用于制备整料柱的方法

摘要

制备分离柱或在微制装置中的通道的方法，包括以下步骤：提供未填充的柱或在微制装置中的通道；用活化剂活化柱或通道的内壁；用包含单体、至少一种成孔剂和至少一种聚合引发剂的混合物的聚合溶液填充柱；和在柱或通道中聚合所述混合物以形成刚性多孔整料聚合物塞。所述方法特征在于所述单体包含作为主要单体的二乙烯基苯和丙烯酸异癸酯的混合物，和所述至少一种成孔剂包含异丁醇。

权利要求

1.制备分离柱或在微制装置中的分离通道的方法，其包括以下步骤：提供未填充的柱或包含未填充通道的微制装置；用活化剂活化柱或通道的内壁；用包含单体、至少一种成孔剂和至少一种聚合引发剂的混合物的聚合溶液填充该柱或通道；和将所述混合物聚合以在柱或通道中形成刚性多孔整料聚合物塞，其中所述活化剂用可以结合到所述整料聚合物的分子或基团将该柱或通道的内壁预功能化；

其特征在于所述单体包含作为主要单体的二乙烯基苯和丙烯酸异癸酯的混合物，和所述至少一种成孔剂包含异丁醇，其中丙烯酸异癸酯与二乙烯基苯的比率范围为1:6至1:100 v/v。

2.权利要求1的方法，其中至少未填充柱或通道的内壁包含选自玻璃、陶瓷、金属和有机聚合物的材料。

3.权利要求2的方法，其中所述未填充柱是毛细管熔凝二氧化硅柱。

4.权利要求1、2或3的方法，其中活化所述柱或通道的内壁的表面包括用硅烷化剂硅烷化。

5.权利要求4的方法，其中所述柱或通道的内壁的材料为玻璃或钢，且其中在硅烷化所述表面之前，所述表面被蚀刻剂蚀刻。

6.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述柱或在微制装置中的通道的内部直径为

0.05 mm或更小。

7.权利要求1的方法，其中丙烯酸异癸酯与二乙烯基苯的比率范围为1:10至1:30 v/v。

8.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述至少一种成孔剂选自异丁醇，和异丁醇与辛醇的混合物。

9.权利要求1-3中任一项的方法，其中在所述聚合溶液中的总单体浓度范围为20-50 % v/v。

10.权利要求1-3中任一项的方法，其中在所述聚合溶液中的丙烯酸异癸酯的浓度范围为0.1-15 %v/v。

11.权利要求10的方法，其中在所述聚合溶液中的丙烯酸异癸酯的浓度范围为1-5 % v/v。

12.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述成孔剂还包含选自氯仿、四氢呋喃、甲苯和二甲苯的至少一种成微孔剂。

13.权利要求4的方法，其中所述硅烷化在40-70℃的温度下进行2-30分钟。

14.权利要求13的方法，其中所述硅烷化剂包含1-20 % v/v γ-(三甲氧基-甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯(γMAPS)。

15.权利要求5的方法，其中所述未填充柱或通道的内壁包括玻璃，并且所述蚀刻剂是碱溶液，其中蚀刻在40-70℃的温度下进行。

16.权利要求15的方法，其中所述未填充柱或通道的内壁包括熔凝二氧化硅；所述蚀刻剂是浓度为0.5-2 M的氢氧化钠水溶液。

17.权利要求1-3中任一项的方法，其中聚合在60-80℃的温度下和1-10巴的正压下进行。

18.权利要求17的方法，其中聚合进行20-300分钟。

19.权利要求18的方法，其中聚合进行20-180分钟。

20.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述至少一种聚合引发剂是热或UV引发剂。

21.权利要求20的方法，其中所述至少一种聚合引发剂选自2,2’-偶氮二异丁腈(AIBN)和过氧化月桂酰(LPO)。

22.分离柱或包含分离通道的微制装置，其可通过权利要求1-21中任一项的方法获得。

23.权利要求22的分离柱或包含分离通道的微制装置用于纳米尺度分离的用途。

24.权利要求22的分离柱或包含分离通道的微制装置用于制备型分离的用途。

25.权利要求22的分离柱或包含分离通道的微制装置用于分析型分离的用途。

26.权利要求25的用途，用于进行化学分析方法，其包括将所述柱或通道与检测器连接。

27.聚合组合物，其包含：

20-40% v/v二乙烯基苯，

1-15% v/v丙烯酸异癸酯，

20-40% v/v异丁醇，

20-40% v/v辛醇，

1-10% v/v氯仿或二甲苯或甲苯、或氯仿和/或二甲苯和/或甲苯的混合物。

28.聚合组合物，其包含：

25-35% v/v二乙烯基苯；

1-5% v/v丙烯酸异癸酯；

25-35% v/v异丁醇；

25-35% v/v辛醇。

29.权利要求27的聚合组合物，其进一步包含0.15-1.5% w/w 2,2’-偶氮二异丁腈(AIBN)或0.3-4% w/w过氧化月桂酰(LPO)。

说明书

用于制备整料柱的方法

发明领域

[0001] 本发明涉及制备用于液相色谱的柱，更具体是聚合物整料柱，其特别用于肽和其它分子的纳米尺度分离。

[0002] 发明背景

[0003] 蛋白质组学可被定义为蛋白质的大尺度分析，并且有希望在临床研究中发现未来的生物标志物。在自底向上的蛋白质组学中，待分析的蛋白质组中的蛋白质被鉴定，并且它们的氨基酸序列和翻译后修饰通过以下来表征：蛋白水解酶消化，接着通过质谱法(MS)分析得到的肽。如果蛋白质的数量大，则相应的肽的数量甚至更大，因为当用特异性酶例如胰蛋白酶切割时，许多蛋白质产生超过10个肽。因此，必须将分离和检测的有力工具应用于成功的蛋白质组学实验。与电喷质谱连接的液相色谱(LC-MS)或者与串联质谱连接的液相色谱(LC-MS/MS)提供分离和选择性检测这样的巨大量的肽的解决方案。分子离子在大气压下通过电喷射离子化(ESI)产生，这被认为是一种浓度灵敏性方法。

