新的短短芽孢杆菌菌株、培养方法及其应用

摘要

本发明从贵州省大方县的半夏根际土壤中分离筛选得到具有拮抗作用的菌株，经微生物分类学鉴定，该菌株命名为短短芽孢杆菌(brevibacilus brevis)菌株GZDF3，并采用该菌株的发酵液获得一种能够对半夏块茎腐烂病进行防治的生物菌剂。本发明最显著的特征是：提供了一种新的短短芽孢杆菌(brevibacilus brevis)菌株GZDF3，并且该菌株发酵液制备的生防菌剂对半夏块茎病害病原细菌和病原真菌如尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌等具有明显的拮抗作用，是中药材绿色种植产业上重要的微生物资源。

权利要求

1.一种短短芽孢杆菌菌株，其特征在于，命名为短短芽孢杆菌(brevibacillus brevis)菌株GZDF3，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2015年02月10日，保藏登记号：CGMCC No.10121。

2.一种含有如权利要求1所述短短芽孢杆菌GZDF3的生防菌剂，其特征在于，所述菌剂的制备方法按以下步骤进行：(1)短短芽孢杆菌菌株GZDF3的活化：从-80℃超低温冰箱取出菌种GZDF3，用接种环划线于培养基平板上，28-32℃恒温培养26-30小时，长出单菌落；

(2)种子液的制备：挑取上述单菌落接种于30mL NA液体培养基中，28-30℃，200rpm摇床振荡培养10-12小时，获得种子液；

(3)制备液体发酵液：将种子液按接种量1：3.5倍的比例接种于发酵培养基中培养，初始pH7-8、培养温度为30-32℃、200rpm摇床振荡培养36-38小时后，离心过滤收集上清，储存作为生防菌剂。

3.如权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于，所述菌剂的制备方法按以下步骤进行：(1)菌株活化：从-80℃超低温冰箱取出菌种GZDF3，用接种环划线于培养基平板上，30℃恒温培养28小时，长出单菌落；

(2)种子液的制备：挑取上述单菌落接种于30mL NA液体培养基中，30℃，200rpm摇床振荡培养12小时，获得种子液；

(3)制备液体发酵液：将种子液按接种量1：3.5倍的比例接种于发酵培养基中培养，初始pH7.5、培养温度为32℃、200rpm摇床振荡培养36小时后，离心过滤收集上清，储存作为生防菌剂。

4.如权利要求2或3所述的生防菌剂，其特征在于，所述菌株培养基为NA培养基，组分为：牛肉膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂15.0g/L，pH7.0；

所述种子NA液体培养基的组分为：牛肉膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，氯化钠5.0g/L，pH7.0；

所述发酵培养基组分为：1％脱脂奶粉、0.1％酵母提取物、3.7mM KH2PO4、2.9mM K2HPO4、

2.0mM MgSO4·7H2O,、0.7mM NaCl、0.05mM MnCl2·4H2O、0.036mM FeSO4·5H2O、0.15mM CaCl2,pH7.0。

5.如权利要求2或3所述的生防菌剂在防治半夏块茎腐烂病中的应用。

说明书

新的短短芽孢杆菌菌株、培养方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种短短芽孢杆菌(brevibacillus brevis)菌株、培养方法及其制备生防菌剂防治半夏块茎腐烂病等的应用。技术背景

[0002] 半夏为天南星科(学名：Araceae)半夏属多年生草本植物，为一味传统中药，临床应用广泛。传统药用主要集中于化痰湿，止呕，治咽喉肿痛等。随着药理研究的深入，生半夏还广泛用于肿瘤、肺癌、三叉神经痛、失眠、腰痛、结石治疗，疗效显著。为满足不断增加的市场需求，半夏人工种植面积不断扩大，但不容忽视的是在种植进程中，各种病害相继出现，尤其是半夏块茎腐烂病的普遍发生，严重影响了半夏的产量和质量，制约了半夏产业的健康持续发展，迫切需要开发高效的防治方法。

