类糖鞘脂化合物及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种类糖鞘脂化合物及其制备方法与应用。该类糖鞘脂化合物的结构通式如式I所示，所述式I中，R为‑CH2C17H35或该化合物在促进B16细胞的MMP‑9的表达方面具有与天然神经节苷GM3类似的功能。与现有的类糖鞘脂合成方法相比，该方法省去了合成中繁杂的保护、脱保护及寡糖还原端活化过程，实现了高效、快速地合成糖鞘脂类似物，且合成的类糖鞘脂结构较天然糖鞘脂结构简单，具有与天然糖鞘脂类似的生物活性。

权利要求

1.式I所示化合物为如下任意一种：

2.一种制备权利要求1所述式I化合物的方法，包括如下步骤：将糖类化合物和式II所示化合物混合进行反应，反应完毕得到所述式I化合物；

所述式II中，R为-CH2C17H35或所述糖类化合物为D-(+)-葡萄糖、D-(+)-半乳糖、D-乳糖、D-麦芽三糖或GM3三糖；

其中，D‐(+)‐葡萄糖的结构式如下：D‐(+)‐半乳糖的结构式如下：D‐乳糖的结构式如下：

D‐麦芽三糖的结构式如下：

GM3三糖的结构式如下：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述糖类化合物和式II所示化合物的投料摩尔比为2-5：1；

所述反应步骤中，温度为30-60℃，时间为6-18小时；

所述反应在由pH值为3-5的由N,N-二甲基甲酰胺和冰醋酸组成的混合液中进行。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述糖类化合物和式II所示化合物的投料摩尔比为3：1；

所述反应步骤中，温度为45℃，时间为8小时；

所述反应在由pH值为3.7的由N,N-二甲基甲酰胺和冰醋酸组成的混合液中进行。

5.式II所示化合物，

所述式II中，R为-CH2C17H35或

6.一种制备权利要求5所述式II所示化合物的方法，包括如下步骤：将 溶于乙酸乙酯后通入氯化氢气体直至饱和，进行还原反应，反应完毕得到所述式II所示化合物；

所述-Boc为叔丁氧羰基；

R为-CH2C17H35或

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述还原反应步骤中，温度为常温，时间为

0.5-3小时。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述还原反应步骤中，所述时间为1小时。

9.权利要求1所述式I所示化合物在制备增强黑色素瘤细胞中MMP-9表达的产品中的应用。

10.权利要求1所述式I所示化合物在制备抑制黑色素瘤细胞迁移的产品中的应用。

说明书

类糖鞘脂化合物及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种类糖鞘脂化合物及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 糖鞘脂(glycosphingolipid)是糖脂的一种，由寡糖和神经酰胺两部分组成，疏水部分神经酰胺由鞘氨醇的氨基被脂肪酸酰化而成，亲水部分寡糖的还原末端与鞘氨醇的伯羟基相连。构成糖鞘脂寡糖的单糖有葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸等6种，这些单糖连接形成多种寡糖，疏水脂肪链的长短等也存在变化，从而组成了成员众多的糖鞘脂家族。

[0003] 糖鞘脂主要分布在哺乳动物细胞膜脂双层结构中，疏水的长脂肪链埋在外侧脂层中，亲水的糖链伸展到胞外水相中。作为真核细胞膜的重要组成之一，糖鞘脂不仅维持细胞的正常结构，也参与细胞的社会行为。随着生物技术和分析测试技术的快速发展，多种糖鞘脂的结构和生物学功能得到进一步明确，在细胞分裂、信号转导、细胞识别、癌症、免疫、炎症、微生物感染等众多生命过程和疾病形成过程中，糖鞘脂都扮演着非常重要的角色。因此，获得结构明确的糖鞘脂，对于糖鞘脂的生物学研究和相关疾病的新药研发具有重要意义。

[0004] 目前市场上可以获得的糖鞘脂主要来自天然(如牛脑、海绵等)，但天然产物的分离、纯化和结构鉴定难度较高，得到的糖鞘脂种类和数量有限，而且可能带来潜在的朊病毒或其它感染源的污染，而人工合成可以避免这些缺点，是实现糖鞘脂或类糖鞘脂化合物快速、规模化制备的发展趋势，也是糖生物学研究领域中的一个重要学科增长点。

