用于治疗疼痛的作为autotaxin抑制剂的吡啶并-或吡咯并-稠合嘧啶衍生物

摘要

本发明提供式I的化合物、其可药用盐：其中X是键或CH2；R选自和；R1和R2各自独立地选自CH和N；R3是H或CH3；R4是H或CH3；L选自‑O(CH2)3‑、‑C(O)NH(CH2)2‑、‑CH2C(O)NH(CH2)2‑、‑(CH2)3N(C(O)CH3)CH2‑、‑(CH2)2N(C(O)CH3)CH2‑、‑(CH2)3NH‑、(CH2)2OCH2‑、‑(CH2)4‑、‑(CH2)2NHCH2‑、‑(CH2)3O‑和‑CH2O(CH2)2‑。本发明的化合物是autotaxin抑制剂。

权利要求

1.式I的化合物或其可药用盐：

其中X是键或CH2；

R选自

和 ；

R1和R2各自独立地选自CH和N；

R3是H或CH3；

4

R是H或CH3；

L选自-O(CH2)3-、-C(O)NH(CH2)2-、-CH2C(O)NH(CH2)2-、-(CH2)3N(C(O)CH3)CH2-、-(CH2)2N(C(O)CH3)CH2-、-(CH2)3NH-、(CH2)2OCH2-、-(CH2)4-、-(CH2)2NHCH2-、-(CH2)3O-和-CH2O(CH2)2-。

2.根据权利要求1的化合物或盐，其中R是 。

3.根据权利要求2的化合物或盐，其中R1是CH。

4.根据权利要求2或3任一项的化合物或盐，其中R2是N。

5.根据权利要求1或2的化合物或盐，其中L选自-(CH2)4-、-O(CH2)3-、-(CH2)2OCH2-、-(CH2)3O-和-CH2O(CH2)2-。

6.根据权利要求5的化合物或盐，其中L是-(CH2)2OCH2-。

7.根据权利要求5的化合物或盐，其中L是-O(CH2)3-。

8.根据权利要求1至3任一项的化合物或盐，其中L选自-(CH2)2N(C(O)CH3)CH2-、-(CH2)

3N(C(O)CH3)CH2-和 -CH2C(O)NH(CH2)2-。

9.根据权利要求1或2的化合物或盐，其中X是键。

10.根据权利要求1或2的化合物或盐，其中X是CH2。

11.根据权利要求1的化合物或盐，其是1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-[2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基]乙酮。

12.根据权利要求1的化合物或盐，其是1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-

6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]-2-[2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基]乙酮。

13.药物组合物，其包含根据权利要求1至12任一项的化合物或其可药用盐以及一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。

14.根据权利要求1至12任一项的化合物或其可药用盐在制备用于治疗疼痛的药物中的用途。

15.下式的中间体化合物：

。

16.下式的中间体化合物：

。

说明书

用于治疗疼痛的作为autotaxin抑制剂的吡啶并-或吡咯并-

稠合嘧啶衍生物

[0001] 本发明涉及双环嘧啶化合物或其可药用盐及其治疗用途。本发明的化合物是autotaxin抑制剂。

[0002] Autotaxin是一种被报道为溶血磷脂酸（LPA）来源的酶，溶血磷脂酸（LPA）通过其同源受体之一LPA1上调疼痛相关蛋白质。LPA是影响许多生物和生物化学过程的细胞内脂质介质。autotaxin介导的LPA生物合成的靶向抑制可提供预防神经损伤引起的神经性疼痛的新型机制。希望抑制autotaxin的化合物为需要治疗疼痛的患者提供一种可能的治疗选择。

[0003] 与骨关节炎（OA）相关的疼痛据报道是造成OA患者的下肢残疾的主要症状。超过两千万美国人已被确诊OA——最常见的关节病。当前已批准的OA疼痛疗法可能是侵袭性的，在长期使用时损失效力并可能不适用于治疗所有患者。需要用于遭受OA相关疼痛的患者的另外治疗选择。抑制autotaxin的化合物代表用于具有OA相关疼痛的患者的另一可能的治疗选择。

[0004] 美国专利7,524,852（‘852）公开了取代双环嘧啶衍生物作为抗炎药。

[0005] PCT/US2011/048477公开了吲哚化合物作为autotoxin抑制剂。

[0006] 需要提供autotaxin抑制的新型化合物。本发明提供作为autotaxin抑制剂的新型化合物。本发明提供抑制LPA生成的某些新型化合物。希望autotaxin抑制剂化合物为autotaxin介导的病症，如疼痛和与OA相关的疼痛提供治疗。

[0007] 本发明提供式I的化合物或其可药用盐：

[0008]

[0009] 其中X是键或CH2；

[0010] R选自

[0011] 和 ；

[0012] R1和R2各自独立地选自CH和N；

[0013] R3是H或CH3；

[0014] R4是H或CH3；

[0015] L选自-O(CH2)3-、-C(O)NH(CH2)2-、-CH2C(O)NH(CH2)2-、-(CH2)3N(C(O)CH3)CH2-、-(CH2)2N(C(O)CH3)CH2-、-(CH2)3NH-、(CH2)2OCH2-、-(CH2)4-、-(CH2)2NHCH2-、-(CH2)3O-和-CH2O(CH2)2-。

[0016] 本发明还提供治疗患者的疼痛的方法，其包括给予需要这种治疗的患者有效量的式I的化合物或其可药用盐。本发明还提供治疗患者的与骨关节炎相关的疼痛的方法，其包括给予需要这种治疗的患者有效量的式I的化合物或其可药用盐。

[0017] 本发明提供用于治疗，特别是用于治疗疼痛或用于治疗与OA相关的疼痛的式I的化合物或其可药用盐。本发明还提供式I的化合物或其可药用盐用于制备用于治疗疼痛的药物的用途。本发明还提供式I的化合物或其可药用盐用于制备用于治疗与OA相关的疼痛的药物的用途。

[0018] 本发明进一步提供包含式I的化合物或其可药用盐以及一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。本发明还包括用于合成式I的化合物的新型中间体和方法。

[0019] 术语“可药用盐”是指被认为可接受临床使用和/或兽用的本发明的化合物的盐。可药用盐和它们的常用制备方法是本领域中公知的。参见例如P. Stahl等人, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, (VCHA/Wiley-VCH, 
2002)；S.M. Berge等人, “Pharmaceutical Salts”, Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, 1977年1月。

[0020] 本文所用的术语“治疗”是指抑制、减慢、停止或逆转已有症状、病症或障碍的进展或严重程度。症状、病症或障碍可呈现为“急性”或“慢性”事件。在急性事件中，化合物在症状、病症或障碍开始时给药并在事件消失时停用。在与该症状或事件相关的障碍或病症的过程中治疗慢性事件，其中慢性治疗不依赖于该症状或事件的特定表现。本发明考虑了急性和慢性治疗。

[0021] 本发明的化合物抑制autotaxin并可用于治疗伴随着autotaxin的增加的疾病或病症。本发明的化合物抑制LPA的生成并可用于治疗伴随着LPA的增加的疾病或病症。与其它LPA脂质介质相比，本发明的化合物可抑制autotaxin介导的LPA生物合成。本发明的化合物可用于治疗伴随着LPA1结合的增加的疾病或病症。

[0022] 本文所用的“患者”是指需要治疗的动物，优选但不限于哺乳动物。一个优选实施方案是哺乳动物患者，其优选是人类。另一优选实施方案是伴侣动物患者，如狗、猫或家禽。

[0023] 本文所用的术语“有效量”是指在单剂量或多剂量给药于患者后在被诊断或治疗的患者中提供所需作用的本发明的化合物或其可药用盐的量或剂量。要理解的是，由医师根据相关情况，包括要治疗的病症、所选给药途径、给予的实际活性剂、个体患者的年龄、体重和反应以及患者症状的严重程度和其它相关情况决定实际给予的活性剂的量。

[0024] 本发明的化合物优选配制成通过可生物利用该化合物的任何途径给药的药物组合物。此类组合物最优选用于口服给药。此类药物组合物及其制备方法是本领域中公知的。参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy（D.B. Troy编辑, 第21版, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006）。

[0025] 技术人员会认识到，结构 包括所有互变异构形式。为避免疑问，该结构包括容易通过互变异构互换的异构体。该结构包括例如互变异构体 和。

[0026] 式I的化合物特别可用于本发明的治疗方法，但某些基团、取代基和构型对式I的化合物是优选的。下列段落描述此类优选基团、取代基和构型。要理解的是，这些优选既适用于本发明的治疗方法，又适用于本发明的新型化合物。

[0027] R优选是 。

[0028] R1优选是CH。

[0029] R2优选是N。

[0030] 优选地，当R1是CH且R2是N时，L是(CH2)2OCH2或O(CH2)3。

[0031] 优选地，当R是 时，R3和R4各自是H。

[0032] 优选R3和R4中仅一个是CH3。

[0033] X优选是键。

[0034] X优选是CH2。

[0035] 尤其优选地，X是键且L是-(CH2)3NH-。优选地，X是键，R是 ，R1是CH，且L是-(CH2)2OCH2-或(CH2)2OCH2.及其盐。尤其优选地，X是键，且L是-(CH2)2OCH2-。更优选地，X是键，且L是-CH2O-，且R是 。优选地，X是CH2，R是 ，R1是CH，R2是N，L是-(CH2)2OCH2-或(CH2)2OCH2.及其盐。

[0036] 尤其优选地，X是CH2且L是-(CH2)2OCH2-且R是 。

[0037] 优选的化合物是：

[0038] H-{3-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-3-氧代丙基}-2-(1H-咪唑-1-基)乙酰胺、2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酸3-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)丙酯、1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-5-(1H-咪唑-1-基)戊-1-酮、2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酸3-(1H-咪唑-1-基)丙酯、1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-[2-(1H-咪唑-1-基)乙氧基]乙酮及其可药用盐。

[0039] 优选的化合物是：

[0040] 1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-[2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基]乙酮、1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-5-(4H-1,2,4-三唑-3-基)戊-1-酮、1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-3-(1H-1,2,3-三唑-4-基甲氧基)丙-
1-酮、2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酸3-(1H-四唑-5-基)丙酯、1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-{[2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙基]氨基}乙酮、2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-n-[3-(1H-1,2,3-三唑-4-基)丙基]-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酰胺、N-{2-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-氧代乙基}-N-[3-(1H-1,2,3-三唑-4-基)丙基]乙酰胺、N-{2-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-氧代乙基}-n-[2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙基]乙酰胺、N-{3-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-3-氧代丙基}-2-(1H-1,2,3-三唑-5-基)乙酰胺、N-{3-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-3-氧代丙基}-1H-1,2,3-三唑-4-甲酰胺及其可药用盐。

[0041] 优选的化合物是：

[0042] 1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]-5-(1H-四唑-5-基)戊-1-酮、1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]-2-{[2-(1H-1,2,3-三唑-5-基)乙基]氨基}乙酮、2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酸3-(1H-四唑-5-基)丙酯、2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-N-[3-(1H-1,2,3-三唑-4-基)丙基]-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-
6-甲酰胺、2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酸3-(1H-咪唑-5-基)丙酯、1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]-4-(1H-1,2,3-三唑-5-基氧基)丁-1-酮、1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,
7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]-2-[2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基]乙酮；及其可药用盐。

[0043] 尤其优选的化合物是：

[0044] 1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]-2-[2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基]乙酮；和1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-[2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基]乙酮；及其可药用盐。

[0045] 制备和实施例

[0046] 下列“制备和实施例”进一步例示本发明并代表本发明的化合物的典型合成。应该理解的是，作为举例说明而非限制阐述“制备和实施例”且本领域普通技术人员可作出各种修改。在下示方案中，除非另行指明，所有取代基如上定义。在下列方案中，为清楚起见，某些立体化学中心未指定且某些取代基已消除，这无意以任何方式限制这些方案的教导。此外，本领域普通技术人员可以在式I的化合物的合成中的任何方便的点通过如选择性结晶技术或手性色谱法之类的方法分离或拆分单个的异构体、对映体或非对映体（参见例如，J. Jacques等人, “Enantiomers, Racemates, and Resolutions”, John Wiley and Sons, Inc., 1981，和E.L. Eliel和S.H. Wilen “Stereochemistry of Organic Compounds”, Wiley-Interscience, 1994）。试剂和起始物质通常是本领域普通技术人员可得的。另一些可通过与已知的结构类似化合物的合成和下列“制备和实施例”描述的程序（包括任何新型程序）类似的有机和杂环化学的标准技术制备。

