] 桑黄菌丝体均一多糖的高碘酸氧化和Smith降解 取20mg各均一多糖IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4进行高碘酸氧化，通过高碘酸的消耗量和甲酸的生成量，初步判断多糖的糖苷键类型。结果显示IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4均含1→或1→6和1→2或1→2,6或1→4或1→4,6的连接类型。多糖的高碘酸氧化产物成进一步进行Smith降解，通过将高碘酸氧化产物按上述步骤制备成糖腈乙酸酯衍生物，进行GC分析，进一步判断多糖存在的糖苷键类型。结果表明四种均一多糖均不含1→4和1→4,6糖苷键。
[0034] 桑黄菌丝体均一多糖的甲基化分析 进行甲基化分析需要将均一多糖IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4完全甲基化，然后再用酸水解断裂多糖的糖苷键，所得产物进行还原和乙酰化，用气相-质谱联用(GC-MS)进行分析。甲基化分析结果分别见表1、表2、表3和表4。
[0035] 表1 IPSW-1的甲基化分析结果
[0036]甲基化糖 连接类型 摩尔比(mol％) 主要质量碎片(m/z)
2,3,4,6-Me4-Glcp 1.06 Terminal 43,71,87,101,117,129,145,161,205
2,3,4-Me3-Glcp 2.59 1,6-linked-Glcp 43,71,87,101,117,129,161,189,259
2,6-Me2-Glcp 1 1,3,4-linked-Glcp 43,71,87,101,117,129,143,231,305[0037] 表2 IPSW-2的甲基化分析结果
2,3,4,6-Me4-Glcp 1.06 Terminal 43,71,87,101,117,129,145,161,205
2,3,4-Me3-Glcp 2.59 1,6-linked-Glcp 43,71,87,101,117,129,161,189,259
2,6-Me2-Glcp 1 1,3,4-linked-Glcp 43,71,87,101,117,129,143,231,305[0037] 表2 IPSW-2的甲基化分析结果
[0038]甲基化糖 连接类型 摩尔比(mol％) 主要质量碎片(m/z)
2,3,4,6-Me4-Glcp 3.09 Terminal 43,71,87,101,117,129,145,161,205
2,4-Me2-Glcp 1.00 1,3,6-linked-Glcp 43,71,89,101,117,162,261
2,3,4-Me3-Glcp 3.39 1,6-linked-Glcp 43,71,87,101,117,129,161,189,233
2,6-Me2-Glcp 1.78 1,3,4-linked-Glcp 43,71,87,101,117,129,143,231,305[0039] 表3 IPSW-3的甲基化分析结果
2,3,4,6-Me4-Glcp 3.09 Terminal 43,71,87,101,117,129,145,161,205
2,4-Me2-Glcp 1.00 1,3,6-linked-Glcp 43,71,89,101,117,162,261
2,3,4-Me3-Glcp 3.39 1,6-linked-Glcp 43,71,87,101,117,129,161,189,233
2,6-Me2-Glcp 1.78 1,3,4-linked-Glcp 43,71,87,101,117,129,143,231,305[0039] 表3 IPSW-3的甲基化分析结果
[0040]甲基化糖 连接类型 摩尔比(mol％) 主要质量碎片(m/z)
2,3,4,6-Me4-Glcp 3.56 Terminal 43,71,87,101,117,129,145,161,205
2,4-Me2-Glcp 1.00 1,3,6-linked-Glcp 43,71,89,101,117,162,261
2,3,4-Me3-Glcp 7.94 1,6-linked-Glcp 43,71,87,101,117,129,161,189,233
2,6-Me2-Glcp 3.63 1,3,4-linked-Glcp 43,71,87,101,117,129,143,231,305[0041] 表4 IPSW-4的甲基化分析结果
2,3,4,6-Me4-Glcp 3.56 Terminal 43,71,87,101,117,129,145,161,205
2,4-Me2-Glcp 1.00 1,3,6-linked-Glcp 43,71,89,101,117,162,261
2,3,4-Me3-Glcp 7.94 1,6-linked-Glcp 43,71,87,101,117,129,161,189,233
2,6-Me2-Glcp 3.63 1,3,4-linked-Glcp 43,71,87,101,117,129,143,231,305[0041] 表4 IPSW-4的甲基化分析结果
[0042]甲基化糖 连接类型 摩尔比(mol％) 主要质量碎片(m/z)
2,3,4,6-Me4-Glcp 2.59 Terminal 43,71,87,101,117,129,145,161,205
2,3,4-Me3-Glcp 3.87 1,6-linked-Glcp 43,71,87,101,117,129,161,189,233
2,6-Me2-Glcp 3.18 1,3,4-linked-Glcp 43,71,87,101,117,129,143,231,305
3,4-Me2-Rhap 1 1,2-linked-Rhap 57,71,87,131,284,328
2,3,4,6-Me4-Glcp 2.59 Terminal 43,71,87,101,117,129,145,161,205
2,3,4-Me3-Glcp 3.87 1,6-linked-Glcp 43,71,87,101,117,129,161,189,233
2,6-Me2-Glcp 3.18 1,3,4-linked-Glcp 43,71,87,101,117,129,143,231,305
3,4-Me2-Rhap 1 1,2-linked-Rhap 57,71,87,131,284,328
[0043] 桑黄菌丝体均一多糖的核磁共振分析 分别称取30mg均一多糖IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4溶于0.5mLD2O，测定1H-NMR和13C-NMR。四种均一多糖1H NMR中异头氢的δ值13
均大于5ppm，且 C NMR化学位移在95-100ppm之间，表明四种均一多糖都属于α型吡喃糖。根据检测结果和上述的高碘酸氧化、Smith降解以及甲基化分析综合分析，得出均一多糖的一级结构重复单元。
均大于5ppm，且 C NMR化学位移在95-100ppm之间，表明四种均一多糖都属于α型吡喃糖。根据检测结果和上述的高碘酸氧化、Smith降解以及甲基化分析综合分析，得出均一多糖的一级结构重复单元。
[0044] 实施例4：桑黄菌丝体均一多糖的抗肿瘤活性试验
[0045] 桑黄菌丝体均一多糖的抑制HepG2和SW480细胞的生长试验 采用MTT法测定均一多糖IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4对HepG2和SW480细胞的抑制作用，平行测定三次，按下面公式计算抑制率。
[0046]
[0047] 结果显示，均一多糖IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4对SW480肠癌细胞和HepG2肝癌细胞增殖均有一定的抑制作用，且对SW480细胞增殖的抑制明显强于HepG2细胞，IPSW-1和IPSW-3对SW480肠癌细胞的半抑制率IC50分别为58.98μg/mL和66.21μg/mL，而四种均一多糖在实验浓度范围内(10-100μg/mL)在实验浓度范围内对HepG2的抑制率均未超过50％。