[0005] 化学合成是通过人工合成获得结构确定的糖鞘脂的重要途径。1961年报道了首例糖鞘脂——半乳糖神经酰胺的全合成，自此，已经合成了Gb3(注：Gb3为国际通用的糖鞘脂名称，下同)、iGb3、Lex抗原、GM3等许多种不同类型糖鞘脂或类糖鞘脂化合物，合成技术趋于简单化、快速化。迄今为止，合成策略通常由寡糖合成开始，然后将寡糖作为糖基供体和神经酰胺的伯羟基经糖苷化反应来构建糖鞘脂分子。由于糖鞘脂结构复杂、反应官能团多，糖基供体和神经酰胺伯羟基之间的糖苷化反应要严格控制区域选择性，因而需要繁杂的保护、脱保护及糖基还原端活化的操作，导致合成步骤多、总产率低，所发展的合成方法也只能针对个别种类的糖鞘脂。

[0006] 酶促合成是通过人工合成获得结构确定的糖鞘脂的另一途径。由于尚未获得生物体内负责将糖基转移到神经酰胺上的关键酶，糖鞘脂的酶促合成无法照搬体内的生物合成途径。且酶的来源有限及酶识别底物的高度特异性严重制约了其通用性。

[0007] 综上所述，天然糖鞘脂的人工合成需要较高的实验技巧，在实施关键步骤——糖基和神经酰胺伯羟基之间的连接时，必须通过繁杂的保护与脱保护(化学方法)、糖苷酶改造(酶促方法)及糖基还原端活化来实现糖苷化反应中区域选择性的控制，神经酰胺的合成也是一个非常复杂的过程，特别是烯键和仲羟基构造难度较大。因此，关于天然糖鞘脂的全合成虽然屡见报道，但尚未建立起效率高、通用性好的合成方法。

[0008] 由于结构确定的天然糖鞘脂不易获得，借助比较易于合成的糖鞘脂类似物或类糖鞘脂(neoglycospingolipid)“间接”进行糖鞘脂生物学功能研究的思路受到重视。糖鞘脂的生物学功能主要由糖基、酰胺键、脂肪链协同决定，而鞘氨醇上的仲羟基则是提高糖鞘脂水溶性的关键，因此类糖鞘脂一定要具备上述四种基本结构，以便尽可能好地模拟天然糖鞘脂的生物学功能。这是设计类糖鞘脂分子结构的基本出发点。

[0009] 目前类糖鞘脂的设计与合成主要有两个方向：(1)用容易获得的神经酰胺类似物替代天然结构的神经酰胺，从而省去复杂的神经酰胺合成过程，与天然糖鞘脂相比，缩短了鞘氨醇脂肪链，但活性却未改变；(2)改变糖鞘脂中糖基与神经酰胺的糖苷键类型。在保留糖基、酰胺键、脂肪链和鞘氨醇上的仲羟基等关键基团的基础上，对糖鞘脂的结构进行适当修饰，可以维持甚至改善其生物活性，这为我们进行类糖鞘脂分子结构设计提供了基本依据。

[0010] 但目前在类糖鞘脂的合成中，糖基与神经酰胺类似物连接时采用的方法与天然糖鞘脂相同，需要糖上羟基的保护、脱保护及还原端活化等繁杂操作，合成效率低，通用性差等缺点依然存在。与天然糖鞘脂的人工合成一样，高效且便于规模化制备的类糖鞘脂合成方法也未建立，制约了糖鞘脂的生物学研究和相关疾病防治药物的开发。

发明内容

[0011] 本发明的目的是提供一种类糖鞘脂化合物及其制备方法与应用。

[0012] 本发明提供的类糖鞘脂化合物，其结构通式如式I所示，

[0013]

[0014] 所述式I中，R为-CH2C17H35或

[0015] 具体的，所述式I所示化合物为如下化合物中的任意一种：

[0016]

[0017] 本发明提供的制备所述式I化合物的方法，包括如下步骤：将糖类化合物和式II所示化合物混合进行反应，反应完毕得到所述式I化合物；

[0018]