[0004] 通过使用具有低内径(ID)的色谱柱可改善灵敏性，因为肽将随后以较低的体积洗脱，并因此以较高的浓度提供。理论上，该浓度上的相对增加将提供信号上的相应增加。以该方法，通过使用具有非常低的ID的柱将提供更加灵敏的分析。因此，例如，可显示在理论上，在肽的液相色谱分离中将柱ID从4.6缩减至0.02 mm，得到分离的肽的浓度相对增加(和由此在电喷质谱法中灵敏度增益的相应增加)约52,900倍。当今，该类型的缩减在蛋白质组学工作中非常常见，并且通常通过使用具有0.075 mm ID的柱，流动相的流量被降低至几百纳升/分钟。

[0005] 如其它研究者已证实，甚至可能进一步缩减液相色谱，以实现极度灵敏的LC-MS分析。然而，因为难以用颗粒填充非常狭窄的毛细管，市售可得的填充柱在技术上仍限制在0.075 mm ID。理论上，与制备整料柱有关的这样的限制和困难不存在。

[0006] 在整料柱中，分离介质为可与不含有颗粒间空隙的单一大“颗粒”相比较的形式，换句话说，所述分离介质为连续介质。因此，所有流动相必须通过固定相流动。该对流极大加速了传质速率。与作为在色谱过程期间在颗粒固定相的孔内传质的典型驱动力的扩散相反，通过孔的对流能够显著增加分离速度。

[0007] 因为连续分离介质提供的相对于填充柱的优点，近些年来连续分离介质的开发已经吸引了大量的关注。基本上，已经使用了两种类型的整料材料，第一种基于改性的二氧化硅凝胶，第二种基于有机聚合物。然而，尽管连续二氧化硅凝胶介质在聚合过程期间收缩，这使其难以制备实际有用的具有小内径的二氧化硅凝胶基整料柱，但当通过合适的有机单体在具有内径小到0.1 mm的熔凝二氧化硅毛细管中原位聚合来制备整料柱时，未见这些困难。

[0008] 聚合混合物可使用多种单体制备，对于保留和分离选择性的变化而言，这允许几乎不受限制地选择基质和表面化学两者。丙烯酰胺、聚苯乙烯和甲基丙烯酸酯整料柱可被提及作为频繁使用的实例。通常添加成孔剂(porogen)或成孔溶剂，以控制所得整料的多孔结构。

[0009] 多种聚合物整料柱，包括狭窄ID毛细管柱，和其制备方法已在现有技术中有所描述。

[0010] WO 2007/149498 A2公开了分离毛细管柱或在微制装置中的通道，其通过功能单体和交联单体(其增强聚合物基质的强度)的原位共聚合作用制备。苯乙烯基单体例如苯乙烯和二乙烯基苯，或者甲基/丙烯酸基单体例如丁基或硬脂基甲基丙烯酸酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯，是优选的。极性成孔溶剂(或成孔剂)，例如乙醇、甲醇、丙醇或乙腈用于所述反应。柱可以稳健的方式制备为具有极狭窄的ID，例如5-15 µm，使得它们适合用于超痕量LC/MS蛋白质组学分析。

[0011] WO 2004/064974 A2公开了制备用于毛细管柱或者在微制装置(微芯片)中的通道的超-纳米尺度-LC整料分离介质的方法，和通过所述方法制备的毛细管。在整料聚合过程期间向毛细管的两端施加适度的正压，允许制备具有极低ID例如25 µm和更小的整料毛细管柱，具有提高的传质性质和低的背压，以及优秀的保留时间的柱间再现性。在优选的实施方案中，苯乙烯被选为单体、四氢呋喃(THF)和正-辛醇被选为惰性成孔剂，以及二乙烯基苯(DVB)作为交联剂。偶氮二异丁腈(AIBN)作为自由基引发剂。其它合适的可交联单体包括甲基丙烯酸酯。

[0012] US 7,473,367 B2公开了制备整料色谱柱的方法，即通过添加含有成孔剂的聚合混合物至容器，并且使聚合混合物在所述容器中聚合以形成呈色谱柱形状的整料色谱聚合物塞，至少一部分聚合通过以下实现：施用足够的压力至聚合混合物以防止在聚合的整料聚合物塞中壁通道开口，并且同时以受控的升高温度加热聚合混合物。示例性反相介质基于共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)、共聚(硬脂基甲基丙烯酸酯-二乙烯基苯)或共聚(丁基甲基丙烯酸酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯)。

[0013] 类似的整料柱和其制备方法公开于WO 2006/017620 A2、US 2010/0038298 A1、WO 00/15778 A1、EP 2335820 A1、US 2011/0086409 A1和WO 00/46281 A2。

[0014] 然而，非常少的整料产品是市售可得的，并且通常这些的ID为0.1 mm和更高。狭窄ID整料柱的制备是困难的，这是因为聚合过程和毛细管的预涂布似乎依赖于毛细管的ID。因此，在小瓶中和甚至在0.1 mm毛细管中似乎完美起作用的解决方案可能在0.05 mm ID和更低的毛细管中根本不起作用。

[0015] 本发明的一个目的是提供制备改进的整料柱的方法，所述整料柱可具有低于0.05 mm的ID，并且其可方便地用于肽和其它分子的灵敏性分离。其它目的和优点将从以下描述中显而易见。

[0016] 发明简述

[0017] 上述目的通过本发明的方法实现，所述方法产生柱或在微制装置中的通道，其优选(但不排除)具有狭窄的内径，内部有均匀的整料结构，并且其可用于生物学以及非生物学化合物的灵敏性分离。

[0018] 根据本发明，这通过小心优化整个聚合程序来实现。

[0019] 更具体而言，本发明经设计用于制备整料柱(或通道)，其ID优选可低于0.05 mm，并且其基于选择性使用(i)单体即二乙烯基苯(DVB)和丙烯酸异癸酯(IDA)的特定组合；和(ii)特定的成大孔剂或成大孔剂混合物，即异丁醇或异丁醇/辛醇混合物。