[0047] 除非作出相反的指示，本文例举的化合物使用ACDLABS或Symyx Draw 3.2命名和编号。

[0048] 一般而言，由式II的化合物制备其中X是键或CH2的式I的化合物。更具体在方案A中，其中X是键或CH2的式II的化合物与式VII的化合物在碳二亚胺、1-羟基苯并三唑和碱，如三乙胺存在下偶联以提供其中X是键或CH2的式I的化合物。合适的溶剂包括二氯甲烷。

[0049] 或者在方案A中，可以由式IV的化合物制备其中X是键或CH2的式I的化合物。更具体地，使其中X是键或CH2的式IV的化合物与叠氮化物源，如叠氮基三甲基硅烷在硫酸铜(II)存在下在溶剂，如二甲基甲酰胺/水中反应以提供其中X是键或CH2的式I的化合物。可通过使式III的化合物与3-丁炔-1-醇和碱，如氢化钠在溶剂，如四氢呋喃中反应来制备其中X是键或CH2的式IV的化合物。可通过使式II的化合物与2-氯乙酰氯和碱，如三乙胺在溶剂，如二氯甲烷中反应来制备其中X是键或CH2的式III的化合物。

[0050]

[0051] 如方案B中所示，可以由其中Pg是胺保护基的式V的化合物制备其中X是键或CH2的式II的化合物。更具体地，使其中X是键或CH2；且Pg是叔丁氧基羰基的式V的化合物与酸，如盐酸在溶剂，如四氢呋喃中反应以提供其中X是键或CH2的式II的化合物。

[0052]

[0053] 在方案C中，可以由式VI的化合物制备其中X是CH2；且Pg是叔丁氧基羰基的式V的化合物。更具体地，使N-叔丁氧基羰基-4-哌啶酮相继与(CH3)2NCH(OCH3)2在溶剂，如二甲基甲酰胺中反应，然后与式VI的化合物、碱，如碳酸钾在助溶剂，如乙醇中反应以提供其中X是CH2且Pg是叔丁氧基羰基的式V的化合物。可通过使2,3-二氢-1H-茚-2-胺盐酸盐和1H-吡唑-1-甲脒（carboximidamide）盐酸盐与碱，如二异丙基乙胺在溶剂如乙腈中反应来制备式VI的化合物。

[0054]

[0055] 在方案D中，可通过使2-氯-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酸叔丁酯和2,3-二氢-1H-茚-2-胺在碱，如N-乙基-N-异丙基丙-2-胺存在下在溶剂如1-甲基吡咯烷-2-酮中反应来制备其中X是键且Pg是胺保护基，如叔丁氧基羰基的式V的化合物。

[0056]

[0057] 一般而言，可以由3-丁炔-1-醇使用多个合成步骤制备式VII的化合物。更具体在方案E中，使其中Pg1是羧酸保护基，如叔丁基的式VIII的化合物与酸，如三氟乙酸在溶剂，如二氯甲烷中反应以提供式VII的化合物。可通过使其中Pg1是叔丁基的式IX的化合物与叠氮化物源，如叠氮基三甲基硅烷在碘化铜(I)存在下在溶剂，如二甲基甲酰胺/甲醇中反应来制备式VIII的化合物。可通过使3-丁炔-1-醇与YCH2C(O)OPg1（其中Y是合适的离去基，如卤素溴且Pg1是叔丁基）反应来制备其中Pg1是叔丁基的式IX的化合物。该反应方便地用相转移催化剂，如四丁基硫酸铵和碱，如氢氧化钠水溶液在溶剂，如二氯甲烷中进行。

[0058] 或者在方案E中，可通过使式X的化合物与氢在过渡金属催化剂，如氯化钯(II)存在下在溶剂，如异丙醇/水中反应来制备式VII的化合物。可通过使式XI的化合物与YCH2C(O)OPg1（其中Y是合适的离去基，如卤素溴，且Pg1是叔丁基）反应来制备式X的化合物。该反应方便地用相转移催化剂，如四丁基氯化铵和碱，如氢氧化钠水溶液在溶剂，如二氯甲烷中进行。所得叔丁酯中间体用酸，如盐酸处理以提供式X的化合物。可通过使式XII的化合物与异丙基氯化镁和苄基叠氮在溶剂，如四氢呋喃中反应来制备式XI的化合物。可通过使3-丁炔-1-醇与二氢吡喃在有机酸，如对甲苯磺酸存在下反应来制备式XII的化合物。该反应通常在溶剂，如二氯甲烷中进行。

[0059]

[0060] 制备1

[0061] 1-(2,3-二氢-1H-茚-2-基)胍盐酸盐的合成.

[0062]

[0063] 将2,3-二氢-1H-茚-2-胺盐酸盐（197克；1.08当量；1.16摩尔）、1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐（158克；1.00当量；1.08摩尔）和二异丙基乙胺（400克；2.87当量；3.09摩尔；539.74毫升）在乙腈（2升）中的溶液在62℃下搅拌2小时，在此期间白色固体沉淀。将该混合物冷却至25℃，然后过滤并用300毫升乙腈和300毫升甲基叔丁基醚洗涤。将该产物在空气中在25℃下干燥1小时以提供白色固体形式的标题化合物（200克，87%）: MS (m/z): 176 (M + 1)。

[0064] 制备2

[0065] 2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-甲酸叔丁酯的合成.[0066]

[0067] 将1,1-二甲氧基-N,N-二甲基-甲胺（224克；2.15当量；1.88摩尔；250.98毫升）和N-叔丁氧基羰基-4-哌啶酮（250克；1.44当量；1.25摩尔）在二甲基甲酰胺（1.2升）中的溶液在109℃下在N2下搅拌4小时。将该混合物冷却至25℃，然后加入乙醇（700毫升；12.02摩尔；553.91克）。将1-(2,3-二氢-1H-茚-2-基)胍盐酸盐（185克；1.00当量；873.90毫摩尔）和碳酸钾（475克；3.44摩尔）在25℃下一次性添加到该混合物中以形成白色悬浮液。将该混合物在80-90℃下搅拌24小时，然后冷却至25℃并将该混合物倒入5升冰/水中以获得黄色悬浮液。用乙酸乙酯萃取（3 x 3升）并用10%氯化锂溶液（3升）、水（3升）和饱和氯化钠溶液（3升）洗涤有机层。经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩以产生大约300毫升红色溶液。经硅胶塞（10厘米高，5厘米直径）过滤该溶液，然后浓缩至干以产生红色凝胶形式的标题化合物（320克，
100%）: MS (m/z): 367 (M + 1)。

[0068] 制备3

[0069] N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺的合成

[0070]

[0071] 将盐酸（900毫升；5M在水中；5.17当量；4.50摩尔；1.08千克）分批添加到2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-甲酸叔丁酯（319克；1.00当量；870.48毫摩尔）在四氢呋喃（1.5升）中的溶液中。一旦添加完成，将该溶液在50℃下搅拌1小时。将该混合物冷却至25℃，然后加入3升甲基叔丁基醚和1升水。使该溶液在20℃下静置16小时。分离各相并用二氯甲烷（2升）萃取水相。弃置有机萃取物并使用4M氢氧化钠将水相调节至pH 
10。用乙酸乙酯萃取（3 x 3升）并用饱和氯化钠（2升）洗涤合并的有机萃取物。经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩至干以产生红色凝胶。在50℃下将该物质再溶解在乙酸乙酯（300毫升）和石油醚（200毫升）中并经24小时沉淀。过滤和干燥以提供标题化合物（85克，37%）。MS (m/z): 267 (M + 1)。

[0072] 制备4

[0073] 2-丁-3-炔氧基四氢吡喃的合成

[0074]

[0075] 将3-丁炔-1-醇（50克，1当量，713毫摩尔）、一水合对甲苯磺酸（1.36克，0.01当量，7.13毫摩尔）和二氢吡喃（71.7毫升，1.10当量，785毫摩尔）在二氯甲烷（500毫升）中的溶液在25℃下搅拌24小时。然后缓慢加入饱和碳酸氢钠溶液（500毫升），并用二氯甲烷（500毫升）萃取该混合物。有机萃取物经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩以提供粗产物，其通过真空蒸馏提纯以提供标题化合物（90克，82%）: b.p.: 65℃, 1 mm Hg。

[0076] 制备5

[0077] 2-(3-苄基三唑-4-基)乙醇的合成

[0078]

[0079] 在15℃下将异丙基氯化镁（368毫升，736.00毫摩尔）逐滴添加到2-丁-3-炔氧基四氢吡喃（113.50克，736.00毫摩尔）在四氢呋喃（1.4升）中的溶液中，使内部温度保持小于20℃。移除冰-水浴，使温度升温至25℃，并在此温度下保持20分钟以确保气体释放完全。将反应混合物加热至30-35℃并将苄基叠氮（70克，525.71毫摩尔）经2小时逐滴添加到该混合物中，同时通过如LCMS之类的方法确保反应混合物中的苄基叠氮浓度不升至明显的水平。在搅拌4小时后，将反应混合物冷却至25℃并用饱和氯化铵水溶液（400毫升）通过逐滴添加淬灭。在搅拌16小时后，用甲基叔丁基醚（200毫升）稀释，分离各层，并将有机层与3M盐酸（600毫升）一起搅拌4小时。在通过如LCMS之类的方法实现大于98%转化时，通过逐滴添加6 M氢氧化钠（大约350毫升）将反应混合物的pH升至pH >10。用甲基叔丁基醚（3 x 300毫升）和二氯甲烷（3 x 300毫升）萃取所得混合物。在真空中浓缩合并的有机层并通过硅胶柱色谱法提纯所得粗产物，用乙酸乙酯洗脱，以提供灰白色固体形式的标题化合物（53克，50%）。MS (m/z): 204.1 (M + 1)。

[0080] 制备6

[0081] [2-(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-5-基)乙氧基]乙酸的合成

[0082]

[0083] 在0℃下将400毫升40% w/w氢氧化钠（5.73摩尔）装载到2-(3-苄基三唑-4-基)乙醇（50克，246.01毫摩尔）和四正丁基氯化铵（6.84克，24.60毫摩尔）在二氯甲烷（400毫升）中的混合物中。加入溴-1,1-二甲基乙酸乙酯（62.38克，319.81毫摩尔）并搅拌16小时，使温度升至25℃。分离各层，并用二氯甲烷（2 x 100毫升）萃取水相。在真空中浓缩合并的有机层以产生75克黄色油形式的中间体2-(2-(3-苄基-3H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)乙酸叔丁酯。用450毫升甲苯和150毫升6 M盐酸稀释该油并在25℃下搅拌16小时。分离各层并将水层的pH调节至大约pH 2.0。过滤所得白色固体，用水（2 x 200毫升）冲洗以产生白色固体形式的标题化合物（58克，90%）。MS (m/z): 262.1 (M + 1)。

[0084] 制备7

[0085] 2-[2-(1H-三唑-5-基)乙氧基]乙酸的合成

[0086]

[0087] 将1大气压的氢气（g）加压到含有在异丙醇（300毫升）和水（60毫升）中的[2-(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-5-基)乙氧基]乙酸（10.1克；1.00当量；38.66毫摩尔）和氯化钯(II)（3克；16.92毫摩尔；3.00克）的烧瓶中。使该烧瓶在氢气气氛下保持3小时，然后经Celite™过滤并浓缩。加入甲苯（2x50毫升）并浓缩以提供标题化合物（7.96克，100%）。

[0088]

[0089] 实施例1

[0090] 1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-[2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基]乙酮的合成

[0091]

[0092] 在25℃下将N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺（4.2克，15.8毫摩尔）添加到2-[2-(1H-三唑-5-基)乙氧基]乙酸（2.7克，15.8毫摩尔）、1-羟基苯并三唑（3.20克，23.7毫摩尔）和二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（5.44克，28.4毫摩尔）在二氯甲烷（40毫升）中的混合物中。将三乙胺（4.40毫升，31.6毫摩尔）添加到反应混合物中并搅拌16小时。用水（2 x 50毫升）洗涤并浓缩有机层。通过硅胶柱色谱法提纯，用乙酸乙酯/甲醇洗脱以产生固体形式的标题化合物（4.0克，60%）。MS (m/z): 420 (M + H)。

[0093] 制备8

[0094] 2-氯-1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]乙酮的合成

[0095]

[0096] 在23℃下经5分钟向在二氯甲烷（200毫升）中的N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺（11.0克，41.3毫摩尔）和三乙胺（7.48毫升，53.7毫摩尔）中逐滴加入2-氯乙酰氯（3.61毫升，5.13克，45.4毫摩尔）。搅拌30分钟并将反应混合物倒入1:1 50%饱和碳酸氢钠水溶液: 二氯甲烷（75毫升）中。将有机层与水层分离并用二氯甲烷（2 × 25毫升）进一步萃取水层。合并有机萃取物，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残留物溶解在氯仿（10毫升）中并经硅胶柱色谱法（梯度洗脱：25%乙酸乙酯/己烷至100%乙酸乙酯）提纯以产生标题化合物（9.75克，69%）。 次要的酰胺旋转异构体)