[0019] 所述式II中，R为-CH2C17H35或

[0020] 所述糖类化合物为D-(+)-葡萄糖、D-(+)-半乳糖、D-乳糖、D-麦芽三糖或GM3三糖；

[0021] 其中，D‐(+)‐葡萄糖的结构式如下：

[0022] D‐(+)‐半乳糖的结构式如下：

[0023] D‐乳糖的结构式如下：

[0024] D‐麦芽三糖的结构式如下：

[0025] GM3三糖的结构式如下：

[0026] 上述方法中，所述糖类化合物和式II所示化合物的投料摩尔比为2-5：1，具体为3：1；

[0027] 所述反应步骤中，温度为30-60℃，具体为45℃，时间为6-18小时，具体为8小时；

[0028] 所述反应在由pH值为3-5的由N,N-二甲基甲酰胺和冰醋酸组成的混合液中进行；所述pH值具体为3.7。

[0029] 另外，本发明还提供了一种制备上述式I所示化合物中所用的中间体化合物，也即式II所示化合物，

[0030]

[0031] 所述式II中，R为-CH2C17H35或

[0032] 本发明提供的制备上述式II所示化合物的方法，包括如下步骤：

[0033] 将 溶于乙酸乙酯后通入氯化氢气体直至饱和，进行还原反应，反应完毕得到所述式II所示化合物；

[0034] 所述-Boc为叔丁氧羰基。

[0035] 上述方法还原反应步骤中，温度为常温，时间为0.5-3小时，具体为1小时。

[0036] 另外，上述本发明提供的式I所示化合物在制备增强黑色素瘤细胞中MMP-9表达的产品中的应用及在制备抑制黑色素瘤细胞迁移的产品中的应用，也属于本发明的保护范围。

[0037] 本发明以N-甲基氨氧基乙酸作为Linker，首先使Linker的羧基与神经酰胺的伯羟基进行酯缩合生成含有N-甲基氨氧基的神经酰胺衍生物，用不同的寡糖直接与该衍生物的氨氧基(活化的二级胺)缩合并环化得到各种类糖鞘脂。该方法中Linker的巧妙设计与导入可以使无保护基、无活化基的自由寡糖直接反应，从根本上摒弃目前类糖鞘脂合成中繁杂的糖基保护、脱保护、还原端活化等操作，展露出通用性的前景；合成的类糖鞘脂在结构上保留了天然糖鞘脂基本骨架(糖基+神经酰胺)，使其尽可能好地模拟天然糖鞘脂的生物学功能，为后续研究提供保障和支撑。

附图说明

[0038] 图1为式I所示化合物对B16细胞中MMP-9表达的影响。

具体实施方式

[0039] 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。

[0040] 下述实施例中所用起始反应物的制备方法如下：

[0041]

[0042] 化合物6 的合成

[0043] 将2.0g(10.5mmo1) 化合物5(购买自Acros Organics，CAS：42989-85-5，货号：433444)，5.7g(21.0mmo1)十八醇，2.0g(16.8mmol)DMAP(4-二甲氨基吡啶)溶于
150ml干燥的DCM溶剂中并冷却至0℃；再将4.8g(25.1mmol)WSC溶于60ml干燥DCM溶剂中，于
0℃缓慢滴加至上述反应液中，0℃反应2h后转至室温反应5h；反应完毕后减压蒸去DCM溶剂，采用硅胶柱层析V石油醚：V乙酸乙酯＝10：1分离得4.2g白色粉末状固体10，收率90％。

[0044] Mp:55～56℃；1H NMR(CD3OD,300MHz)δ:0.88(3H,J＝6.2Hz,CH3),1.26(s,30H,15×CH2),1.48(s,9H,BocH),1.61～1.68(m,2H,CH2),4.18(t,2H,J＝6.7Hz,COOCH2),4.43(s,13
2H,OCH2CO)；C NMR(CDCl3,100MHz)δ:14.09(CH3),22.67,25.81,28.51,29.19,29.34,
29.47,29.54,29.64,29.67,31.91(16×CH2),28.15,65.36,72.51,82.06[(CH3)3C],156.15(CONHO),169.69(OCH2COO)；ESIMS m/z calcd.for C25H49NNaO5[M+Na]+:466.4,found:
466.4.