[0020] 在一方面，本发明由此涉及制备分离柱或在微制装置中的通道的方法，包括以下步骤：提供未填充的柱或在微制装置中的未填充的通道；用活化剂活化柱或通道的内壁；用包含单体、至少一种成孔剂和至少一种聚合引发剂的混合物的聚合溶液填充柱；和将混合物聚合以形成在柱或通道中的硬质和多孔的整料聚合物。所述方法的特征在于所述单体包含作为主要单体的二乙烯基苯和丙烯酸异癸酯的混合物，并且所述至少一种成孔剂包含异丁醇。

[0021] 通常，在柱或通道内形成的硬质整料聚合物塞经洗涤以除去任何残留的未反应成分。

[0022] 本文所用的术语“分离”以广泛的意义解释，并且包括分析型和制备型色谱分离以及固相提取(SPE)，包括固相微提取(SPME)。典型的色谱应用包括分析型液相色谱(LC)、制备型LC、纳米-LC、HPLC。

[0023] 柱或通道的材料可选自各种不同的材料。典型的柱材料包括玻璃(包括熔凝的二氧化硅)、金属例如不锈钢、塑料(例如聚醚醚酮-PEEK)、玻璃衬里(例如硅酸硼衬里)或熔凝的二氧化硅衬里的不锈钢或塑料管。

[0024] 用于微制装置(例如芯片实验室(LOC)装置)的典型材料包括玻璃、陶瓷、金属和有机聚合物，例如聚烯烃、聚酰亚胺、PDMS (聚二甲基硅氧烷)。

[0025] 在所述方法的(当前)优选的实施方案中，柱或在微制装置中的通道的内径(ID)为约0.05 mm或更小。这样的毛细管柱优选由熔凝的二氧化硅制成。

[0026] 用于活化或预官能化未填充柱或通道的内壁表面以锚定或结合聚合物整料至内壁表面的合适的试剂和方法将根据柱或通道表面材料的材料而选择，并且在各种具体情况或情景中可由技术人员来选择。一般而言，活化包括共价结合分子或基团至表面，其可在聚合时进一步结合至聚合物网络。

[0027] 例如，玻璃和金属(例如不锈钢)表面可优选通过用能够结合至聚合物整料的硅烷化试剂硅烷化而预官能化。示例性的硅烷化试剂包括γ-(三甲氧基-甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯(γMAPS)，例如1-20 % (v/v)。γMAPS是包含可聚合的双键的硅烷化试剂，其允许锚定至聚合物。

[0028] 表面的活化之前优选通过用蚀刻剂蚀刻以简化或改进后续活化。对于玻璃表面(包括熔凝的二氧化硅)，蚀刻可例如用氢氧化钠水溶液进行，以糙化表面，并由此增加表面积和提供更多的活化位点。钢表面可例如用盐酸或草酸蚀刻以在表面上产生金属氧化物，然后以其它方式使表面硅烷化或活化。通常，不锈钢表面必须用溶剂(例如丙酮)清洁，以除去表面-保护性加工油，然后蚀刻。

[0029] 优选地，“温和的”或“柔和的”程序用于蚀刻和硅烷化柱或通道壁，尤其用于硅烷化玻璃表面，例如毛细管熔凝二氧化硅柱或玻璃衬里的塑料或金属管的内表面。

[0030] 蚀刻然后用碱溶液，优选浓度为0.5-2 M的氢氧化钠水溶液，在约40-约70℃的温度下进行，并且硅烷化优选在约40-约70℃的温度下进行约2-约30分钟，例如约2-约15分钟。

[0031] 在聚合溶液中的丙烯酸异癸酯与二乙烯基苯的比率(v/v)优选范围在约1:6至约1:100，更优选约1:6至约1:40，特别是约1:10至约1:30，例如约1:10至约1:20。

[0032] 所述至少一种成孔剂优选为选自异丁醇和异丁醇与辛醇的混合物的成大孔剂。

[0033] 优选地，所述成孔剂还包括至少一种选自氯仿、四氢呋喃、甲苯和二甲苯的成微孔剂。

[0034] 在一个实施方案中，所述成微孔剂选自氯仿和二甲苯。

[0035] 在另一个实施方案中，所述成微孔剂选自甲苯和四氢呋喃。

[0036] 优选聚合物溶液中总单体浓度范围为约20-约50 % (v/v)，例如约30-约40 % (v/v)。

[0037] 聚合物溶液中的丙烯酸异癸酯浓度优选范围为约0.1-约15 % (v/v)，更优选约1-约15 % (v/v)，尤其是约1-约5 % (v/v)。

[0038] 聚合反应适合在约60-约80℃下和在约1-约10巴正压进行，优选进行约20-约300分钟，更优选约20-约180分钟，例如20-120分钟。

[0039] 一种或多种聚合引发剂可选自多种引发剂 ，但适合为热引发剂(thermoinitiator)或UV引发剂，并且其通常选自2,2’-偶氮二异丁腈(AIBN)、过氧化月桂酰(LPO)和过氧化苯甲酰(BPO)，尤其是AIBN和/或LPO。

[0040] 另一方面，本发明涉及分离(优选毛细管)柱或在微制装置中的分离通道，其可通过本发明的方法获得。

[0041] 本发明的又一方面涉及分离(优选毛细管)柱或包含一个或多个通道的微制装置(例如LOC)，其中所述柱或微制装置中的至少一个通道通过本发明的方法已被整料聚合物填充。