[0097]

[0098] 。

[0099] 制备9

[0100] 2-(丁-3-炔-1-基氧基)-1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]乙酮的合成

[0101]

[0102] 在23℃下向四氢呋喃（50毫升）中的氢化钠（60重量%在矿物油中，1.58克，39.6毫摩尔）中逐滴加入3-丁炔-1-醇（7.93克，8.59毫升，113.2毫摩尔），然后在23℃下搅拌20分钟。在23℃下将这种溶液添加到四氢呋喃（150毫升）中的2-氯-1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]乙酮（9.70克，28.3毫摩尔）中并搅拌1小时。将反应混合物倒入50%饱和碳酸氢钠水溶液中。分离有机层并用乙醚（× 2）和乙酸乙酯（× 2）进一步萃取水层。合并有机萃取物并用盐水洗涤，然后经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。所得粗产物通过硅胶柱色谱法提纯（梯度洗脱：20%乙酸乙酯/己烷至100%乙酸乙酯）以产生标题化合物（8.16克，77%）。MS (m/z): 377 (M + 1)。

[0103] 实施例1a

[0104] 1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-[2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基]乙酮的另一种合成

[0105]

[0106] 2-(丁-3-炔-1-基氧基)-1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]乙酮（8.15克，21.7毫摩尔）和L-抗坏血酸钠盐（8.58克，43.3毫摩尔）在二甲基甲酰胺（60毫升）和水（60毫升）中的溶液用氮气鼓泡10分钟，然后排气并用氮气回填3次。加入五水合硫酸铜(II（) 1.08克，4.33毫摩尔）并加热至90℃，然后逐滴加入叠氮基三甲基硅烷（23.1毫升，20.0克，173毫摩尔）并搅拌1小时。将反应混合物冷却至23℃并倒入水（50毫升）中。用乙酸乙酯（4 × 50毫升）萃取这种混合物。合并有机萃取物并用饱和氯化钠水溶液洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。所得粗产物通过硅胶柱色谱法提纯（梯度洗脱：0至10%甲醇/乙酸乙酯）以产生标题化合物（3.60克，40%）。MS (m/z): 420 (M + 1)。

[0107] 制备10

[0108] 2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酸叔丁酯的合成

[0109]

[0110] 将450毫升（2.58摩尔）N-乙基-N-异丙基丙-2-胺装载到2-氯-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酸叔丁酯（220克，860.37毫摩尔）和2,3-二氢-1H-茚-2-胺（137.7克，1.03摩尔）在1-甲基吡咯烷-2-酮（3.6升）中的15℃溶液中。将所得混合物加热至80℃ 16小时，然后冷却至30℃并将所得混合物转移到25℃的5升水中。过滤所得固体并用水（2 x 300毫升）冲洗滤饼。该固体在15℃下在乙酸乙酯（350毫升）中再制浆45分钟。过滤该浆料，用15℃乙酸乙酯（2 x 250毫升）冲洗并干燥以产生灰白色固体形式的标题化合物（226克，75%）。

[0111]

[0112] 制备11

[0113] N-(2,3-二氢-1H-茚-2-基)-6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-2-胺二盐酸盐水合物的合成

[0114]

[0115] 将670毫升5 M 盐酸（3.35摩尔）装载到2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H 吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酸叔丁酯（226克，641.25毫摩尔）在四氢呋喃（2.0 升）中的17℃溶液中，在该添加过程中使内部温度保持在26℃以下。将所得溶液加热至50℃ 16 h，冷却至25℃并用500毫升水和500毫升叔丁基甲基醚稀释。分离所得各层并用叔丁基甲基醚（3 x 1升）萃取。将水相浓缩至大约200毫升的反应体积并过滤所得浆料。用叔丁基甲基醚（2 x 200毫升）冲洗滤饼并干燥产生浅棕色固体形式的标题产物（177克，80%)。MS (m/z): 253.2 (M-2HCl-H2O+1)。

[0116] 制备12

[0117] 2-丁-3-炔氧基乙酸叔丁酯的合成

[0118]

[0119] 在0℃下搅拌丁-3-炔-1-醇（6.00克；85.60毫摩尔）、四丁基硫酸铵（2.07克；8.54毫摩尔）和氢氧化钠（40% wt/wt；150毫升）在二氯甲烷（150毫升）中的混合物。逐滴加入溴乙酸叔丁酯（19.34毫升；128.40毫摩尔）并将该混合物在室温下搅拌2.5小时。用二氯甲烷（200毫升）和水（100毫升）稀释反应混合物，分离各层并进一步用二氯甲烷（2 × 100毫升）萃取水层。用盐水（100毫升）洗涤合并的有机层，经无水硫酸钠干燥并浓缩以提供棕色油形式的粗制标题化合物（11.93克）。该油通过硅胶柱色谱法提纯，用己烷: 乙酸乙酯（0%至10%混合物）洗脱以产生无色油形式的标题化合物（11.35克；72%）。

[0120]

[0121] 制备13

[0122] 2-[2-(1H-三唑-5-基)乙氧基]乙酸叔丁酯的合成

[0123]

[0124] 在0℃下在二甲基甲酰胺（56.70毫升）和甲醇（11.34毫升）的混合物中搅拌2-丁-3-炔氧基乙酸叔丁酯（11.34克；61.55毫摩尔）和碘化铜(I（) 584毫克；3.07毫摩尔）。逐滴加入叠氮基(三甲基)硅烷（12.33毫升；86.47毫摩尔）并将该混合物在90℃下加热18小时。

[0125] 在第二批中，在0℃下在二甲基甲酰胺（22毫升）和甲醇（6毫升）的混合物中搅拌2-丁-3-炔氧基乙酸叔丁酯（4.38克；23.77毫摩尔）和碘化铜(I（) 226毫克；1.19毫摩尔）。逐滴加入叠氮基(三甲基)硅烷（4.8毫升；33.66毫摩尔）并将该混合物在90℃下加热18小时。

[0126] 在冷却至室温后，合并来自这两批的粗产物并浓缩该混合物以提供绿色残留物。粗产物通过经硅胶塞过滤提纯，用二氯甲烷: 乙酸乙酯（75% 至100%混合物）洗脱以提供无色油形式的标题化合物（14.15克，73%）。MS (m/z): 228.15 (M+1)。

[0127] 制备14

[0128] 2-[2-(1H-三唑-5-基)乙氧基]乙酸2,2,2-三氟乙酸的合成

[0129]

[0130] 将2-[2-(1H-三唑-5-基)乙氧基]乙酸叔丁酯（14.15克；62.26毫摩尔）和三氟乙酸（70.75毫升，935.69毫摩尔）在二氯甲烷（70.75毫升）中的混合物在室温下搅拌2小时。在减压下浓缩该反应混合物以提供棕色固体形式的含有另外的三氟乙酸的标题化合物（20.22克，>100%）。MS (m/z): 172.05 (M+1)。

[0131] 实施例2

[0132] 1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]-2-[2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基]乙酮的合成

[0133]

[0134] 在0℃下搅拌2-[2-(1H-三唑-5-基)乙氧基]乙酸2,2,2-三氟乙酸（20.22克；70.90毫摩尔）、N-(2,3-二氢-1H-茚-2-基)-6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-2-胺二盐酸盐水合物（27.99克；81.54毫摩尔）和三乙胺（98.83毫升；709.03毫摩尔）在二甲基甲酰胺（404.40毫升）中的混合物。经30分钟加入1-丙烷膦酸环酐的溶液（在DMF中的50%溶液；51.89毫升；81.54毫摩尔）并将该混合物在室温下搅拌18小时。

[0135] 在减压下浓缩该反应混合物以产生残留物。加入水（200毫升）并用乙酸乙酯（4 x 250毫升）和二氯甲烷（4 x 250毫升）萃取该混合物。用饱和碳酸氢钠水溶液（2 x 100毫升）和盐水（100毫升）洗涤合并的有机层，然后经无水硫酸钠干燥。过滤该混合物并在减压下浓缩该溶液以产生红色固体（25.70克），其在室温下在乙酸乙酯/甲醇（9:1 混合物；200毫升）中制浆2小时。过滤所得固体并用冷乙酸乙酯（50毫升）洗涤以产生固体（大约18.2克），其在回流下在乙酸乙酯（200毫升）中再制浆1小时。在冷却至室温后，将该混合物搅拌1小时并过滤所得浅粉色固体。

[0136] 该浅粉色固体在水/甲醇（1:1 混合物；200毫升）中制浆并将该混合物在50℃下加热30分钟。加入氢氧化铵溶液（32%；50毫升）并继续在50℃下加热该混合物30分钟。在冷却至室温后，加入另外的氢氧化铵溶液（32%；50毫升）并在室温下继续搅拌1小时。过滤所得浅灰色固体，干燥并再在乙酸乙酯（200毫升）中制浆1小时以提供浅灰色固体，将其过滤，用乙酸乙酯（25毫升）洗涤并干燥以产生灰色固体形式的标题化合物（12.42克；43%）。MS (m/z): 406 (M+1)。

[0137] 制备15

[0138] 2-氯-1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]乙酮的合成

[0139]

[0140] 将N-(2,3-二氢-1H-茚-2-基)-6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-2-胺二盐酸盐水合物（14.4克，41.9毫摩尔）和三乙胺（14.3克，19.7毫升，141.4毫摩尔）在二氯甲烷（200毫升）中的悬浮液在23℃下搅拌10分钟，然后冷却至–30℃。经2分钟加入2-氯乙酰氯（5.49克，3.86毫升，48.6毫摩尔）并经10分钟升温至23℃。加入甲醇（5毫升）并在真空中除去溶剂。将该粗制反应混合物在甲醇（30毫升）中制浆，加入50克硅胶并在真空中除去溶剂。将所得残留物加载到装载柱上并经硅胶柱色谱法提纯（梯度洗脱：50%乙酸乙酯/己烷至乙酸乙酯至10%甲醇/乙酸乙酯)以产生标题化合物（11.5克，84%）。MS (m/z): 329(M+1)。

[0141] 制备16

[0142] 2-(丁-3-炔-1-基氧基)-1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]乙酮的合成

[0143]

[0144] 在0℃下向四氢呋喃（86毫升）中的氢化钠（60重量%在矿物油中，2.06克，51.4毫摩尔）中加入3-丁炔-1-醇（4.64克，5.03毫升，64.3毫摩尔），然后在23℃下搅拌15分钟。将这种溶液添加到0℃的在四氢呋喃（86毫升）中的2-氯-1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]乙酮（8.45克，25.7毫摩尔）中并搅拌5分钟。将反应混合物倒入50%饱和碳酸氢钠水溶液中。分离有机层并用乙醚和乙酸乙酯（各2 × 50毫升）进一步萃取水层。合并有机萃取物并用盐水洗涤，然后经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将该粗产物与来自第二反应（在相同条件和化学计量下使用2-氯-1-[2-(茚满-2-基氨基)-5,
7-二氢吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]乙酮（3.0克，9.1毫摩尔）运行反应）的粗产物合并，并通过硅胶柱色谱法提纯（梯度洗脱：25%乙酸乙酯/己烷至100%乙酸乙酯）以产生标题化合物（2.90克，23%）。MS (m/z): 363(M+1)。

[0145] 实施例2a

[0146] 1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]-2-[2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基]乙酮的另一种合成

[0147]

[0148] 将二甲基甲酰胺（27毫升）和水（27毫升）添加到含有2-(丁-3-炔-1-基氧基)-1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]乙酮（2.90克，8.00毫摩尔）的烧瓶中。加入五水合硫酸铜(II)（400毫克，1.60毫摩尔）和L-抗坏血酸钠盐（3.17克，16.0毫摩尔）。将烧瓶排气并用氮气回填（× 2），然后加入叠氮基三甲基硅烷（7.37克，8.53毫升，64.0毫摩尔）并将该反应加热至90℃ 70分钟。将反应混合物冷却至23℃并在真空中除去所有溶剂。将该残留物悬浮在甲醇/二氯甲烷中，然后加入硅胶并在真空中除去溶剂。将这种材料加载到装载柱上并经硅胶柱色谱法提纯（梯度洗脱：0-9% 甲醇/乙酸乙酯）以产生标题化合物（980毫克，30%）。MS (m/z): 406(M+1)。

[0149]

[0150] 制备17

[0151] 6-亚氨基-6-甲氧基-己酸甲酯的合成

[0152]