[0045] 化合物7的合成

[0046] 将3.0g(6.8mmo1)化合物6溶于25ml干燥的DMF溶剂中，加入308.3mg(8.4mmol)NaH(65％)，室温搅拌20min，再加入505μl CH3I,继续反应6h；反应完毕后减压除去DMF得黄白色固体，用DCM溶解后再用盐水洗涤，无水MgSO4干燥，浓缩，采用硅胶柱层析V石油醚：V乙酸乙酯＝20：1分离得3.0g黄色油状物7，收率97％。Mp:40～41℃；1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:0.88(t,
3H,J＝6.8Hz,CH3),1.30(s,30H,15×CH2),1.49(s,9H,BocH),1.64～1.67(m,2H,CH2),4.16(t,2H,J＝6.8Hz,COOCH2),4.46(s,2H,OCH2CO),3.21(s,3H,NCH3)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ:14.08(CH3),22.66,25.81,28.53,29.19,29.34,29.47,29.54,29.64,29.67,31.90(16×CH2),28.18,38.37(NCH3),65.17,72.01,81.85[(CH3)3C],157.75(CONHO),169.39
(OCH2COO)；ESIMS m/z calcd.for C26H51NNaO5[M+Na]+:480.4,found:480.4.

[0047]

[0048] 化合物8 的合成

[0049] 将100.0mg L-Z-Ser (0.42mmol)和135.7(0.50mmol)十八醇溶于150ml干燥的DCM溶剂中，然后向反应液中通入干燥的氯化氢气体直至饱和，常温搅拌过夜，反应完毕后减压蒸去DCM溶剂，采用硅胶柱层析V石油醚：V乙酸乙酯＝4：1分离得143.8mg白色粉末
1
状固体8，收率70％。H NMR(CDCl3,400MHz)δ:0.87(t,3H,J＝6.6Hz,CH3),1.24(s,30H,15×CH2),1.64(m,2H,CH2),4.16(t,2H,J＝6.8Hz,COOCH2),3.94～3.97(m,2H,HOCH2CH),5.12(s,2H,CH2COONH),5.66(br s,NH),7.35～7.34(m,5H,arom-H),4.42(m,1H,CH),2.14(br s,OH)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ:12.63(CH3),21.20,24.28,26.98,27.72,28.30(16×CH2),
54.73(CH),61.79,64.52,65.62,125.57(arom-C),126.68(arom-C),127.01(arom-C),
127.23(arom-C),134.63(arom-C),154.82(-CONH-),169.15(COOCH2)；ESIMS m/z calcd.for C29H49NNaO5[M+Na]+:514.4,found:514.3.

[0050] 化合物9 的合成

[0051] 将5g化合物8用50ml的干燥DCM和10ml的甲醇溶剂溶解，再加入500mg Pd/C(10％)，于4atm氢化仪内反应，常温搅拌9h，然后用硅藻土抽滤除去Pd/C(10％)，旋干溶剂得白色固体，将此粗产物用DCM滤洗一下就可得到较纯的产物9为白色颗粒状固体3.4g，收率92％。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:0.88(t,3H,J＝6.6Hz,CH3),1.28(s,30H,15×CH2),1.64(m,2H,CH2),4.14(t,2H,J＝6.6Hz,COOCH2),3.60(m,1H,CH),3.60～3.71(m,1H,HOCH2aCH),3.83(m,1H,HOCH2bCH),2.47(br s,3H,OH and NH2)；13CNMR(CDCl3,100MHz)δ:14.25(CH3),
22.82,25.98,28.70,29.66,32.06(16×CH2),55.95(CH),64.13,65.66,173.95(COOCH2)；
ESIMS m/z calcd.for C21H44NO3[M+H]+:358.3,found:358.3.