[0042] 本发明的又一方面涉及上述方面的这样的分离柱或在微制装置中的通道用于纳米尺度的分离的用途。

[0043] 本发明的另一方面涉及上述方面的这样的分离柱或通道用于制备型分离的用途。

[0044] 本发明的又一方面涉及上述方面的这样的分离柱或通道用于分析型分离的用途。

[0045] 本发明的又一方面涉及进行化学分析方法的方法，其包括以下步骤：

[0046] 提供上述方面的分离柱或在微制装置中的通道；

[0047] 将所述柱或通道与检测器连接；和

[0048] 进行化学分析方法。

[0049] 在另一方面，本发明涉及聚合组合物，其包含：

[0050] 20-40% (v/v)二乙烯基苯，优选30-40% (v/v)，更优选25-35% (v/v)，[0051] 1-15% (v/v)丙烯酸异癸酯，优选1-5%(v/v)，

[0052] 20-40% (v/v)异丁醇，优选25-35% (v/v)，

[0053] 20-40% (v/v)辛醇，优选25-35% (v/v)，

[0054] 1-10% (v/v)氯仿或二甲苯或甲苯或氯仿和/或二甲苯和/或甲苯的混合物。

[0055] 在优选的实施方案中，上述方面的聚合组合物进一步包含0.15-1.5% (w/w) 2,2’-偶氮二异丁腈(AIBN)或0.3-4% (w/w)过氧化月桂酰(LPO)。

[0056] 可使用本发明的分离柱或在微制装置中的通道分离的生物学化合物的实例包括DNA、蛋白质、肽、激素、神经递质、糖肽、糖蛋白、氨基酸、碳水化合物、脂质、多糖、脂肪酸和磷脂。非生物学有机化合物的实例包括有机药物、药品、着色剂、毒药、污染物、食物添加剂和其代谢物。

[0057] 在下文中，本发明将更详细地进行描述。以附图进行参照。

[0058] 附图简述

[0059] 图1是内部进行的实验性装置的示意图，用于在本发明的聚合物整料的制备中用液体填充毛细管柱。

[0060] 图2是色谱仪器装置的示意图，0.05 mm ID聚合物整料的短段用作捕获柱，使样品注射能够以高的流速进行以缩短样品注射时间。

[0061] 图3显示在来自脑脊液(CSF)样品的胰蛋白酶肽分离中获得的两个基峰强度(BPI)色谱A和B，A：商业柱, Acquity nanoUPLC (Waters, USA)；和B：通过本发明的方法制备的聚合物整料柱。

[0062] 图4是在600 mm长和0.05 mm ID聚合物整料柱上，如图3中来自CSF的胰蛋白酶肽的色谱B所对应的BPI色谱，所述柱通过本发明的方法制备，使用0.05 mm ID聚合物整料的短段作为捕获柱(如图2所示)以加速注射时间。

[0063] 图5显示用于分离具有m/z 416.2的两种单一带电物类的离子色谱，在以下柱上分离，A：商业柱, Acquity nanoUPLC (Waters, USA)；和B：通过本发明的方法制备的聚合物整料柱。

[0064] 图6显示用于分离具有m/z 613.8的单一带电物类的色谱，在以下柱上分离，A：商业柱, Acquity nanoUPLC (Waters, USA)；和B：通过本发明的方法制备的聚合物整料柱。

[0065] 图7显示用于在600 mm长和0.05 mm ID聚合物整料柱上分离来自果实提取物的多种原花青素的色谱，所述柱通过本发明的方法制备，使用捕获柱的装置。

[0066] 图8显示在600 mm长和0.03 mm ID聚合物整料柱上，来自CSF的胰蛋白酶肽的基峰强度(BPI)色谱，所述柱通过本发明的方法制备，流动相流速为A) 100 nL/min，和B) 200 nL/min。

[0067] 图9显示用于来自乙腈沉淀的血浆蛋白的上清液的胰蛋白酶肽的LC-MS分离的基峰强度(BPI)色谱，使用通过本发明的方法制备的150 mm长和2.1 ID聚合物整料柱。

[0068] 发明详述

[0069] 如上文所述，本发明涉及制备整料柱、优选毛细管柱或在微制装置中的通道的方法，其能够进行高度灵敏纳米尺度分离肽和其它分子，和其优选具有0.05 mm或更小的狭窄内径(ID)。

[0070] 尽管本发明不限于柱或通道的内径或材料，但以下描述将很大程度地涉及熔凝的二氧化硅毛细管柱。

[0071] 在进一步描述本发明之前，下文给出整料柱的一般性描述和它们的制备。

[0072] 聚合物整料柱

[0073] 整料色谱固定相由单段的高度多孔材料组成，其不含有填充色谱床所特有的颗粒间空隙。整料内部的大多数孔开口，形成通道的互联网络。

[0074] 为了制备有机聚合物毛细管整料柱或在微流芯片中的通道，熔凝的二氧化硅毛细管典型地填充有包含合适量的单体、交联单体、聚合引发剂和成孔溶剂的混合物的聚合混合物。毛细管的两个末端被密封，并且通过加热或通过紫外(UV)辐射开始聚合。通常使用二腈或偶氮-引发剂例如AIBN或过氧化物引发剂例如LPO或BPO，当加热时其分解形成自由基(热引发剂)。尽管聚合混合物中的单体(包括交联剂)控制最终整料材料的极性，但孔尺寸分布将是数个条件的结果，包括非反应性成孔溶剂混合物的组成。

[0075] 与标准悬浮聚合相反，整料柱的合成以非搅拌模式进行。在成孔溶剂的存在下，因为交联过程和溶剂混合物中聚合物的不溶解性两者，聚合物核开始从混合物沉淀。最终，整料系统形成，其孔体积分数大约对应成孔剂的体积分数。

[0076] 孔的大小和形态依赖于数个因素，包括聚合温度、聚合时间和所得聚合物的成孔剂的溶解力。对聚合物具有良好溶解力的溶剂有助于形成微孔和介孔，而大孔用仅与聚合物不良相互作用的溶剂产生。

[0077] 为了锚定整料聚合物主体至熔凝的二氧化硅壁，有必要蚀刻和硅烷化毛细管或通道，然后引入聚合混合物。否则，当用高流动相应用压力时，柱会有被挤出的风险。蚀刻通过糙化来增加表面积上的反应基团数量，而硅烷化提供整料的锚定位点。通常，在用氢氧化钠水溶液处理内壁后，硅烷化用γ-三甲氧基-甲硅烷基丙基甲基丙烯酸酯(γMAPS)进行。