[0153] 方案F，步骤A. 将氯化氢(g)鼓泡通过5-氰基-戊酸甲酯（3.0毫升；1.00当量；22.02毫摩尔）在甲醇（5毫升）和乙醚（10毫升）中的0℃溶液1小时。使该溶液升温至室温，然后加入50毫升乙醚，剧烈搅拌15分钟，然后过滤并收集所得沉淀物。用乙醚洗涤该固体以提供6-亚氨基-6-甲氧基-己酸甲酯（3.82克；83%）:

[0154] 。

[0155] 制备18

[0156] 5-(4H-1,2,4-三唑-3-基)戊酸甲酯的合成

[0157]

[0158] 方案F，步骤B. 将甲醇（1毫升）和三乙胺（0.36毫升；1.0当量；2.58毫摩尔）添加到含有6-亚氨基-6-甲氧基-己酸甲酯（0.542克；1.00当量；2.58毫摩尔）的管瓶中，接着加入甲酰肼（0.155克，1.0当量；2.58毫摩尔）在甲醇（3毫升）中的溶液。在室温下搅拌18小时，然后加热至70℃ 3小时。浓缩该混合物，然后用乙酸乙酯（30毫升）稀释并过滤。浓缩该滤液以提供无色油形式的5-(4H-1,2,4-三唑-3-基)戊酸甲酯（0.498克；105%）：MS (m/z): 184 (M+1)。

[0159] 制备18a

[0160] 5-(4H-1,2,4-三唑-3-基)戊酸的合成

[0161]

[0162] 方案F，步骤C. 将甲醇（3毫升）、四氢呋喃（3毫升）和水（2毫升）添加到含有5-(4H-1,2,4-三唑-3-基)戊酸甲酯（0.5克；1.0当量；2.73毫摩尔）的烧瓶中。一次性加入氢氧化锂（0.261克；4.0当量；10.92毫摩尔）并在室温下搅拌90分钟。将该溶液冷却至0℃并缓慢加入
5N 盐酸（2.18毫升；4.0当量；10.92毫摩尔）。浓缩该混合物，然后与甲苯（4x10毫升）共沸该残留物。加入二氯甲烷（30毫升），接着加入硫酸镁。过滤并用100毫升10%乙醇/二氯甲烷冲洗滤饼。浓缩以提供为醇加合物的5-(4H-1,2,4-三唑-3-基)戊酸（1.6克；>100%）：MS (m/z): 170 (M+1)。

[0163] 实施例3

[0164] 1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-5-(4H-1,2,4-三唑-3-基)戊-1-酮的合成

[0165]

[0166] 方案F，步骤D. 将N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺（0.189克；1.0当量；0.71毫摩尔）添加到含有5-(4H-1,2,4-三唑-3-基)戊酸（0.40克，1.0当量；0.71毫摩尔）的溶液中，接着加入二甲基甲酰胺（2毫升）。在室温下搅拌所得溶液直至均匀。
加入4-氨基吡啶,N,N-二甲基-（0.017克；0.2当量；0.141毫摩尔）并将该溶液冷却至0℃。一次性加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（0.204克；1.5当量；1.06毫摩尔）。使该混合物升温至室温并搅拌30分钟。加入二氯甲烷（2毫升），加热至40℃并搅拌24小时。用250毫升水，然后50毫升乙酸乙酯稀释。用乙酸乙酯（5 x 25毫升）萃取该混合物。用盐水（10毫升）洗涤合并的有机萃取物。有机物经硫酸镁干燥、过滤、浓缩并经柱色谱法提纯（己烷至12%甲醇/乙酸乙酯）以产生白色泡沫形式的1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,
8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-5-(4H-1,2,4-三唑-3-基)戊-1-酮（0.08克；27%收率）：MS (m/z): 418 (M+1)。

[0167]

[0168] 制备19

[0169] 5-咪唑-1-基戊酸甲酯的合成

[0170]

[0171] 方案G，步骤A. 将氢化钠（0.212克；1.2当量；5.29毫摩尔）添加到1H-咪唑（0.30克；1.0当量；4.41毫摩尔）和5-溴戊酸甲酯（1.03克；1.2当量；5.29毫摩尔）在二甲基甲酰胺（20毫升）中的溶液中。将该混合物搅拌18小时，然后加入水（15毫升）。用二氯甲烷萃取该混合物并用盐水（20毫升）洗涤。有机相经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以产生粗产物，其通过柱色谱法（0至10%甲醇/二氯甲烷）提纯以提供黄色油形式的5-咪唑-1-基戊酸甲酯（0.655克；82%）：MS (m/z): 183(M+1)。

[0172] 制备20

[0173] 5-咪唑-1-基戊酸的合成

[0174]

[0175] 方案G，步骤B. 将5-咪唑-1-基戊酸甲酯（0.60克；1.0当量；3.29毫摩尔）和氢氧化锂（0.553克；4当量；13.17毫摩尔）在四氢呋喃（20毫升）和水（15毫升）中的溶液搅拌18小时。加入3毫升5N盐酸，然后浓缩该混合物。通过柱色谱法（0至15%甲醇/二氯甲烷）提纯该粗产物以提供黄色油形式的5-咪唑-1-基戊酸（0.72克；19%）：MS (m/z): 169(M+1)。

[0176] 实施例4

[0177] 1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-5-(1H-咪唑-1-基)戊-1-酮的合成

[0178]

[0179] 方案G，步骤C. 将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（0.288克；2.0当量；1.50毫摩尔）添加到N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺（0.20 m；1.0当量；0.75毫摩尔）、5-咪唑-1-基戊酸（0.152克；1.2当量；0.90毫摩尔）和1-羟基苯并三唑（0.203克；2.0当量；1.50毫摩尔）在二氯甲烷（20毫升）和三乙胺（0.52毫升）中的溶液中。
将该混合物搅拌18小时，然后浓缩，加入水（10毫升）并用乙酸乙酯萃取（3x20毫升）。合并的有机萃取物经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法（0至10%甲醇/二氯甲烷）提纯该粗产物以提供无色油形式的1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-5-(1H-咪唑-1-基)戊-1-酮（0.14克；45%）：MS (m/z): 417 (M+1)。

[0180]

[0181] 制备21

[0182] 1-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]丙-2-烯-1-酮的合成

[0183]

[0184] 方案H，步骤A. 将三乙胺（0.82毫升；2.0当量；5.86毫摩尔），接着2-丙烯酰氯（0.24毫升；1.0当量；2.93毫摩尔）逐滴添加到N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺（0.781克；1.0当量；2.93毫摩尔）在二氯甲烷（29毫升）中的0℃溶液中。将该溶液在环境温度下搅拌16小时，然后用二氯甲烷稀释，用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩成橙色油。通过柱色谱法提纯该粗产物以提供1-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]丙-2-烯-1-酮（0.66克；70%）: MS (m/z): 321 (M+1)。

[0185] 制备22

[0186] 1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-3-(丙-2-炔-1-基氧基)丙-1-酮的合成

[0187]

[0188] 方案H，步骤B. 将1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯（0.035毫升；0.15当量；0.23毫摩尔）添加到1-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]丙-
2-烯-1-酮（0.5克；1.0当量；1.56毫摩尔）和2-丙炔-1-醇（5.0毫升；55当量；85.86毫摩尔）的溶液中。将该反应在环境温度下搅拌16小时，然后加热至50℃ 36小时。将该溶液浓缩成棕色油，然后通过柱色谱法（20至100%乙酸乙酯/二氯甲烷）提纯该粗产物以提供所需1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-3-(丙-2-炔-1-基氧基)丙-1-酮（0.28克；48%）: MS (m/z): 377 (M+1)。

[0189] 实施例5

[0190] 1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-3-(1H-1,2,3-三唑-4-基甲氧基)丙-1-酮的合成

[0191]

[0192] 方案H，步骤C. 将五水合硫酸铜(II（) 0.037克；0.2当量；0.147毫摩尔）和L-抗坏血酸钠盐（0.291克；2.0当量；1.47毫摩尔）添加到1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-3-(丙-2-炔-1-基氧基)丙-1-酮（0.277克；1.0当量；0.74毫摩尔）在二甲基甲酰胺（4毫升）和水（4毫升）中的溶液中。将该系统排气两次并用氮气回填。加入叠氮基三甲基硅烷（0.784毫升；8.0当量；5.89毫摩尔）并将该不均匀混合物加热至90℃ 1小时。用水（250毫升）和乙酸乙酯（50毫升）稀释该反应混合物并用乙酸乙酯萃取（3x50毫升）。合并的有机萃取物用盐水（30毫升）洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩成黄/橙色油。通过柱色谱法（乙酸乙酯至10%甲醇/乙酸乙酯）提纯该粗产物以提供所需
1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-3-(1H-1,2,
3-三唑-4-基甲氧基)丙-1-酮（0.135克；44%）: MS (m/z): 420 (M+1)。

[0193]

[0194] 制备23

[0195] 5-(1H-咪唑-5-基)戊-4-炔酸苄酯的合成

[0196]

[0197] 方案I，步骤A. 将双(三苯基膦)氯化钯(II（) 0.14克；0.1当量；0.20毫摩尔）和碘化铜(I)（0.039毫克；0.1当量；0.20毫摩尔）添加到4-碘-1H-咪唑（0.388克；1.0当量；2.00毫摩尔）、戊-4-炔酸苄酯（0.376克；1.0当量；2.00毫摩尔）和三乙胺（0.84毫升；3当量；6.0毫摩尔）在二甲基甲酰胺（8毫升）中的脱氧溶液中。将该混合物加热至75℃ 16小时，然后用水（30毫升）稀释该混合物并用乙酸乙酯萃取3x。合并的有机萃取物用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并浓缩以提供粗产物。通过柱色谱法（0至10%甲醇/二氯甲烷）提纯该粗产物以提供无色油形式的5-(1H-咪唑-5-基)戊-4-炔酸苄酯（0.35克；69%）：MS (m/z): 255(M+1)。

[0198] 制备24

[0199] 5-(5-苄氧基-5-氧代-戊-1-炔基)咪唑-1-甲酸叔丁酯的合成

[0200]

[0201] 方案I，步骤B. 将5-(1H-咪唑-5-基)戊-4-炔酸苄酯（0.19克；1.00当量；0.747毫摩尔）、二碳酸二-叔丁酯（0.210克；1.29当量；0.96毫摩尔）、三乙胺（0.21毫升；2.0当量；1.49毫摩尔）和4-氨基吡啶,N,N-二甲基-（9毫克；0.1当量；0.074毫摩尔）在二氯甲烷（10毫升）中的溶液搅拌2小时。浓缩该溶液并通过柱色谱法（25%乙酸乙酯/己烷）提纯该粗产物以提供白色固体形式的5-(5-苄氧基-5-氧代-戊-1-炔基)咪唑-1-甲酸叔丁酯（0.170克；
64%）: MS (m/z): 299(M-t-Bu+1)。

[0202] 制备25

[0203] 5-(3-叔丁氧基羰基咪唑-4-基)戊酸的合成

[0204]

[0205] 方案I，步骤C. 将5-(5-苄氧基-5-氧代-戊-1-炔基)咪唑-1-甲酸叔丁酯（0.17克；1.0当量；0.48毫摩尔）和钯（10%碳载；0.030克；0.014毫摩尔）在甲醇（13毫升）中的60℃溶液在1大气压氢气下剧烈搅拌16小时。过滤并浓缩以提供白色固体形式的所需5-(3-叔丁氧基羰基咪唑-4-基)戊酸（0.128克；99%）: MS (m/z): 213(M-t-Bu+1)。

[0206] 制备26

[0207] 5-[5-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-5-氧代-戊基]咪唑-1-甲酸叔丁酯的合成

[0208]

[0209] 方案I，步骤D. 将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（0.092克；1.5当量；0.48毫摩尔）添加到5-(3-叔丁氧基羰基咪唑-4-基)戊酸（0.084克；1.0当量；0.31毫摩尔）、N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺（0.064克；0.77当量；0.24毫摩尔）、1-羟基苯并三唑（0.065克；1.5当量；0.48毫摩尔）和三乙胺（0.20毫升；4.5当量；1.44毫摩尔）在二氯甲烷（15毫升）中的溶液中。将该混合物加热至40℃ 16小时。浓缩该混合物，然后通过柱色谱法（0至10%甲醇/二氯甲烷）提纯该粗产物以提供白色固体形式的5-[5-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-5-氧代-戊基]咪唑-1-甲酸叔丁酯（0.040克；25%）: MS (m/z): 517 (M+1)。

[0210] 实施例6

[0211] 1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-5-(1H-咪唑-4-基)戊-1-酮的合成

[0212]