[0052] 化合物10 的合成

[0053] 将3.6g化合物9(10.1mmol)，4.4g十八酸(15.1mmol)和1.5g HOBT用120ml干燥DCM和20ml甲醇溶解，混合液冷却至0℃；将2.1g WSC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(11.08mmol)溶于30ml干燥DCM并置于恒压滴液漏斗内并滴加入前述0℃的反应液中，0℃反应1h，转至室温反应7h，旋干溶剂，采用硅胶柱层析V石油醚：V乙酸乙酯＝3：1分离得4.5g白色粉末状固体10，收率71％。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:0.88(t,6H,J＝6.8Hz,2×CH3),1.26(s,58H,15×CH2 and 14×CH2),1.62～1.65(m,4H,CH2 and CH2),2.26(t,2H,J＝
7.6Hz,HNCOCH2),3.95(m,2H,HOCH2CH),4.18(t,2H,J＝6.6Hz,COOCH2),4.66(m,1H,CH),
6.42(br d,1H,J＝6.8Hz,NH)；ESIMS m/z calcd.for C39H78NO4[M+H]+:624.6,found:
624.6.

[0054] 化合物12的合成

[0055] 将10.5mmo1化合物10、21.0mmo1化合物11(参考文献K.Niikura,R.Kamitani,M.Kurogochi,R.Uematsu,Y.Shinohara,H.Nakagawa,K.Deguchi,K.Monde,H.Kondo and S.I.Nishimura.Chem.Eur.J.,2005,11,3825-3834制备)，2.0g(16.8mmol)DMAP(4-二甲氨基吡啶)溶于150ml干燥的DCM溶剂中并冷却至0℃；再将4.8g(25.1mmol)WSC溶于60ml干燥DCM溶剂中，于0℃缓慢滴加至上述反应液中，0℃反应2h后转至室温反应5h；反应完毕后减压蒸去DCM溶剂，采用硅胶柱层析V石油醚：V乙酸乙酯＝10：1分离得4.2g白色粉末状固体12，收率90％。化合物12的合成方法与化合物6相同，反应完毕后采用硅胶柱层析V石油醚：V乙酸乙酯＝5：1分离得白色固体，收率91％。1H NMR(CDCl3,400MHzδ:0.88(t,6H,J＝6.8Hz,2×CH3),1.26(s,58H,15×CH2 and 14×CH2),1.49(s,9H,BocH),1.60～1.65(m,4H,CH2 and CH2),2.25(t,2H,J＝7.6Hz,HNCOCH2),3.19(s,3H,NCH3),4.15(t,2H,J＝6.6Hz,COOCH2),4.45(s,2H,OCH2CO),4.47(d,1H,OCH2aCH),4.56(dd,1H,OCH2bCH),4.88(m,1H,CH),6.28(d,1H,NH)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ:14.12(2×CH3),22.70,25.50,25.78,28.46,29.51,31.94(32×CH2),
28.20,36.43,38.51,51.56,64.45,66.26,71.73,82.06,157.74(C＝O),168.91(C＝O),
169.47(C＝O),173.07(C＝O)；HRESIMS m/z calcd for C47H90N2NaO8[M+Na]+:833.65894,found:833.65817.

[0056] 实施例1、制备式II所示化合物(也即化合物1)

[0057] 将3.0g(6.6mmo1)化合物7用100ml干燥的乙酸乙酯溶解澄清后，通入干燥的HCl气体(将浓盐酸滴加至浓硫酸中制得)直至饱和，期间有大量白色固体析出，室温搅拌2h；反应完毕后将白色固体滤出，并用乙酸乙酯洗涤，旋去白色固体中的溶剂最终得2.4g产物1，收率100％。

[0058] 该产物的结构确认数据如下：

[0059] Mp:110～111℃；1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:0.88(t,3H,J＝6.8Hz,CH3),1.30(s,30H,15×CH2),1.66～1.69(m,2H,CH2),4.24(t,2H,J＝6.8Hz,COOCH2),4.88(s,2H,
13
OCH2CO),3.08(s,3H,NCH3)；C NMR(CDCl3,100MHz)δ:14.09(CH3),22.67,25.75,28.39,
29.21,29.34,29.49,29.57,29.64,29.68,31.91(16×CH2),35.98(NCH3),66.40,70.27,
167.82(OCH2COO)；HRESIMS m/z calcd.for C21H44NO3[M+H]+:358.33157,found:
358.33134.