[0003] 块茎腐烂病已成为危害半夏的主要病害之一。一旦发生，半夏块茎会在短时间内腐烂，轻者一周腐烂80％，严重地块在3～5天的时间内，半夏块茎全部烂掉，整个地块的土壤和空气中散发出腥臭的气味，发病率高达15％～30％。病菌侵染半夏块茎的初期，块茎的周边出现不规则的黑色斑点，此斑点向四周迅速扩展，3～4天后，众多的病菌斑点联在一起，继续向块茎内部侵染，此时，半夏根系开始萎缩，地上部的叶片逐渐由绿色变黄、枯萎。1周后，半夏块茎呈圆水泡状，似熟透了的葡萄，块茎内全是黑水，全株死亡，最后只剩下薄薄的外皮。蔓延的病菌会迅速侵染其他半夏块茎，短期内使整个半夏地块全部感染而腐烂，先烂大块茎，后向小块茎蔓延，最后只留下小于1cm的珠芽。此病害也是目前人工栽培半夏最常见、难治疗、危害大、范围广的病害。

[0004] 当前，在半夏生产上尚未培育出有效的抗病品种，也无防治该病的特效药剂。而且长期大量使用各种化学药剂，还会导致病原菌产生抗药性、生态环境遭受严重污染、农产品农残超标等直接威胁用药安全。因此，探索有效的防治手段具有重要意义，而生物防治被认为是最有潜力的防治方法，短短芽孢杆菌作为生防菌，在植物病害防治方面，国内外均有报道。

[0005] 如Edwards SG等在Mode of antagonism of Brevibacillus brevis against Botrytis cinerea in vitro.一文中披露了在短短芽胞杆菌或短杆菌肽S存在时，可以有效抑制大白菜的灰霉病菌生长(J Appl Microbiol.2001,91(4):652-659)；郝晓娟等在短短芽孢杆菌JK-2菌株对番茄枯萎病的抑菌作用及其小区防效中公开了短短芽胞杆菌JK-2可以抑制蕃茄枯萎病的菌丝生长(中国生物防治，2007,23(3):233-236)，对病原菌孢子的萌发也具有明显的抑制作用，同时，还可引起菌丝消解，产生泡状物，破坏生长点，引起细胞内含物外溢等，对番茄枯萎病的盆栽防效和田间防效分别为83.82％和74.7％；陈莉在棉花生防芽孢杆菌A57、A178的抑菌机理、拮抗活性物质及防病、促生作用中公开了短短芽胞杆菌A57对棉花的立枯病、枯萎病等病原真菌具有明显的抑制作用(2007，新疆农业大学硕士学位论文)；易有金等在烟草内生短短芽孢杆菌的分离鉴定及对烟草青枯病的防效中公开了从烟草茎秆中分离得到的一种短短芽孢杆菌属的内生细菌对由青枯雷尔氏菌引起的烟草青枯病具有一定的防效(植物病理学报，2007,37(3)：301-306)。专利CN201010296437.6公开了一种新的短短芽孢杆菌菌株及其应用，该短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的发酵液可以获得一种能够对龙眼进行保鲜的微生物保鲜菌剂；专利CN201010607988.X公开了防治植物真菌病害的短短芽孢杆菌及其用途，该菌株可以有效地应用于瓜枯萎病的防治，并可以用于制备一种安全、高效的生物农药。可见短短芽孢杆菌的应用正在逐渐增多。但本发明从半夏根际土壤分离获得的短短芽孢杆菌菌株，及其在防治半夏块茎腐烂病中的应用，国内外未见报道与利用。

发明内容

[0006] 本发明的目的是针对化学品不安全和半夏生防产品研究较少的不足，提供一种从半夏根际土壤中分离获得的短短芽孢杆菌菌株以用于对半夏块茎腐烂病的防治。

[0007] 本发明的技术方案是：

[0008] 本发明所述短短芽孢杆菌菌株，是从贵州省大方县的半夏根际土壤中分离获得的，命名为短短芽孢杆菌(brevibacillus brevis)菌株GZDF3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年12月01日，保藏编号为CGMCC No.10121。

[0009] 本发明的短短芽孢杆菌(brevibacillus brevis)菌株GZDF3具有下述性质：

[0010] 形态特征：菌株在牛肉膏蛋白胨培养基(NA)中菌落表面光滑，边缘不整齐，无光泽，不透明，浅黄色，圆形或椭圆形，革兰氏染色呈阳性，显微镜下，菌体细胞为杆状。见图1。

[0011] 生理生化鉴定指标如下：

[0012]