[0213] 方案I，步骤E. 将三氟乙酸（1.5毫升）添加到5-[5-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-5-氧代-戊基]咪唑-1-甲酸叔丁酯（0.030克；0.058毫摩尔）在二氯甲烷（8毫升）中的溶液中。将该反应在室温下搅拌2小时。浓缩该混合物并加入饱和碳酸氢钠（10毫升）和水（20毫升），然后用二氯甲烷（3x20毫升）萃取。合并的有机萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法（0至10%甲醇/二氯甲烷）提纯该粗产物以提供白色固体形式的1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-5-(1H-咪唑-4-基)戊-1-酮（0.020克；83%）: MS (m/z): 417 (M+1)。

[0214]

[0215] 实施例7

[0216] 2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酸3-(1H-咪唑-1-基)丙酯的合成

[0217]

[0218] 方案J，步骤A. 将氢化钠（0.050克；2.2当量；1.25毫摩尔）添加到2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-甲酸3-氯丙酯（0.22克；1.0当量；0.57毫摩尔）和1H-咪唑（0.082克；2.1当量；1.20毫摩尔）在二甲基甲酰胺（2毫升）中的溶液中并搅拌18小时。用二氯甲烷和水稀释该反应。分离各层并用二氯甲烷进一步萃取水层（2x）。合并的有机萃取物经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法（0至10%甲醇/二氯甲烷）提纯该粗产物以提供白色固体形式的所需2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酸3-(1H-咪唑-1-基)丙酯（0.078克；33%）: MS (m/z): 419 (M+1)。

[0219]

[0220] 制备27

[0221] 2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酸3-氰丙酯的合成

[0222]

[0223] 方案K，步骤A. 将2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-甲酸3-氯丙酯（0.42克；1.0当量；1.09毫摩尔）和氰化钠（0.085克；1.6当量；1.73毫摩尔）在二甲基甲酰胺（3毫升）中的溶液加热至100℃ 2小时。将该混合物冷却至环境温度，用二氯甲烷（20毫升）稀释并用水（25毫升）洗涤该反应混合物。用二氯甲烷（2x20毫升）萃取水层。合并的有机萃取物经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以提供粗产物。合并粗产物并通过柱色谱法（0至
10%甲醇/二氯甲烷）提纯以提供浅棕色油形式的2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酸3-氰丙酯并用于下一步骤。MS (m/z): 378 (M+1)。

[0224] 实施例8

[0225] 2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酸3-(1H-四唑-5-基)丙酯的制备

[0226]

[0227] 方案K，步骤B. 将2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酸3-氰丙酯（0.24克；1.0当量；0.64毫摩尔）、叠氮基三甲基硅烷（0.85毫升；10当量；6.38毫摩尔）和二丁基氧代锡烷（0.040克；0.25当量；0.16毫摩尔）在甲苯（5毫升）中的溶液加热至100℃ 24小时，然后冷却至环境温度并浓缩。通过反相色谱法提纯该粗材料以提供不纯产物。将该不纯产物溶解在50毫升二氯甲烷中并用饱和碳酸氢钠洗涤，用二氯甲烷进一步萃取水层2x。合并的有机萃取物经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以提供黄色固体形式的2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酸3-(1H-四唑-
5-基)丙酯（0.110克；41%）: MS (m/z): 421 (M+1)。

[0228]

[0229] 制备28

[0230] N-丁-3-炔基-N-[2-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯的合成

[0231]

[0232] 方案L，步骤A. 将丁-3-炔-1-胺（2.71克；8当量；9.80毫摩尔）快速添加到2-氯-1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]乙酮（0.42克；1.0当量；1.23毫摩尔）和三乙胺（0.205毫升；1.2当量；1.47毫摩尔）在四氢呋喃（8毫升）中的0℃溶液中。在15分钟后，将该溶液加热至45℃ 2小时，然后浓缩该混合物并将残留物再溶解在二氯甲烷（3毫升）中。加入二碳酸二-叔丁酯（0.802克；3当量；3.68毫摩尔）并在环境温度下搅拌1小时。浓缩该混合物并通过柱色谱法（0至100%乙酸乙酯/己烷）提纯该粗产物以产生白色固体形式的N-丁-3-炔基-N-[2-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,
3-d]嘧啶-6-基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯（0.504克；87%）: MS (m/z): 476 (M+1)。

[0233] 制备29

[0234] {2-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-氧代乙基}[2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙基]氨基甲酸叔丁酯的合成

[0235]

[0236] 方案L，步骤B. 将五水合硫酸铜(II（) 0.026克；0.2当量；0.106毫摩尔）和L-抗坏血酸钠盐（0.21克；2.0当量；1.06毫摩尔）添加到N-丁-3-炔基-N-[2-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯（0.252克；1.0当量；0.53毫摩尔）在二甲基甲酰胺（6毫升）和水（3毫升）（包括甲苯（0.05毫升）作为内标）中的脱氧溶液中。将反应容器加热至90℃，然后缓慢加入叠氮基三甲基硅烷（0.565毫升；8当量；4.24毫摩尔）。在90℃下搅拌4小时，然后用水（100毫升）和乙酸乙酯（50毫升）稀释反应混合物并萃取3 x 50毫升乙酸乙酯。合并的有机萃取物用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法（0至10%甲醇/乙酸乙酯）提纯该粗产物以产生无色泡沫形式的{2-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-氧代乙基}[2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙基]氨基甲酸叔丁酯（0.174克；63%）：MS (m/z): 519 (M+1)。

[0237] 实施例9

[0238] 1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-{[2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙基]氨基}乙酮的合成

[0239]

[0240] 方案L，步骤C. 将盐酸（1M在乙醚中；2.55毫升；8当量；2.55毫摩尔）添加到{2-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-氧代乙基}[2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙基]氨基甲酸叔丁酯（0.165克；1.0当量；0.318毫摩尔）在二氯甲烷（2毫升）和甲醇（1毫升）中的0℃溶液中。在0℃下搅拌1小时后，浓缩该混合物。将粗产物再溶解在二氯甲烷:甲醇的10:1混合物中并用饱和碳酸氢钠洗涤。用另外的二氯甲烷:甲醇的10:1混合物萃取水层（4x）。合并的有机萃取物经硫酸镁干燥，过滤并浓缩以提供棕色泡沫形式的1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-{[2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙基]氨基}乙酮（0.136克；102%）: MS (m/z): 419 (M+1)。

[0241]

[0242] 制备30

[0243] 2-(2-咪唑-1-基乙氧基)乙酸叔丁酯的合成

[0244]

[0245] 方案M，步骤A. 将氢化钠（0.79克；1.1当量；19.75毫摩尔）缓慢添加到1H-咪唑-1-乙醇（2.01克；1.0当量；17.93毫摩尔）在四氢呋喃（90毫升）中的0℃溶液中。搅拌1小时，然后在0℃下逐滴加入乙酸, 溴-, 1,1-二甲基乙酯（4.03毫升；1.49当量；26.76毫摩尔）。将该溶液升温至环境温度并搅拌3小时，然后加入250毫升饱和碳酸氢钠水溶液。用二氯甲烷（3 x 150毫升）萃取该混合物。合并的有机萃取物用盐水（100毫升）洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以提供粗产物。通过柱色谱法（0至20%甲醇/二氯甲烷）提纯这种残留物以提供粘性黄棕色油形式的2-(2-咪唑-1-基乙氧基)乙酸叔丁酯（0.85克；21%）: MS (m/z): 227(M+1)。

[0246] 实施例10

[0247] 1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-[2-(1H-咪唑-1-基)乙氧基]乙酮的合成

[0248]

[0249] 方案M，步骤B. 将三氟乙酸（2毫升）逐滴添加到2-(2-咪唑-1-基乙氧基)乙酸叔丁酯（0.375克；1.0当量；1.66毫摩尔）在二氯甲烷（10毫升）中的溶液中。在室温下搅拌4小时，然后浓缩该混合物。将剩余残留物再溶解在二甲基甲酰胺（5毫升）中并加入二异丙基乙胺（1.45毫升；5当量；8.31毫摩尔），接着加入N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺（0.44克；1.0当量；1.65毫摩尔）。加入六氟磷酸O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓（0.69克；1.1当量；1.81毫摩尔）并在室温下搅拌16小时。将反应混合物倒入饱和碳酸氢钠水溶液（200毫升）中并用二氯甲烷（2 x 200毫升）萃取。用饱和碳酸氢钠水溶液（100毫升）洗涤合并的有机萃取物，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以产生粗产物。通过柱色谱法（0至20%甲醇/二氯甲烷）提纯这种残留物以提供浅棕色固体形式的1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-[2-(1H-咪唑-1-基)乙氧基]乙酮（0.152克；22%）: MS (m/z): 419(M+1)。

[0250]

[0251] 制备31

[0252] 2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酸戊-4-炔-1-基酯的合成

[0253]

[0254] 方案N，步骤A和B. 将1,1'-羰基二咪唑（0.936克；5.66毫摩尔）缓慢地逐滴添加到4-戊炔-1-醇（0.50毫升；5.39毫摩尔）在二氯甲烷（18毫升）中的-78℃溶液中。使该反应升温至环境温度30分钟，然后将该溶液的一半添加到N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,
3-d]嘧啶-2-胺（0.581克；1.05当量；2.18毫摩尔）、4-氨基吡啶,N,N-二甲基-（0.258克；1.0当量；2.08毫摩尔）和三乙胺（0.58毫升；2.0当量；4.15毫摩尔）的溶液中。将所得浅黄色溶液升温至环境温度并搅拌16小时，然后升温至40℃另外24小时。将反应混合物冷却至环境温度并直接加载到硅胶柱上。通过柱色谱法（20至100%乙酸乙酯/二氯甲烷）提纯以提供2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酸戊-4-炔-1-基酯（0.76克；88%）: MS (m/z): 377(M+1)。

[0255] 实施例11

[0256] 2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酸3-(1H-1,2,3-三唑-4-基)丙酯的合成

[0257]

[0258] 方案N，步骤C. 将五水合硫酸铜(II（) 0.090克；0.2当量；0.36毫摩尔）和L-抗坏血酸钠盐（0.714克；2.0当量；3.61毫摩尔）添加到2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酸戊-4-炔-1-基酯（0.754克；1.0当量；1.80毫摩尔）在二甲基甲酰胺（15毫升）和水（15毫升）中的脱氧溶液中。加入叠氮基三甲基硅烷（1.92毫升；8当量；14.42毫摩尔）并将该反应加热至90℃ 3小时。用水（250毫升）和乙酸乙酯稀释该反应混合物。用乙酸乙酯（3 x 50毫升）萃取该混合物。合并的有机萃取物用水（3x）和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩成棕褐色/橙色油。通过柱色谱法（0至5%甲醇/二氯甲烷）提纯该粗产物以提供2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酸3-(1H-1,2,3-三唑-4-基)丙酯（0.26克；35%）: MS (m/z): 420(M+1)。

[0259]

[0260] 制备32

[0261] 6-[2-(茚满-2-基氨基)-5,7-二氢吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]-6-氧代-己腈的合成

[0262]

[0263] 方案O，步骤A. 将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（1.33克；1.15当量；6.94毫摩尔）添加到装有在二氯甲烷（25毫升）中的N-(2,3-二氢-1h-茚-2-基)-6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-2-胺二盐酸盐水合物（1.96克；1.0当量；6.03毫摩尔）和5-溴戊酸（1.4克；1.25当量；7.50毫摩尔）的烧瓶中。将所得反应搅拌2小时，然后直接浓缩该混合物。使残留物在水和二氯甲烷之间分配，并浓缩有机萃取物。通过柱色谱法（70至90%乙酸乙酯/己烷）提纯该粗材料以提供中间体5-溴戊酰胺（0.66克），将其溶解在二甲基甲酰胺（10毫升）中。加入氰化钠（0.128克；2.48毫摩尔）并将所得混合物加热至100℃ 3小时，然后冷却至环境温度。使反应混合物在乙酸乙酯和水之间分配，并分离。用乙酸乙酯（2 x 100毫升）萃取水层，用1 N盐酸，接着盐水洗涤合并的有机萃取物。合并的有机萃取物经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以提供粗产物。通过柱色谱法（5至10%甲醇/二氯甲烷）提纯该粗产物以提供6-[2-(茚满-2-基氨基)-5,7-二氢吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]-6-氧代-己腈（0.0772克；
4%）: MS (m/z): 362(M+1)。

[0264] 实施例12

[0265] 1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]-5-(1H-四唑-5-基)戊-1-酮的合成

[0266]