[0078] 本发明

[0079] 根据本发明，小心优化上述总聚合程序，使得可能制备具有0.05或更低、例如0.03或0.02 mm的ID的聚合物整料柱，其具有增加的灵敏性，以允许分离肽和其它分子。然而，本发明的方法不限于这样的纳米尺度类型的整料柱，而是还包括制备较大直径的整料柱，包括通常具有大至10-100 mm ID的ID的制备规模的柱(将多孔整料结构浇铸在这些柱中，有可能比用颗粒填充更便宜)。

[0080] 示例性的柱材料包括(但不限于)玻璃，特别是熔凝二氧化硅、玻璃衬里的钢或塑料、塑料例如PEEK、金属例如钢(优选不锈钢)。对于狭窄直径的柱，熔凝二氧化硅毛细管柱是目前优选的。

[0081] 本发明的方法基于用含有作为主要单体的二乙烯基苯(DVB)与较少量的作为共聚单体的丙烯酸异癸酯以及作为成大孔剂的异丁醇或异丁醇和辛醇的混合物组合的聚合混合物填充柱，优选在通过相对“温和的”程序将毛细管柱壁硅烷化后进行，全部都在预定的条件下。因此，可制备具有灵敏分离特征的均匀整料结构。

[0082] 现在将描述可如何进行本发明的方法的非限制性实例：

[0083] 聚合物整料柱的制备

[0084] 液体填充装置

[0085] 为填充液体到熔凝二氧化硅毛细管中，有利地使用图1所示类型的和将在实验部分中更详细描述的装置。简单地说，该装置包括内部制造的与Swagelok高压设备联接，使用Teflon套圈以连接含有液体的10 mm玻璃管，并且通过使用PEEK-套管(0.38 mm ID)以密封毛细管。通过使用T-连接器，通过来自侧方的氮气流施加压力(0.2-6巴)。该装置比使用常规使用的具有用于密封毛细管的隔膜的玻璃小瓶更加稳健和可再现。

[0086] 具有0.05 mm的ID和0.36 mm的OD的熔凝二氧化硅毛细管切成优选的长度，例如1000 mm。熔凝二氧化硅毛细管壁的处理和硅烷化描述于文献中，但在本发明中经过重要的修改，如下文所述。

[0087] 硅烷化程序

[0088] 1. 用2M NaOH填充毛细管并将毛细管浸入热水中，通常在约65℃下约5 min。

[0089] 2. 用水和/或酸(例如2 M盐酸或硫酸)冲洗至中性pH，然后用水和丙酮冲洗。

[0090] 3. 用含10% γ-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯(γMAPS)的二甲苯填充毛细管，并将毛细管浸入热水中，通常在约65℃下经约20 min，例如7 min。

[0091] 4. 用丙酮冲洗。

[0092] 乙烯基与内壁的连接将允许整料牢固地连接至毛细管，并且将因此阻止整料被液相色谱分析所必需的高压流动相挤出。

[0093] 聚合程序

[0094] 硅烷化之后，毛细管用聚合溶液填充，所述溶液包含：

[0095] 1. 单体(二乙烯基苯(DVB)和丙烯酸异癸酯(IDA))

[0096] 2. 成大孔剂(异丁醇、辛醇)，

[0097] 3. 成微孔剂(氯仿、四氢呋喃、甲苯或二甲苯，或这些的两种或更多的组合)[0098] 4. 引发剂(2,2’-偶氮二异丁腈(AIBN)、过氧化月桂酰(LPO)或过氧化苯甲酰(BPO)。

[0099] 填充之后，出口被一段橡胶加盖，由此保持优选的内部压力。随后，将毛细管浸入热水(65-70℃)中30-120 min以开始热诱导的聚合。所有参数经非常小心地优化和控制。聚合之后，整料柱的冲洗可通过使用乙腈的高压流进行。此后，柱可用于纳米尺度的液相色谱肽分离，优选用质谱(MS)检测。

[0100] 现在将更详细地描述硅烷化和聚合步骤。

[0101] 硅烷化

[0102] 如上文所提及，有必要将整料结构锚定至熔凝二氧化硅壁，以阻止当在高压下应用流动相时的挤出。这通常通过蚀刻/硅烷化毛细管的内壁来实现。蚀刻糙化表面，以增加表面积，和硅烷化引入用于在聚合期间共价连接聚合物网络的反应基团。

[0103] 在本发明的优选实施方案中，蚀刻和烷基化程序被显著改进，以保持熔凝二氧化硅壁被活化，但仍然是光滑的，以阻止硅烷化试剂γ-三甲氧基-甲硅烷基丙基甲基丙烯酸酯(γMAPS)的聚合，并最终阻止与壁附近的厚层聚合。代替常规使用的高温(120℃)和长时间(2h)，本发明方法使用约40-70℃，例如约65℃，和约2-15分钟例如约5分钟或更少，以用2M NaOH水溶液代替常规使用的1M NaOH进行蚀刻。这阻止壁的不可接受的糙化。毛细管的冲洗通常用水和丙酮进行。

[0104] 硅烷化用溶于二甲苯的约1-20 % (v/v)、优选约10% (v/v)的γMAPS的溶液进行，但没有如通常现有技术所用的添加自由基抑制剂(DPPH)。硅烷化反应在约60-70℃、优选在约65℃下进行约2-30分钟，通常约2-15分钟，例如约7分钟。这与通常用于现有技术硅烷化的120℃和6小时相反。冲洗通过丙酮进行。

[0105] 这阻止γMAPS的聚合，并允许更受控制和有限的硅烷化。还阻止多孔聚合物整料结构免于在壁上形成厚层，并因此在壁上具有与整料的剩余部分类似的形态。最重要的是，然而，该柔和的硅烷化程序仍足以有效地锚定整料。这通过整料不被从毛细管挤出得以证明，甚至当施用10,000 psi的压力时。