[0013] 注：+表示有作用或有反应；—表示无作用或无反应

[0014] 将上述各指标结合16SrDNA分子生物学鉴定，与模式菌株brevibacillus brevis 100599，短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX，短短芽孢杆菌X23等进行序列比对，构建系统进化树，鉴定该菌株为短短芽孢杆菌(brevibacillus brevis)，且为一新亚种。该菌株
16SrDNA大小为1.5kb，Genbank登录号KP137562。

[0015] 本发明短短芽孢杆菌GZDF3的分离培养方法是：

[0016] (1)称取10g半夏根际土壤(5cm)，倒入盛有90ml无菌水的三角瓶中，摇床震荡18-24min，再放入75-85℃的恒温水浴锅中搅拌10-15min，静置4-6min后吸取1mL进行梯度稀释，选用稀释度为10-5、10-4、10-3；

[0017] (2)吸取步骤(1)的土壤稀释液各100μl涂布于NA培养基平板上，然后将平板倒置于28℃恒温箱中培养2-3d，挑取单菌落接种在新的培养基上纯化，重复3-4次，获得纯菌落；

[0018] (3)拮抗试验：采用琼脂打孔法对半夏块茎腐烂病的抑制效果进行评价：即分别将半夏块茎腐烂病病原细菌悬液、病原真菌孢子悬液均匀涂布于PDA平板上，然后每个平板分别用打孔器在距离平板中央2cm处打孔，直径8mm，每个平板打4个孔，分别在每个孔加入150μL菌培养液，于28-32℃恒温培养46-50小时后观察，采用无菌水做阴性对照，农用硫酸链霉素500倍液做阳性对照，通过测量抑菌圈大小筛选分离获得拮抗菌。

[0019] 所述NA培养基配方为：牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂15.0g/L，pH7.0。

[0020] 本发明还提供了采用短短芽孢杆菌(brevibacillus brevis)菌株GZDF3的发酵液，获得一种能够防治半夏块茎腐烂病的生防菌剂。

[0021] 本发明的菌剂经下列步骤得到：

[0022] (1)菌株活化：从-80℃超低温冰箱取出菌种GZDF3，用接种环划线于培养基平板上，28-32℃恒温培养26-30小时，长出单菌落；

[0023] (2)种子液的制备：挑取上述单菌落接种于30mL NA液体培养基中，28-30℃，200rpm摇床振荡培养10-12小时，获得种子液；

[0024] (3)制备液体发酵液：将种子液按接种量1：3.5倍的比例接种于发酵培养基中培养，初始pH7-8、培养温度为30-32℃、200rpm摇床振荡培养36-38小时后，离心收集上清，储存作为生防菌剂。

[0025] 所述菌株培养基为NA培养基，组分为：牛肉膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂15.0g/L，pH7.0。

[0026] 所述种子NA液体培养基的组分：牛肉膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，氯化钠5.0g/L，pH7.0。

[0027] 所述发酵培养基组分：1％脱脂奶粉、0.1％酵母提取物、3.7mM KH2PO4、2.9mM K2HPO4、2.0mM MgSO4·7H2O,、0.7mM NaCl、0.05mM MnCl2·4H2O、0.036mM FeSO4·5H2O、0.15mM CaCl2,pH7.0。

[0028] 本发明的再一目的是提供该菌株生防菌剂在防治半夏块茎腐烂病中的应用，其中半夏块茎腐烂病的病原细菌如胡萝卜果胶杆菌胡萝卜软腐亚种，病原真菌如尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌。

[0029] 本发明的有益效果：

[0030] 一是本发明从半夏根系土壤中分离筛选出对部分半夏块茎腐烂病原细菌和真菌具有较强抑制作用的短短芽孢杆菌GZDF3，为防治半夏细菌和真菌病害提供了一种新的微生物菌株。

[0031] 二是本发明提供了短短芽孢杆菌GZDF3的生防菌剂及其发酵方法；该生防菌剂可应用于植物细菌和真菌病害的防治，平板拮抗实验表明，菌株GZDF3菌剂对半夏块茎腐烂病原细菌和2种病原真菌以及相关植物病原真菌都具有明显的抑制作用，抑菌谱广，抑菌活性强，为生物杀菌剂的开发增添了新的途径。