[0267] 方案O，步骤B. 将二丁基氧代锡烷（0.071克；1.33当量；0.29毫摩尔）和叠氮基三甲基硅烷（1.6毫升；56当量；12.01毫摩尔）添加到6-[2-(茚满-2-基氨基)-5,7-二氢吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]-6-氧代-己腈（0.077克；1.0当量；0.213毫摩尔）在甲苯（6毫升）中的搅拌溶液中。将所得溶液加热至105℃ 16小时。将反应混合物冷却至环境温度并浓缩。将残留物溶解在甲醇（5毫升）中并将该溶液加载到SCX柱上（用甲醇至7N氨/甲醇洗脱）以提供粗产物，其通过反相色谱法提纯以产生1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]-5-(1H-四唑-5-基)戊-1-酮（0.0265克；31%）: MS (m/z): 405(M+1)。

[0268]

[0269] 实施例13

[0270] 2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酸3-(1H-咪唑-1-基)丙酯的合成

[0271]

[0272] 方案P，步骤A. 将氢化钠（0.068克；2.25当量；1.70毫摩尔）添加到2-(茚满-2-基氨基)-5,7-二氢吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酸3-氯丙酯（0.283克；1.0当量；0.76毫摩尔）和1H-咪唑（0.105克；2.0当量；1.54毫摩尔）在二甲基甲酰胺（2.4毫升）中的溶液中。将反应混合物搅拌16小时，然后用二氯甲烷稀释并用水洗涤。用二氯甲烷萃取水层两次。浓缩合并的有机萃取物，然后通过柱色谱法（0至10%甲醇/二氯甲烷）提纯该粗产物以提供黄色固体形式的2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酸3-(1H-咪唑-1-基)丙酯（0.0922克；30%）: MS (m/z): 405(M+1)。

[0273]

[0274] 制备33

[0275] N-丁-3-炔基-N-[2-[2-(茚满-2-基氨基)-5,7-二氢吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯的合成

[0276]

[0277] 方案Q，步骤A. 将丁-3-炔-1-胺（1.24克；8当量；4.48毫摩尔）快速添加到含有在四氢呋喃（5毫升）中的2-氯-1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]乙酮（0.184克；1.0当量；0.56毫摩尔）和三乙胺（0.094毫升；1.2当量；0.67毫摩尔）的烧瓶中。在环境温度下搅拌15分钟，然后加热至55℃ 1小时并加热至65℃ 30分钟。浓缩该混合物，然后将残留物溶解在二氯甲烷（10毫升）中。加入二碳酸二-叔丁酯（0.8克；6.5当量；3.67毫摩尔）并在室温下搅拌30分钟。将该溶液直接加载到硅胶柱上并经色谱法提纯（0至100%乙酸乙酯/己烷）以产生无色泡沫形式的N-丁-3-炔基-N-[2-[2-(茚满-2-基氨基)-5,7-二氢吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯（0.204克；
79%）: MS (m/z): 462(M+1)。

[0278] 制备34

[0279] {2-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]-2-氧代乙基}[2-(1H-1,2,3-三唑-5-基)乙基]氨基甲酸叔丁酯的合成

[0280]

[0281] 方案Q，步骤B. 将五水合硫酸铜(II（) 0.022克；0.2当量；0.088毫摩尔）和L-抗坏血酸钠盐（0.175克；2.0当量；0.88毫摩尔）添加到N-丁-3-炔基-N-[2-[2-(茚满-2-基氨基)-5,7-二氢吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯（0.204克；1.0当量；0.44毫摩尔）在二甲基甲酰胺（6毫升）和水（3毫升）（包括甲苯 (0.05毫升)作为内标）中的脱氧溶液中。加热至90℃，然后在90℃继续搅拌下逐滴加入叠氮基三甲基硅烷（0.47毫升；8当量；3.54毫摩尔）。搅拌3小时，然后用水（100毫升）和乙酸乙酯（50毫升）稀释反应混合物。用乙酸乙酯（3 x 50毫升）萃取并用盐水洗涤合并的有机萃取物。有机物经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法（0至10%甲醇/乙酸乙酯）提纯该粗产物以产生黄色泡沫形式的{2-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]-2-氧代乙基}[2-(1H-1,2,3-三唑-5-基)乙基]氨基甲酸叔丁酯（0.157克；70%）: MS (m/z): 505(M+1)。

[0282] 实施例14

[0283] 1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]-2-{[2-(1H-1,2,3-三唑-5-基)乙基]氨基}乙酮的合成

[0284]

[0285] 方案Q，步骤C. 将三氟乙酸（3毫升）缓慢添加到含有在二氯甲烷（1毫升）中的{2-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]-2-氧代乙基}[2-(1H-1,2,3-三唑-5-基)乙基]氨基甲酸叔丁酯（0.15克；1.0当量；0.297毫摩尔）的0℃溶液中。搅拌2小时，然后升温至环境温度并搅拌30分钟。浓缩该混合物并将残留物溶解在二氯甲烷（20毫升）中。加入饱和碳酸氢钠（20毫升）、盐水（20毫升）和水（50毫升），并用二氯甲烷（6x20毫升）萃取。合并的有机萃取物经硫酸镁干燥，过滤并浓缩以提供黄色泡沫形式的1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]-2-{[2-(1H-
1,2,3-三唑-5-基)乙基]氨基}乙酮（0.093克；77%）: MS (m/z): 405(M+1)。

[0286]

[0287] 制备35

[0288] 2-(茚满-2-基氨基)-5,7-二氢吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酸3-氯丙酯的合成[0289]

[0290] 方案R，步骤A. 将氯甲酸3-氯丙酯（0.55毫升；1.48当量；4.54毫摩尔）在四氢呋喃（21毫升）中的溶液经1小时逐滴添加到N-(2,3-二氢-1H-茚-2-基)-6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-2-胺二盐酸盐水合物（1.0克；1.0当量；3.07毫摩尔）和三乙胺（2.2毫升；5.1当量；15.78毫摩尔）在四氢呋喃（21毫升）中的混合物中。将该溶液搅拌18小时，然后用二氯甲烷稀释并用碳酸氢钠溶液洗涤。用二氯甲烷进一步萃取水层（2x）。合并的有机萃取物经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以提供棕色固体形式的2-(茚满-2-基氨基)-5,7-二氢吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酸3-氯丙酯（1.15克；100%）: MS (m/z): 373(M+1)。

[0291] 制备36

[0292] 2-(茚满-2-基氨基)-5,7-二氢吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酸3-氰丙酯的合成[0293]

[0294] 方案R，步骤B. 将氰化钠（0.230克；1.5当量；4.69毫摩尔）添加到在二甲基甲酰胺（10毫升）中含有2-(茚满-2-基氨基)-5,7-二氢吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酸3-氯丙酯（1.15克；1.0当量；3.08毫摩尔）的溶液中。将反应混合物加热至100℃ 3小时，然后冷却至环境温度，用二氯甲烷、水和5%氯化锂溶液稀释。分离各层并用二氯甲烷和乙酸乙酯进一步萃取水层。合并的有机萃取物经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以提供棕色固体形式的2-(茚满-2-基氨基)-5,7-二氢吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酸3-氰丙酯（0.98克；87%）: MS (m/z): 364(M+1)。

[0295] 实施例15

[0296] 2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酸3-(1H-四唑-5-基)丙酯的合成

[0297]

[0298] 方案R，步骤C. 将叠氮基三甲基硅烷（3.5毫升；9.7当量；26.27毫摩尔）和二丁基氧代锡烷（0.163克；0.25当量；0.66毫摩尔）添加到2-(茚满-2-基氨基)-5,7-二氢吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酸3-氰丙酯（0.98克；1.0当量；2.70毫摩尔）在甲苯（20.4毫升）中的溶液中。将反应混合物加热至100℃ 18小时。浓缩该溶液并通过反相色谱法，接着硅胶色谱法（0至15%甲醇/氯仿）提纯以提供棕色固体形式的所需2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酸3-(1H-四唑-5-基)丙酯（0.097克；9%）: MS (m/z): 407(M+1)。

[0299]

[0300] 制备37

[0301] 2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-n-(戊-4-炔-1-基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酰胺的合成

[0302]

[0303] 方案S，步骤A. N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺（0.418克；1.05当量；1.57毫摩尔），接着4-氨基吡啶, N,N-二甲基-（0.185克；1.0当量；1.50毫摩尔）和三乙胺（0.42毫升；2.0当量；2.99毫摩尔）添加到N-戊-4-炔基咪唑-1-甲酰胺（0.265克；
1.0当量；1.50毫摩尔）的-78℃溶液中。将所得浅黄色溶液升温至室温并搅拌18小时。将反应混合物直接加载到二氧化硅前置柱上并通过柱色谱法（10至50%丙酮/己烷）提纯以提供白色固体形式的2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-n-(戊-4-炔-1-基)-7,8-二氢吡啶并[4,
3-d]嘧啶-6(5H)-甲酰胺（0.286克；51%）: MS (m/z): 376(M+1)。

[0304] 实施例16

[0305] 2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-n-[3-(1H-1,2,3-三唑-4-基)丙基]-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酰胺的合成

[0306]

[0307] 方案S，步骤B. 将五水合硫酸铜(II（) 0.037克；0.2当量；0.15毫摩尔）和L-抗坏血酸钠盐（0.29克；2.0当量；1.46毫摩尔）添加到2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-n-(戊-4-炔-1-基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酰胺（0.275克；1.0当量；0.73毫摩尔）在二甲基甲酰胺（2.44毫升）和水（2.44毫升）中的脱氧溶液中。加入叠氮基三甲基硅烷（0.78毫升；8当量；5.86毫摩尔）并加热至90℃ 1小时。将该溶液冷却至环境温度，用30毫升水稀释该反应混合物并用乙酸乙酯（3 x 50毫升）萃取。用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩成黄色油。通过柱色谱法（0至80%丙酮/二氯甲烷）提纯该粗产物以提供白色固体形式的2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-N-[3-(1H-1,2,3-三唑-4-基)丙基]-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酰胺（0.132g；43%）: MS (m/z): 419(M+1)。

[0308]

[0309] 制备38

[0310] N-戊-4-炔基咪唑-1-甲酰胺的合成

[0311]

[0312] 方案T，步骤A. 将1,1'-羰基二咪唑（0.539毫克，1.05当量；3.26毫摩尔）缓慢地逐份添加到4-戊炔-1-胺（0.258毫升；1.0当量；3.10毫摩尔）在二氯甲烷（10毫升）中的-78℃溶液中。使该反应升温至环境温度并搅拌72小时。该溶液直接用于随后的化学: MS (m/z): 178(M+1)。

[0313] 制备39

[0314] 2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-n-(戊-4-炔-1-基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酰胺的合成

[0315]

[0316] 方案T，步骤B. 将N-(2,3-二氢-1H-茚-2-基)-6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-2-胺二盐酸盐水合物（0.266克；0.5当量；0.78毫摩尔），接着三乙胺（1.08毫升；5当量；7.76毫摩尔）和4-氨基吡啶, N,N-二甲基-（0.029克；0.15当量；0.23毫摩尔）添加到N-戊-4-炔基咪唑-1-甲酰胺（0.275克；1.0当量；1.55毫摩尔）在二氯甲烷（5毫升）中的-78℃溶液中。
使该浅棕色溶液升温至环境温度并搅拌24小时。将反应混合物直接加载到硅胶柱上并通过柱色谱法（0至30%乙酸乙酯/己烷）提纯以提供白色固体形式的2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-n-(戊-4-炔-1-基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酰胺（0.293克；63%）: MS (m/z): 362(M+1)。

[0317] 实施例17

[0318] 2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-N-[3-(1H-1,2,3-三唑-4-基)丙基]-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酰胺的合成

[0319]

[0320] 方案T，步骤C. 将五水合硫酸铜(II（) 0.049克；0.2当量；0.20毫摩尔）和L-抗坏血酸钠盐（0.388克；2.0当量；1.96毫摩尔）添加到2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-N-(戊-4-炔-1-基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酰胺（0.354克；1.0当量；0.98毫摩尔）在二甲基甲酰胺（3.26毫升）和水（3.26毫升）中的脱氧溶液中。加入叠氮基三甲基硅烷（1.04毫升；8当量；7.84毫摩尔）并将该混合物加热至90℃ 1小时，冷却至环境温度并搅拌16小时。将该溶液浓缩至干，并通过柱色谱法（0至10%甲醇/乙酸乙酯）提纯所得橙色半固体以提供固体形式的2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-N-[3-(1H-1,2,3-三唑-4-基)丙基]-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酰胺（0.085克；21%): MS (m/z): 405(M+1)。

[0321]

[0322] 制备40

[0323] 1-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-2-(戊-4-炔基氨基)乙酮的合成

[0324]