[0106] 聚合

[0107] 如上所述，使用AIBN、LPO或BPO作为热引发剂的自由基聚合可通常用于制备多孔聚合物整料。

[0108] 二乙烯基苯(DVB)作为80%纯度的工业化学品容易获得(还含有约19%的乙基乙烯基苯)，并在过去已用于制备液相色谱分离的聚合物整料。除非另有说明，否则本文所用的术语DVB是指该80%纯度的工艺级DVB。

[0109] 最多报告的用多孔聚合物整料柱的工作是使用几乎40% (v/v)的单体浓度(典型地包括DVB和苯乙烯)。在本发明中，通过在聚合混合物中主要使用DVB，有可能降低总单体浓度至约30-35 % (v/v)或甚至更低。

[0110] 起初，当在小瓶中研究聚合时，当使用这样的低DVB浓度时，获得沉淀和不均匀的聚合物结构。这还在毛细管内形成间隙和不均匀的整料结构。因此，不同的成孔剂被开发用于产生更均匀的聚合。

[0111] 当仅辛醇被用作成大孔剂时，观察到沉淀和不均匀的聚合。通过添加异丁醇至聚合混合物，在小瓶中观察到更加浑浊和均匀的聚合。这是出乎意料的，因为理论上，异丁醇不是聚-二乙烯基苯的良溶剂。辛醇和异丁醇的浓度和比率可用于调整整料的形态和大孔结构。通常，使用20-40% (v/v)、优选25-35% (v/v)辛醇和20-40% (v/v)、优选25-35% (v/v)异丁醇的混合物。还可任选地包括异丙醇和环己醇作为成大孔剂。

[0112] 通常，使用约1-10% (v/v)、特别是5-10 % (v/v)浓度的形式为氯仿、四氢呋喃、甲苯或二甲苯的成微孔剂。

[0113] 从文献已知，成微孔剂的浓度可用于控制整料的介孔结构。根据本发明，发现添加第二单体丙烯酸异癸酯(IDA)，有效控制整料的孔结构。没有丙烯酸异癸酯的情况下，观察到大的大孔隙，并且整料不太适合分离肽。然而，通过添加仅较少量的丙烯酸异癸酯，例如0.1-15% (v/v)，通常1-5 % (v/v)，与DVB浓度相比包括大约1:10左右，孔尺寸被显著减小。

[0114] 因此，丙烯酸异癸酯是本发明的关键的成微孔剂。要注意，DVB本身是液体，将用作成微孔剂。此外，DVB与丙烯酸异癸酯的共聚合将引入烷基链到聚合物表面上，由此有助于改进肽的分离。预期DVB比丙烯酸异癸酯反应更快，并因此产生大部分的交联内部结构，而丙烯酸异癸酯可能更多地存在于表面上。

[0115] 得到的重要的观察结果是使用较高浓度的丙烯酸异癸酯产生具有更多颗粒形成的聚合，即凝胶或颗粒或溶解的橡胶的悬浮液，类似于胶而不是所需的整料结构。因此，似乎丙烯酸异癸酯以与其它成微孔剂例如四氢呋喃或氯仿不同的方式有效改变整料的形态。

[0116] 使用丙烯酸异癸酯的另一关注的方面是与其它丙烯酸酯相比，纯丙烯酸异癸酯均聚物特别低的玻璃转变温度(-60℃)。这表明，丙烯酸异癸酯通过减少总聚合物结构的链的刚性引入橡胶样共聚。因此，聚合物中少量的丙烯酸异癸酯有可能通过所谓的橡胶韧化过程为整料提供额外的强度和稳定性。橡胶韧化使聚合物当受压迫时的脆性降低，并因此有益于避免当毛细管弯曲时整料的折断。

[0117] 用于本发明的典型的聚合组合物包含(重量百分比, w/w)：

[0118] DVB 20-40%，优选25-35%

[0119] 丙烯酸异癸酯 1-15%，优选1-5%

[0120] 异丁醇 20-40%，优选25-35%

[0121] 辛醇 20-40%，优选25-35%

[0122] 氯仿 1-15% (或二甲苯或氯仿和二甲苯的组合)

[0123] (相同的百分比范围将在体积(v/v)基础上适用，除了氯仿范围是1-10 (v/v)%)。

[0124] 向上述组合物添加AIBN至浓度为0.15-1.5% (w/w)，和添加AIBN至单体比率为0.5-5% (w/w)。或者可添加0.3-4% LPO。

[0125] 在极狭窄的熔凝二氧化硅毛细管的限制内的用于多孔聚合物整料的填充和聚合的条件是重要的。如上所述，对于用聚合混合物填充毛细管，本发明的方法使用升高的压力，优选使用经设计用于该目的的上文简述的特定装置(在标题“液体填充装置”下)，并且其将在下文实验部分中更详细地描述。当然，用于聚合的压力的最佳选择将是聚合混合物的粘度的结果。

[0126] 另一重要的观察结果是作用在聚合混合物上的毛细管力和静电的可能性。在较高的压力下，在毛细管出口处观察到微滴斥力，即微滴在外部向上拉，指示电荷转移至流经硅烷化毛细管的聚合液体。在填充期间通过增加粘度或通过使用较低的压力，斥力降低。预期在填充期间还可能发生相分离，这是由于作用于液体的毛细管力。

[0127] 因此，均匀填充毛细管所需的时间似乎是重要的。通常，至少30分钟，和在某些情况下60-180分钟或甚至60-300分钟可用于填充毛细管，以确保内部的均匀内容物。当浸入热水浴中时填充毛细管也可用于加速制备过程。在填充期间的时间、温度、压力和甚至毛细管的震动或摇动被确定是本发明的方法的重要参数，以在聚合之前保证均匀和无泡填充。还重要的是，避免不溶解的引发剂、熔凝二氧化硅玻璃块或其它碎片进入毛细管。