[0060] 由上可知，该产物结构正确，为 其中，R为-CH2C17H35。

[0061] 实施例2、制备式II所示化合物(也即化合物2)

[0062] 将0.77g化合物12溶于乙酸乙酯溶剂中，向溶液中通入干燥的氯化氢气体直至饱和，常温搅拌反应1h，旋干溶剂，得0.65g白色固体粗产物可直接用于下部反应，收率96％。

[0063] 该产物的结构确认数据如下：

[0064] 1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:0.87(m,6H,2×CH3),1.26(s,58H,15×CH2 and 14×CH2),1.42(4H,CH2 and CH2),2.33(m,2H,NCOCH2),3.06(s,3H,NCH3),4.18(2H),4.45(1H),4.71(1H),4.92(3H)；ESIMS m/z calcd for C42H83N2O6[M+H]+:711.6,found 711.6.[0065] 由上可知，该产物结构正确，为 其中，R为

[0066] 实施例3、制备式I所示化合物3a-3e

[0067] 将1.0mmol实施例1所得化合物1与3.0mmol D-(+)-葡萄糖溶于pH值为3.78的由DMF和冰醋酸组成的混合液中，室温搅拌反应8h，反应完毕后除去溶剂，再用甲醇溶解后，采用硅胶薄层层析V乙酸乙酯:V甲醇:V水＝7:2:1分离，得到本发明提供的式I所示化合物3a，产率为91％；

[0068] 该产物的结构确认结果如下所示：

[0069] Mp:151～152℃；1H NMR(CD3OD,400MHz)δ:0.87(t,3H,J＝6.1Hz,CH3),1.26(s,30H,15×CH2),1.62～1.65(m,2H,CH2),4.10(m,2H,COOCH2),4.39(s,2H,OCH2CO),2.78(s,
3H,NCH3),3.85(d,1H,H-1,J1-2＝11.5Hz),3.68(dd,1H,H-6,J5-6＝4.3Hz,J6-6’＝11.7Hz),
3.40～3.28(m,5H,sugar ring-H)；13C NMR(CD3OD,150MHz)δ:12.58(CH3),21.85,25.06,
28.59,28.74,28.88,31.19,31.78,(16×CH2)36.84(NCH3),60.58,61.10,68.72,69.32,
69.67,77.02,77.61,93.31(C-1),170.87(OCH2COO)；HRESIMS m/z calcd for C27H53NNaO8[M+Na]+:542.36634,found:542.36562；for C27H54NO8[M+H]+:520.38439,found:
520.38390.

[0070] 由上可知，该产物结构正确，为目标结构的化合物。

[0071] 按照与上相同的步骤，仅将所用D-(+)-葡萄糖替换为D-(+)-半乳糖、D-乳糖、D-麦芽三糖或GM3三糖，依次得到3b、3c、3d和3e所示化合物，产率依次为80％、95％、90％、83％；

[0072] 各产物的结构确认结果如下：

[0073] 3b(半乳糖鞘氨醇类似物)

[0074] Mp:150～152℃；1H NMR(CD3OD,400MHz)δ:0.87(t,3H,J＝6.1Hz,CH3),1.26(s,30H,15×CH2),1.60～1.65(m,2H,CH2),4.10～4.15(m,2H,COOCH2),4.39(s,2H,OCH2CO),
2.72(s,3H,NCH3),3.85(d,1H,H-1,J1-2＝11.4Hz),3.68(dd,1H,H-6,J5-6＝4.4Hz,J6-6’＝
11.8Hz),3.42～3.28(m,5H,sugar ring-H)；13C NMR(CD3OD,150MHz)δ:12.59(CH3),21.86,
25.07,28.60,28.75,28.90,31.19,31.79(16×CH2),36.84(NCH3),60.59,61.10,68.73,
69.33,69.67,77.03,77.62,93.32(C-1),170.87(OCH2COO)；HRESIMS m/z calcd for C27H53NNaO8[M+Na]+:542.36634,found:542.36553；for C27H54NO8[M+H]+:520.38439,found:
520.38446.

[0075] 3c(乳糖鞘氨醇类似物)

[0076] 1H NMR(CD3OD,400MHz)δ:0.87(t,3H,J＝6.3Hz,CH3),1.26(s,30H,15×CH2),1.48～1.50(m,2H,CH2),2.79(s,3H,NCH3),4.11(d,1H,H-1,J1-2＝8.8Hz),3.40～3.28(m,24H,sugar ring-H and linker–H)；13C NMR(CD3OD,600MHz)δ:12.57(CH3),21.84,25.06,28.58,28.73,28.87,31.18,31.78(16×CH2),37.18(NCH3),59.69,60.64,61.10,68.43,
68.76,69.35,70.57,72.79,75.17,75.22,76.17,78.28,93.21,103.22,170.84(OCH2COO)；
HRESIMS m/z calcd forC33H63NNaO13[M+Na]+:704.41916,found:704.41738.