[0325] 方案U，步骤A. 将三乙胺（0.434毫升；2.0当量；3.12毫摩尔），接着4-戊炔-1-胺（0.194毫升；1.50当量；2.34毫摩尔）添加到2-氯-1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]乙酮（0.534克；1.0当量；1.56毫摩尔）在四氢呋喃（5.19毫升）中的溶液中。在55℃下搅拌48小时。将该溶液直接浓缩以提供1-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-2-(戊-4-炔基氨基)乙酮（0.606克；100%）: MS (m/z): 390(M+1)。

[0326] 制备41

[0327] N-{2-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-氧代乙基}-n-(戊-4-炔-1-基)乙酰胺的合成

[0328]

[0329] 方案U，步骤B. 将乙酸酐（0.176毫升；1.20当量；1.87毫摩尔），接着三乙胺（0.325毫升，1.5当量；2.33毫摩尔）添加到1-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-2-(戊-4-炔基氨基)乙酮（0.606克；1.0当量；1.56毫摩尔）在二氯甲烷（5.2毫升）中的溶液中。用水和二氯甲烷稀释该反应混合物。分离各层并用盐水洗涤有机萃取物，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩成橙/棕色油。通过柱色谱法（0至2%甲醇/乙酸乙酯）提纯该粗产物以提供所需N-{2-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-氧代乙基}-n-(戊-4-炔-1-基)乙酰胺（0.138克；21%）: MS (m/z): 432(M+1)。

[0330] 实施例18

[0331] N-{2-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-氧代乙基}-N-[3-(1H-1,2,3-三唑-4-基)丙基]乙酰胺的合成

[0332]

[0333] 方案U，步骤C. 将五水合硫酸铜(II（) 0.016克；0.2当量；0.063毫摩尔）和L-抗坏血酸钠盐（0.126克；2.0当量；0.64毫摩尔）添加到N-{2-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-氧代乙基}-n-(戊-4-炔-1-基)乙酰胺（0.137克；1.0当量；0.32毫摩尔）在二甲基甲酰胺（2.12毫升）和水（1.06毫升）中的脱氧溶液中。加入叠氮基三甲基硅烷（0.34毫升；8当量；2.54毫摩尔）并将所得溶液加热至90℃ 1小时。将反应混合物浓缩成棕色糊并通过柱色谱法（0至10%甲醇/乙酸乙酯）提纯该粗产物以提供灰白色固体形式的N-{2-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-氧代乙基}-N-[3-(1H-1,2,3-三唑-4-基)丙基]乙酰胺（0.036克；25%）: MS (m/z): 475(M+1)。

[0334]

[0335] 制备42

[0336] 2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-甲酸3-氯丙酯的合成[0337]

[0338] 方案V，步骤A. 将氯甲酸3-氯丙酯（0.55毫升；1.2当量；4.51毫摩尔）在四氢呋喃（25毫升）中的溶液经1小时添加到N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺（1.00克；1.0当量；3.75毫摩尔）和三乙胺（1.10毫升；2.1当量；7.88毫摩尔）在四氢呋喃（25毫升）中的混合物中。搅拌2小时，然后用二氯甲烷和饱和碳酸氢钠稀释并分离各层。用二氯甲烷进一步萃取水层（2x）。合并的有机萃取物经硫酸钠干燥，过滤并浓缩至干以产生黄色油。通过柱色谱法（10%甲醇/二氯甲烷）提纯该粗产物至2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-甲酸3-氯丙酯（1.146克；79%）: MS (m/z): 387(M+1)。

[0339] 实施例19

[0340] 2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酸3-(5-甲基-1H-咪唑-1-基)丙酯的合成

[0341]

[0342] 方案V，步骤B. 将氢化钠（0.121克；2.2当量；3.01毫摩尔）添加到4(5)-甲基咪唑（0.180克；1.6当量；2.19毫摩尔）在四氢呋喃（15毫升）中的溶液中。将反应混合物冷却至0℃并搅拌15分钟，接着添加2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-甲酸3-氯丙酯（0.530克；1.0当量；1.37毫摩尔）。使该反应在环境温度下搅拌24小时。用二氯甲烷和水稀释该反应混合物并分离各层。用二氯甲烷进一步萃取水层（2x）。合并的有机萃取物经硫酸钠干燥，过滤并浓缩至干以产生黄色液体。通过柱色谱法（0至5%甲醇/二氯甲烷）提纯该粗产物以提供两种区域异构产物的混合物。使用手性色谱载体（chiralcel OJ-H, 
5%乙腈/甲醇，含0.2%异丙胺）进一步提纯提供产物2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酸3-(5-甲基-1H-咪唑-1-基)丙酯（0.055克；12%）。MS (m/z): 433(M+1)。

[0343] 实施例20

[0344] 2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酸3-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)丙酯的合成

[0345]

[0346] 基本如实施例19中所述进行制备。使用手性色谱载体（chiralcel OJ-H, 5%乙腈/甲醇，含0.2%异丙胺）进一步提纯提供产物2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酸3-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)丙酯（0.111克；25%）。MS (m/z): 433(M+1)。

[0347]

[0348] 制备43

[0349] 3-(1H-咪唑-5-基)丙酸甲酯的合成

[0350]

[0351] 方案W，步骤A. 将亚硫酰氯（0.75毫升）添加到3-(1H-咪唑-5-基)丙酸（2.0克；1.0当量；14.27毫摩尔）在甲醇（18毫升）中的-78℃溶液中。使反应混合物升温至环境温度并搅拌30分钟。将饱和碳酸氢钠（10毫升）添加到反应混合物中并浓缩。将所得残留物悬浮在甲醇（10毫升）中并过滤，然后浓缩以提供白色固体形式的3-(1H-咪唑-5-基)丙酸甲酯（2.2克；100%）: MS (m/z): 155(M+1)。

[0352] 制备44

[0353] 3-(1H-咪唑-5-基)丙-1-醇的合成

[0354]

[0355] 方案W，步骤B. 将氢化锂铝（1M在四氢呋喃中；17毫升；2.0当量；17.00毫摩尔）经5分钟逐滴添加到3-(1H-咪唑-4-基)丙酸甲酯（2.2克；1.0当量；8.52毫摩尔）在四氢呋喃（85毫升）中的0℃溶液中。将反应混合物升温至环境温度并搅拌16小时。相继加入水（0.65毫升）、15%氢氧化钠（0.65毫升）和水（1.95毫升），然后搅拌30分钟。过滤所得固体并用丙酮冲洗。浓缩该滤液以提供白色固体形式的3-(1H-咪唑-5-基)丙-1-醇（3.0克；61%）。为了进一步提纯该产物，将一部分3-(1H-咪唑-4-基)丙-1-醇（1.5克）悬浮在水（50毫升）中并在100℃下搅拌2小时。过滤产物混合物并浓缩该滤液以提供灰白色固体形式的纯3-(1H-咪唑-5-基)丙-1-醇（0.5克）: MS (m/z): 127(M+1)。

[0356] 实施例21

[0357] 2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酸3-(1H-咪唑-5-基)丙酯的合成

[0358]

[0359] 方案W，步骤C. 将1,1'-羰基二咪唑（0.51克；1.2当量；3.15毫摩尔）添加到3-(1H-咪唑-5-基)丙-1-醇（0.50克；1.0当量；2.62毫摩尔）在二甲基甲酰胺（8.5毫升）中的溶液中并搅拌1小时。将N-(2,3-二氢-1H-茚-2-基)-6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-2-胺二盐酸盐水合物（0.94克；1.10当量；2.89毫摩尔）缓慢添加到上述溶液中。在环境温度下搅拌16小时，然后加热至60℃另外16小时。使反应混合物在水和氯仿之间分配并分离各层。用氯仿进一步萃取水层（2x）。合并的有机萃取物经硫酸镁干燥，过滤并浓缩成粘性液体。通过柱色谱法（0至20%甲醇/二氯甲烷）提纯该粗产物以提供棕色固体形式的2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-甲酸3-(1H-咪唑-5-基)丙酯（0.041克；4%）: MS (m/z): 405(M+1)。

[0360]

[0361] 制备45

[0362] 2-(丁-3-炔基氨基)-1-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]乙酮的合成

[0363]

[0364] 方案X，步骤A. 将三乙胺（0.85毫升；2.0当量；6.13毫摩尔），接着1-氨基-3-丁炔（0.38毫升；1.5当量；4.59毫摩尔）添加到2-氯-1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]乙酮（1.05克；1.0当量；3.06毫摩尔）在四氢呋喃（10.2毫升）中的溶液中并加热至55℃ 16小时，然后浓缩并将该2-(丁-3-炔基氨基)-1-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]乙酮直接用于下一步骤: MS (m/z): 
376(M+1)。

[0365] 制备46

[0366] N-(丁-3-炔-1-基)-n-{2-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-氧代乙基}乙酰胺的合成

[0367]

[0368] 方案X，步骤B. 将乙酰氯（0.041毫升；1.2当量；0.58毫摩尔）和三乙胺（0.101毫升；1.5当量；0.73毫摩尔）添加到2-(丁-3-炔基氨基)-1-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]乙酮（0.303克；1.0当量；0.48毫摩尔）在二氯甲烷（1.61毫升）中的溶液中。在5分钟后，用水和二氯甲烷（各20毫升）稀释该反应并分离各层。有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩成橙/棕色油。通过柱色谱法（0至80%丙酮/二氯甲烷）提纯该粗产物以提供N-(丁-3-炔-1-基)-n-{2-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-氧代乙基}乙酰胺（0.08克；38%）: MS (m/z): 418(M+
1)。

[0369] 实施例22

[0370] N-{2-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-氧代乙基}-n-[2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙基]乙酰胺的合成

[0371]

[0372] 方案X，步骤C. 将五水合硫酸铜(II（) 0.009克；0.2当量；0.036毫摩尔）和L-抗坏血酸钠盐（0.071克；2.0当量；0.36毫摩尔）添加到N-(丁-3-炔-1-基)-N-{2-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-氧代乙基}乙酰胺（0.075克；1.0当量；0.18毫摩尔）在二甲基甲酰胺（1.20毫升）和水（0.6毫升）中的脱氧溶液中。加入叠氮基三甲基硅烷（0.19毫升；8当量；1.44毫摩尔）并加热至90℃ 1.5小时。用水稀释该反应混合物并用乙酸乙酯（3x50毫升）萃取。用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩成黄色油。通过柱色谱法（0至80%丙酮/二氯甲烷）提纯该粗产物以提供黄色泡沫形式的N-{2-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-2-氧代乙基}-n-[2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙基]乙酰胺（0.025克；30%）: MS (m/z): 461(M+1)。

[0373]

[0374] 实施例23

[0375] N-{3-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-3-氧代丙基}-2-(1H-1,2,3-三唑-5-基)乙酰胺的合成

[0376]

[0377] 方案Y，步骤A. 将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（0.111克；1.5当量；0.58毫摩尔）添加到2-(2H-三唑-4-基)乙酰胺（0.056克；1.1当量；0.42毫摩尔）、3-氨基-1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]丙-1-酮（0.13克；1.0当量；0.39毫摩尔）和N,N-二甲基-4-氨基吡啶（0.0094克；0.2当量；0.077毫摩尔）在二氯甲烷（1.28毫升）中的溶液中。将反应混合物在环境温度下搅拌16小时。将该溶液直接加载到硅胶柱上并通过柱色谱法（0至10%甲醇/二氯甲烷）提纯以产生白色固体形式的N-{3-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-3-氧代丙基}-2-(1H-1,2,3-三唑-5-基)乙酰胺（0.098克；57%）: MS (m/z): 447(M+1)。

[0378]

[0379] 实施例24

[0380] N-{3-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-3-氧代丙基}-1H-1,2,3-三唑-4-甲酰胺的制备

[0381]

[0382] 方案Z，步骤A. 将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（0.111克；1.5当量；0.58毫摩尔）添加到2H-三唑-4-甲酸（0.048克；1.1当量；0.42毫摩尔）、3-氨基-1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]丙-1-酮（0.13克；1.0当量；0.39毫摩尔）和N,N-二甲基-4-氨基吡啶（0.0094克；0.2当量；0.077毫摩尔）在二氯甲烷（1.28毫升）中的溶液中。将该反应在环境温度下搅拌16小时。将该混合物直接加载到硅胶柱上并通过柱色谱法（0至10%甲醇/乙酸乙酯）提纯以提供白色固体形式的N-{3-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-3-氧代丙基}-1H-
1,2,3-三唑-4-甲酰胺（0.105克；63%）: MS (m/z): 433(M+1)。

[0383]

[0384] 制备47

[0385] {3-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-3-氧代丙基}氨基甲酸叔丁酯的合成

[0386]