[0128] 填充压力将随毛细管柱的ID而改变。尽管例如2巴可用于填充50 µm毛细管，但4巴可能对于30 µm管是必需的，和5巴对于20 µm管是必需的。

[0129] 在填充和封闭毛细管出口后，压力可进一步增加，然后通过增加温度开始聚合。通常，聚合通过仅将填充的毛细管浸入热水(60-80℃)中，优选在65-69℃的温度下和约1巴-约10巴的压力下进行。

[0130] 如上所述，制备的聚合物整料不局限于限制在熔凝的二氧化硅毛细管中，而是还能够掺入到其它类型的纳米尺度分离装置中，例如基于芯片的系统，包括例如芯片实验室(LOC)装置。

[0131] 在下文中，本发明将进一步通过一些非限制性实施例进行说明。

[0132] 实验部分

[0133] 实验装置

[0134] 为将液体填充至熔凝二氧化硅毛细管，使用图1所述装置。在该装置中，将卷曲的熔凝二氧化硅毛细管1连接至试剂玻璃管2，此处100 x 10 mm OD，含有液体3，通过内部制造的与SwagelokTM高压设备联接。具体而言，管2连接至SwagelokTM 10 mm至1/8”连接器4，并通过10 mm TeflonTM套圈固定。该连接器4进而通过1/8” OD不锈钢管5连接至SwagelokTM T连接器6。后者通过SwagelokTM 1/8”至1/16”连接器连接0.36 mm OD熔凝二氧化硅毛细管1并将其密封，1/16” OD和0.38 mm ID PEEK套管通过1/16” PEEK套圈(未显示)连接至所述连接器。导管7经过塞和气阀8连接T-连接器6至压缩氮气源(未显示)，通过所述塞和气阀8，可施加0-10巴的氮气压。在所述情况下，熔凝二氧化硅毛细管1用橡胶塞9加盖，并浸入恒温水浴10中。

[0135] 聚合物整料柱的制备

[0136] 600 mm长和0.05 mm ID柱

[0137] 600 mm长和0.05 mm ID聚合物整料柱按下述程序制备。

[0138] · 将约940 mm长的熔凝二氧化硅毛细管切断，并插入到PEEK套管中，和推挤通过压力设备。入口侧(玻璃管侧)通过显微镜检查碎片，如果存在，则进行新的切割。

[0139] · 含有2M NaOH的试剂管通过收紧TeflonTM套圈连接，并且将毛细管浸渍。施加压力(2巴表压)，5分钟冲洗后，将卷曲的毛细管浸入恒温水浴(65-68℃) 5分钟，可留住液流。然后将卷曲的毛细管拿出水浴，压力设备通气，移出玻璃管和用含有纯净水(18 MOhm)的管更换。在2巴下冲洗毛细管5min，然后通气和在2巴下用含丙酮的玻璃管类似冲洗5 min。

[0140] · 然后将压力设备通气，并连接含有10 % yMAPS的二甲苯的玻璃管。在2巴下冲洗毛细管5 min，并将卷曲的毛细管浸入恒温水浴(65-68℃) 7分钟，可留住液流。将卷曲的毛细管拿出水浴，压力设备通气，移出玻璃管，和用含丙酮的管更换。在2巴下冲洗毛细管5。

[0141] · 聚合混合物通过添加15.5 mg AIBN至玻璃管中，然后添加850 µL二乙烯基苯、90 µL丙烯酸异癸酯、90 µL氯仿、800 µL辛醇和800 µL异丁醇制备。添加之间进行称重，允许记录准确的有效组成。通过涡流使玻璃管混合1 min，超声处理5 min，最终通过涡流混合
1 min。

[0142] · 然后压力设备通气，连接含聚合混合物的玻璃管。在2巴下在室温冲洗毛细管5 min，为了有效的热冲洗(留住液流)，将卷曲的毛细管浸入恒温水浴(68℃) 10分钟。然后将毛细管出口拿出水浴，通过将毛细管刺入4-5 mm至橡胶软塞或隔膜牢固加盖。然后将整个卷曲的毛细管浸入水浴用于聚合，其进行40 min的时间。已发现聚合所需的时间非常依赖于AIBN的浓度。作为指导，相对于单体的AIBN的浓度为1.25、1.75或2 % (w/w)，分别将需要聚合时间80、40或20分钟。然而，这种关系可随聚合混合物和温度、AIBN的纯度、熔凝二氧化硅毛细管ID或其它参数的变化而改变。

[0143] · 聚合之后，将毛细管取出水浴，压力设备通气，在浸渍水平以下切断毛细管。应聚合约650 mm的毛细管。将该毛细管连接至360 µm熔凝二氧化硅高压设备，通过20 µm ID和360 µm OD熔凝二氧化硅毛细管从注射器供应纳米流液体。在6000 psi，将聚合物整料柱用乙腈冲洗约30 min，然后使用400 nL/min的流速约30 min。聚合物整料然后备用作液相色谱柱，其可被切成600 mm长度。50 mm长度可用作捕获柱。

[0144] 600 mm长和0.03 mm ID柱

[0145] 600 mm长和0.03 mm ID聚合物整料柱以与上述对于0.05 ID柱的相同方法制备，但对于所有操作，压力相应从2巴增加至4巴。

[0146] 通过上述程序，使用下表1中实施例1-5指示的组成和条件制备了5个聚合物整料柱，即3个0.05 mm ID柱(实施例1-3)、1个0.03 mm ID柱(实施例4)和1个0.02 mm ID柱(实施例5)。

[0147]

[0148] 150 mm长和2.1 mm ID柱

[0149] 150 mm长和2.1 mm ID聚合物整料柱按下述程序制备。

[0150] · 1/8” OD、2.1 mm ID和150 mm长的不锈钢管用丙酮去油，接着用35%发烟盐酸活化60 min，接着用水冲洗和在95℃下干燥过夜。