[0032] 三是本发明的生防菌剂制备容易，且成本较低，无毒、无害、防治效果好，利于绿色有机中药材的种植。

附图说明

[0033] 图1是本发明短短芽孢杆菌菌株GZDF3的菌落形态图。

[0034] 图2是本发明短短芽孢杆菌菌株GZDF3生防菌剂拮抗半夏块茎腐烂病病原细菌效果图。

[0035] 图3是本发明短短芽孢杆菌菌株GZDF3生防菌剂拮抗半夏块茎腐烂病病原尖孢镰刀菌效果图。

[0036] 图4是本发明短短芽孢杆菌菌株GZDF3生防菌剂拮抗半夏块茎腐烂病病原茄病镰刀菌效果图。具体实施方式：

[0037] 以下采用具体的实施例和实验例，进一步证明本发明的效果：

[0038] 实施例1：短短芽孢杆菌菌株GZDF3的分离：

[0039] (1)称取10g半夏根际土壤(5cm)，倒入盛有90ml无菌水的三角瓶中，摇床震荡20min，再放入80℃的恒温水浴锅中搅拌10min，静置5min后吸取1mL进行梯度稀释，选用稀释度为10-5、10-4、10-3；

[0040] (2)吸取步骤(1)的土壤稀释液各100μl涂布于NA培养基平板上，然后将平板倒置于28℃恒温箱中培养2-3d，挑取单菌落接种在新的培养基上纯化，重复3-4次，获得纯菌落；

[0041] (3)拮抗试验：采用琼脂打孔法对半夏块茎腐烂病的抑制效果进行评价：即分别将半夏块茎腐烂病病原细菌悬液、病原真菌孢子悬液均匀涂布于PDA平板上，然后每个平板分别用打孔器在距离平板中央2cm处打孔，直径8mm，每个平板打4个孔，分别在每个孔加入150μL菌培养液，于30℃恒温培养48小时后观察，采用无菌水做阴性对照，农用硫酸链霉素500倍液做阳性对照，通过测量抑菌圈大小筛选分离获得拮抗菌。

[0042] 所述NA培养基配方为：牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂15.0g/L，pH7.0。

[0043] 实施例2：生防菌剂的制备

[0044] (1)菌株活化：从-80℃超低温冰箱取出菌种GZDF3，用接种环划线于培养基平板上，30℃恒温培养28小时，长出单菌落；

[0045] (2)种子液的制备：挑取上述单菌落接种于30mL NA液体培养基中，30℃，200rpm摇床振荡培养12小时，获得种子液；

[0046] (3)制备液体发酵液：将种子液按接种量1：3.5倍的比例接种于发酵培养基中培养，初始pH7.5、培养温度为32℃、200rpm摇床振荡培养36小时后，离心收集上清，储存作为生防菌剂。

[0047] 所述菌株培养基为NA培养基，组分为：牛肉膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂15.0g/L，pH7.0。

[0048] 所述种子NA液体培养基的组分：牛肉膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，氯化钠5.0g/L，pH7.0。

[0049] 所述发酵培养基组分：1％脱脂奶粉、0.1％酵母提取物、3.7mM KH2PO4、2.9mM K2HPO4、2.0mM MgSO4·7H2O,、0.7mM NaCl、0.05mM MnCl2·4H2O、0.036mM FeSO4·5H2O、0.15mM CaCl2,pH7.0。

[0050] 实施例3对半夏块茎腐烂病的防治效果

[0051] 处理方法：试验共设3个处理，处理1为灭菌水对照组，处理2为短短芽孢杆菌GZDF3菌剂，处理3为常用杀菌剂72％农用硫酸链霉素(成都普惠生物工程有限公司)500倍液。将半夏种球种植于带有病原菌的土中，其中处理2种植前用短短芽孢杆菌菌剂浸种30分钟，待种球发芽出土后，用1:100倍菌剂灌根，第一次倒苗时再用1:50倍菌剂进行灌根一次，高温高湿天气，隔20天灌根一次。灭菌水对照组和72％农用硫酸链霉素药剂组处理操作同上。

[0052] 结果显示，灭菌水对照组的半夏叶色变黄、枯萎，块茎开始萎缩，有不同程度腐烂；而短短芽孢杆菌GZDF3菌剂对半夏块茎腐烂病的防治效果达到85.6％，优于化学药剂组(防治效果为68.8％)。说明采用本发明的短短芽孢杆菌GZDF3菌株及其发酵制成的菌剂，对半夏块茎腐烂病的防治具有良好效果，见图2、图3、图4。为半夏药材种植和药材质量保证提供了新的防治方法和生防产品。