[0387] 方案AA，步骤A. 将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（2.69克；1.5当量；14.06毫摩尔）添加到含有在二氯甲烷（30毫升）中的3-(叔丁氧基羰基氨基)丙酸（1.8克；1.0当量；9.37毫摩尔）、N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺（2.50克；1.0当量；9.37毫摩尔）和N,N-二甲基-4-氨基吡啶（0.229克；0.2当量；1.87毫摩尔）的烧瓶中。将该混合物搅拌2小时，然后将该溶液直接加载到硅胶柱上并通过柱色谱法（30至100%乙酸乙酯/二氯甲烷）提纯以产生无色泡沫形式的{3-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,
8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-3-氧代丙基}氨基甲酸叔丁酯（3.42克；83%）: MS (m/z): 438(M+1)。

[0388] 制备48

[0389] 3-氨基-1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]丙-1-酮的合成

[0390]

[0391] 方案AA，步骤B. 将三氟乙酸（1毫升）添加到{3-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-3-氧代丙基}氨基甲酸叔丁酯（0.19克；1.0当量；
0.44毫摩尔）在二氯甲烷（1毫升）中的溶液中并搅拌16小时。浓缩该混合物，然后将残留物在二氯甲烷和1N氢氧化钠之间分配。分离各层并用二氯甲烷进一步萃取水层。合并的有机萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以提供所需3-氨基-1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]丙-1-酮（0.145克；98%）: MS (m/z): 338(M+1)。

[0392] 实施例25

[0393] H-{3-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-3-氧代丙基}-2-(1H-咪唑-1-基)乙酰胺的合成

[0394]

[0395] 方案AA，步骤C. 将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（0.124克；1.5当量；0.65毫摩尔）添加到2-咪唑-1-基乙酸（0.060克；1.1当量；0.47毫摩尔）、3-氨基-1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]丙-1-酮（0.145克；1.0当量；0.43毫摩尔）和N,N-二甲基-4-氨基吡啶（0.0105克；0.2当量；0.086毫摩尔）在二氯甲烷（1.43毫升）中的溶液中。将所得溶液搅拌16小时。将该溶液直接加载到硅胶柱上并通过柱色谱法（0至10%甲醇/二氯甲烷）提纯以提供白色固体形式的H-{3-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基]-3-氧代丙基}-2-(1H-咪唑-1-基)乙酰胺（0.094克；49%）: MS (m/z): 446(M+1)。

[0396]

[0397] 制备49

[0398] 1-苄基-5-羟基-1H-1,2,3-三唑-4-甲酸乙酯的合成

[0399]

[0400] 方案BB，步骤A. 将丙二酸二乙酯（7.16毫升；1.3当量；46.67毫摩尔），接着碳酸钾（19.85克；4当量；143.60毫摩尔）添加到苄基叠氮（4.5毫升；1.0当量；35.90毫摩尔）在二甲亚砜（36毫升）中的溶液中并将所得溶液在40℃下加热16小时。加入5 N盐酸直至pH = 1，然后过滤所得沉淀物。用水洗涤该沉淀物并干燥以提供白色固体形式的1-苄基-5-羟基-1H-1,2,3-三唑-4-甲酸酯（5.65克；64%）: MS (m/z): 248(M+1)。

[0401] 制备50

[0402] 1-苄基-5-羟基-1H-1,2,3-三唑-4-甲酸的合成

[0403]

[0404] 方案BB，步骤B. 将1-苄基-5-羟基-1H-1,2,3-三唑-4-甲酸酯（1.46克；1.0当量；5.90毫摩尔）和氢氧化钠（1N；10.00毫升；1.7当量；10.00毫摩尔）的90℃溶液搅拌9小时。加入1N盐酸直至pH为2，然后过滤该反应并干燥滤饼以提供1-苄基-5-羟基-1H-1,2,3-三唑-
4-甲酸（1.15克；89%）: MS (m/z): 220(M+1)。

[0405] 制备51

[0406] 1-苄基-1H-1,2,3-三唑-5-醇的合成

[0407]

[0408] 方案BB，步骤C. 将1-苄基-5-羟基-1H-1,2,3-三唑-4-甲酸（1.25克；1.0当量；5.70毫摩尔）在二甲基甲酰胺（2毫升）中的溶液置于预热至125℃的反应块中并加热2分钟。
使该反应冷却至室温并立即将该1-苄基-1H-1,2,3-三唑-5-醇用于下一步骤：MS (m/z): 
176(M+1)。

[0409] 制备52

[0410] 4-[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-5-基)氧基]丁酸甲酯的合成

[0411]

[0412] 方案BB，步骤D. 将4-溴丁酸甲酯（1.48毫升；2.0当量；11.42毫摩尔）添加到1-苄基-1H-1,2,3-三唑-5-醇（1.0克；1.0当量；5.71毫摩尔）和碳酸钾（1.59克；2.0当量；11.42毫摩尔）在二甲基甲酰胺（2毫升）中的溶液中。将该反应在50℃下加热1小时，然后冷却至环境温度并搅拌16小时。用乙酸乙酯和水稀释该反应。分离各层并用乙酸乙酯进一步萃取水层。用水洗涤合并的有机萃取物（3x），经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法（0至50%乙酸乙酯/二氯甲烷）提纯该粗产物以提供4-[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-5-基)氧基]丁酸甲酯（0.506克；32%）: MS (m/z): 276(M+1)。

[0413] 制备53

[0414] 4-(2H-三唑-4-基氧基)丁酸甲酯的合成

[0415]

[0416] 方案BB，步骤E. 将5滴浓盐酸添加到4-[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-5-基)氧基]丁酸甲酯（0.50克；1.0当量；1.82毫摩尔）和10%碳载钯（0.05克；0.025当量；0.047毫摩尔）在乙醇（7毫升）中的不均匀溶液中。排气并用氮气（3x），然后氢气（3x）回填，并将反应混合物在50 psi氢气下剧烈搅拌16小时。过滤该内容物并浓缩滤液以提供4-(2H-三唑-4-基氧基)丁酸甲酯（0.335克；99%）。MS (m/z): 184(M-1)。

[0417] 制备54

[0418] 4-(2H-三唑-4-基氧基)丁酸的合成

[0419]

[0420] 方案BB，步骤F. 将1N氢氧化钠（2.32毫升；2.0当量；2.32毫摩尔）添加到4-(2H-三唑-4-基氧基)丁酸甲酯（0.215克；1.0当量；1.16毫摩尔）在乙醇（1毫升）中的溶液中并将该混合物加热至60℃ 16小时。加入1N盐酸（2.32毫升；2.0当量；2.32毫摩尔）并浓缩以提供4-(2H-三唑-4-基氧基)丁酸（0.20克；100%）。不经进一步提纯即用于下一步骤：MS (m/z): 170(M-1)。

[0421] 实施例26

[0422] 1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]-4-(1H-1,2,3-三唑-5-基氧基)丁-1-酮的合成

[0423]

[0424] 方案BB，步骤G. 将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（0.168克；1.5当量；0.88毫摩尔）和二异丙基乙胺（0.41毫升；4当量；2.34毫摩尔）添加到4-(2H-三唑-4-基氧基)丁酸（0.1克；1.0当量；0.58毫摩尔）和N-(2,3-二氢-1H-茚-2-基)-6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-2-胺二盐酸盐水合物（0.201克；1.0当量；0.58毫摩尔）和N,N-二甲基-4-氨基吡啶（0.014克；0.2当量；0.12毫摩尔）在二氯甲烷（5.8毫升）中的溶液中。将该反应搅拌2小时，然后将反应混合物直接加载到硅胶柱上。通过柱色谱法（10%（2N氨/甲醇）/乙酸乙酯）提纯以提供白色固体形式的1-[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基]-4-(1H-1,2,3-三唑-5-基氧基)丁-1-酮（0.104克；44%）: MS (m/z): 406(M+1)。

[0425] 通过胆碱释放测得的autotaxin的抑制

[0426] 这一试验的目的是使用胆碱释放试验检测autotaxin抑制。

[0427] 受试化合物（在100% DMSO中的10 mM储液）在100% DMSO中连续稀释以在半区96孔板（Corning 3992）中产生10个浓度的100X抑制剂。在100% DMSO中的这10个孔各自在圆底96孔板（Fisher 12565502）中在测定缓冲液中稀释1:33.33，以在含有3% DMSO的孔中产生
3X浓度。该测定缓冲液是50 mM Tris pH8.0、5 mM KCl、1 mM CaCl2、1 mM MgCl2、0.01% TRITONTM X-100 (Sigma T9284)和0.01%脂肪酸游离牛血清白蛋白（Sigma A8806）。然后将各3X受试化合物的20微升等分试样一式一份（in singlicate）添加到黑色平底96孔板（Corning 3991）中。然后将3X重组人autotaxin（转染到293E细胞中并通过镍螯合物和尺寸排阻色谱法提纯的具有C端His标签的全长人autotaxin）的每孔20微升等分试样添加到除无酶对照孔外的每一孔中。将每孔20微升的测定缓冲液等分试样添加到无酶对照孔中。在避光的同时将含有胆碱氧化酶（Sigma C5896）、辣根过氧化物酶（Sigma P8125）、amplex ultrared（Invitrogen A36006）和autotaxin底物溶血磷脂酰胆碱（LPC）16:0（Avanti Polar Lipids 855675P）的3X混合物（cocktail）的20微升等分试样添加到各孔中。胆碱氧化酶、辣根过氧化物酶、amplex ultrared和LPC 16:0在孔中的最终浓度分别为0.4单位/毫升、4单位/毫升、40 μM和30 μM。然后将该板用铝箔封条密封并在Labline Imperial III孵育器中在37℃下孵育1小时。在该孵育过程中，LPC被autotaxin裂解以产生溶血磷脂酸（LPA）16:0和胆碱。释放的胆碱被胆碱氧化酶氧化以产生甜菜碱和过氧化氢。过氧化氢与辣根过氧化物和amplex ultrared反应形成荧光分子试卤灵（resorufin）。用SpectraMax Gemini EM荧光计使用SoftMax Pro 4.8软件在530-590纳米激发-发射波长下测定板上的试卤灵。借助内部Lilly软件OLO曲线拟合工具，使用4参数曲线拟合计算IC50s。结果表示为算数平均值+/-标准偏差；n=x。本文中的实施例1-15的化合物基本如上所述测试并表现出低于大约100nM的对autotaxin的IC50。下面例举的化合物基本如上所述测试并表现出对autotaxin 的下列活性：

[0428] 表1: autotaxin的抑制: 胆碱释放试验

[0429]受试化合物 IC50 (nM)
实施例1和1a 5.7 nM (n=7)
实施例2和2a <1.7 nM (n=5)

[0430] 表1中的数据表明表1的化合物在体外胆碱释放试验中抑制autotaxin。

[0431] 在人血浆存在下的LPA的降低

[0432] 下列试验旨在测量LPA的降低。当其用于测试已被识别为autotaxin抑制剂的化合物时，这一试验是可用于识别选择性autotaxin-介导的LPA抑制剂化合物的工具。经由autotaxin生物合成LPA被认为对LPA1介导的神经性疼痛而言是LPA来源。Makoto Inoue等人, “Autotaxin, a synthetic enzyme of lysophosphatidic acid (LPA), mediates the induction of nerve-injured neuropathic pain”, Molecular Pain, 2008, 4:6。通过这一试验的结果证实autotaxin介导的LPA生物合成的靶向抑制。

[0433] 将收集在肝素钠（Lampire Biologicals）中的来自健康人类女性捐献者的血浆单元汇集、等分并储存在-80℃。在试验当天，将血浆等分试样解冻并在离心机中在4℃下以3000 RPMs旋转10分钟以除去碎屑。将90微升血浆等分试样添加到96孔圆底聚丙烯板的各孔中。将含有10% DMSO/测定缓冲液（50 mM Tris pH8.0、5 mM KCl、1 mM CaCl2、1 mM MgCl2）的10X受试化合物的10微升等分试样添加到除不含受试化合物的对照孔外的各孔中。这一式一份地产生10个1X受试化合物浓度，最终浓度为1% DMSO在90%血浆中。将无受试化合物的10% DMSO/测定缓冲液的10微升等分试样添加到0小时(n=8)和3小时无受试化合物对照(n=8)孔中。将500 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的10微升等分试样添加到各0小时无受试化合物对照孔中以螯合内源性autotaxin。将0小时无受试化合物对照孔的整个内容物转移到新的96孔圆底聚丙烯板中并冷冻在-80℃下。然后将含有血浆+/-受试化合物（减去0小时无抑制剂对照孔）的板在Robbins Scientific™ 400型杂交孵育器中在以14,000 RPMs摇