[0151] · 硅烷化用含10% yMAPS的二甲苯在75℃进行60 min，接着用二甲苯和丙酮冲洗。

[0152] · 聚合混合物由29.7%辛醇、29.4%异丁醇、10.7%氯仿、2.5%丙烯酸异癸酯、26.3%二乙烯基苯和1.4%过氧化月桂酰组成。

[0153] · 硅烷化不锈钢管用聚合混合物填充，并在两末端加盖，接着在75℃聚合90分钟。

[0154] · 然后用两个不锈钢1/8”至1/16”异径接头装配聚合物整料柱，并连接至乙腈的高压供给用于以0.4 mL/min的流速冲洗出未反应的组分和溶剂约30分钟。

[0155] · 然后将柱安装在与检测器(例如质谱)连接的液相色谱上，用于进行化学分析。

[0156] 分离实验

[0157] 来自脑脊液(CSF)的胰蛋白酶肽的分离

[0158] 使用与表1实施例2指示的类似组成和条件，按上所述制备的聚合物整料柱600 x 0.05 mm ID应用于分离来自脑脊液(CSF)的胰蛋白酶消化肽。使用按标准设备安装的环注射器(环大小2 µl)将样品注入到商业化纳米UPLC系统(Waters, USA)上。

[0159] 注射：2 µl，400 nL/min 　(0-19 min)

[0160] 流速：200 nL/min　　　　(20-70 min)

[0161] 流动相

[0162] 组成：A) 0.1%甲酸

[0163] 　　 B) 含0.1%甲酸的乙腈

[0164] 梯度：2% B 　 (0-20 min)

[0165] 　　 30% B 　(50 min)

[0166] 　　 70% B 　(60 min)

[0167] 结果显示于图3，色谱B。

[0168] 用于比较，相同样品还在填装有1.7 μm颗粒的商业化150 mm长和0.075 mm ID C18 nanoAcquity 柱(Waters, USA)上分离。在该情况下，使用捕获柱以加速注射，因此肽的洗脱比直接注射在聚合物整料上早大约20分钟发生。

[0169] 注射：2 µl，10 µL/min (捕获柱)

[0170] 流速：300 nL/min

[0171] 流动相

[0172] 组成：A) 0.1%甲酸

[0173] 　　 B) 含0.1%甲酸的乙腈

[0174] 梯度：2% B (0-2 min)

[0175] 　　 30% B (30 min)

[0176] 　　 80% B (40 min)

[0177] 结果显示于图3，色谱A。

[0178] 在图3的色谱B中，为了缩短分离的注射时间(大约20 min)，在样品注射期间通过使用较高的流速，构建含有捕获柱的图2所示的装置。

[0179] 此处在注射器21和分析毛细管柱22之间经由毛细管23 (20 µm ID)、连接管29和T-连接器24，提供形式为0.05 mm ID聚合物整料的短段的聚合物整料捕获柱20用作分析柱，所述T-连接器24还通过20 µm ID毛细管26 (20 µm ID)连接通气口25。分析柱22进一步通过纳米-电喷发射器27 (Pico-Tip®)连接至Q-TOF质谱仪。通过T-连接器30将高电压引入至液流。在3-5 µl/min (4000-6000 psi)注射时将通气口25连接至废料28，并在注射后堵上以引导液流至分析柱22。

[0180] 这类似于用于商业化Acquity nanoUPLC柱(Waters, USA)的标准装置。使用不同的低体积装置，和在每一点上将死体积最小化。传递毛细管和聚合物整料毛细管两者的切割边缘通过显微镜观察，然后连接。

[0181] 来自CSF的胰蛋白酶肽以高流速注入到该捕获柱上，并在600 mm长和0.05 mm ID聚合物整料上进一步分离。因为分析流速低至200 nL/min，到达柱的梯度时间将相当长。因此，使用较高流速(400 nL/min) 9 min开始梯度，从而在柱前部的驻留体积中停止梯度，然后设置流速为200 nL/min。

[0182] 注射：2 µl，3 µl/min经5 min/(捕获柱)

[0183] 流速 400 nL/min (1-9 min)

[0184] 　　 200 nL/min (10-50 min)

[0185] 流动相

[0186] 组成：A) 0.1%甲酸

[0187] 　　 B) 含0.1%甲酸的乙腈

[0188] 梯度：2% B (0-1 min)

[0189] 　　 8% B (8 min)

[0190] 　　 10% B (10 min)

[0191] 　　 30% B (30 min)

[0192] 　　 80% B (40 min)

[0193] 结果显示于图4。

[0194] 峰曲线比较

[0195] 对于峰曲线比较，对不同的肽物质，绘制离子色谱。图5显示具有m/z 416.2的两个单一带电物类的分离，其在以下上分离：A) 商业Acquity nanoUPLC (Waters, USA)，和B) 按上述制备的聚合物整料。图6显示具有m/z 613.8的单一带电物类的相应分离，其在以下上分离：A) 商业Acquity nanoUPLC，和B) 按上述制备的聚合物整料。

[0196] 原花青素的分离

[0197] 使用按上述制备的600 mm长和0.05 mm ID聚合物整料柱，使用带有捕获柱的装置，将从果实提取的多种原花青素分离和通过质谱法检测。结果在图7中显示。

[0198] 用600 mm长和0.03 mm ID聚合物整料柱分离来自脑脊液(CSF)的胰蛋白酶肽[0199] CSF的分离用按上文表1实施例4制备的600 mm长和0.03 mm ID聚合物整料柱进行。上文来自CSF的胰蛋白酶肽的相同样品的分离以流动相流速100 nL/min和200 nL/min进行。结果分别显示在图8的色谱A和B。

[0200] 用150 mm长和2.1 mm ID聚合物整料柱分离来自血浆的胰蛋白酶肽

[0201] 来自血浆的胰蛋白酶肽的分离用上述制备的150 mm长和2.1 mm ID聚合物整料柱进行。分离以流动相流速0.4 mL/min进行，使用0.1%甲酸和乙腈(2-50%乙腈)的梯度混合物。结果在图9中显示。

[0202] 本发明不限于上述优选的实施方案。可使用各种改变、修改和等价物。因此，上文的实施方案不应被认为是限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求来限定。