[0077] 3d(半麦芽三糖糖鞘氨醇类似物)

[0078] 1H NMR(CD3OD,400MHz)δ:0.90(t,3H,J＝6.4Hz,CH3),1.29(s,30H,15×CH2),1.51～1.54(m,2H,CH2),2.49(s,3H,NCH3),4.13(d,1H,H-1,J1-2＝8.8Hz),2.82～5.16(34H,sugar ring-H and linker-H)；13C NMR(CD3OD,150MHz)δ:12.58(CH3),22.32,22.84,25.54,29.05,29.20,29.34,31.65,32.26(16×CH2),37.63(NCH3),60.54,60.64,61.26,
61.60,69.26,69.73,70.17,71.94,72.31,72.76,73.38,73.51,73.59,76.71,77.24,
79.64,80.02,93.82,101.42,101.54,171.32(OCH2COO)；HRESIMS m/z calcd for C39H73NNaO18[M+Na]+:866.47199,found:866.47072；for C39H74NO18[M+H]+:844.49004,found:844.48884.

[0079] 3e(GM3三糖糖鞘氨醇类似物)

[0080] 1H NMR(CD3OD,400MHz)δ:0.89(t,3H,J＝7.2Hz,CH3),1.20～1.40(m,30H,15×CH2),1.60～1.70(m,2H,COOCH2CH2),1.75(t,1H,J＝2.8Hz,H-3aSia),2.02(s,3H,NHAc),2.81(s,3H,NCH3),2.86(dd,1H,J＝2.8Hz,1.2Hz,H-3eSia),4.05(dd,1H,J＝2.8Hz,10.0Hz,H-3Gal),4.13(d,1H,J＝6.8Hz,H-1Glc),4.16(t,1H,J＝6.8Hz,COOCH2CH2),4.41(d,2H,J＝
1.6Hz,NOCH2CO),4.44(d,1H,J＝8.0Hz,H-1Gal)；13C NMR(CD3OD,100MHz)δ:174.09(COO),
173.57(COO),171.04(COO),103.66(C-1Gal),99.69(C-2Sia),93.81(C-1Glc),79.02,76.70,
76.10,75.67,75.58,73.50,71.60,69.88,69.41,69.33,68.66,67.87,67.87,64.85,
63.02,61.30,60.35,59.85,40.70,37.74,34.03,31.65,29.35,29.29,29.24,29.05,
28.97,28.28,25.57,22.32,21.30,13.04；HRESIMS m/z calcd for C44H80N2NaO21[M+Na]+:
995.51458,found:995.51372；for C44H79N2Na2O21[M+2Na-H]+:1017.49652,found:
1017.49706.

[0081] 由上可知，该产物结构正确，为目标结构的化合物。

[0082] 实施例4、制备式I所示化合物4a-4e

[0083] 将1.0mmol实施例2所得化合物2与3.0mmol D-(+)-葡萄糖溶于pH值为3.78的由DMF和冰醋酸组成的混合液中，室温搅拌反应8h，反应完毕后除去溶剂，再用甲醇溶解后，采用硅胶薄层层析V乙酸乙酯:V甲醇:V水＝7:2:1分离，得到本发明提供的式I所示化合物4a，产率为81％；

[0084] 该产物的结构确认结果如下所示：

[0085] 1H NMR(Pyridine-d5,600MHz)δ:0.85(t,6H,J＝7.2Hz,2×CH3),1.56～1.60(m,2H,NHCOCH2CH2),1.78～1.84(m,2H,COOCH2CH2),2.47(t,2H,J＝7.8Hz,NHCOCH2CH2),3.06Glc Glc
(s,3H,NCH3),3.88～3.91(m,1H,H-5 ),4.10(t,1H,J＝9.0Hz,H-2 ),4.37(dd,1H,J＝
4.2,10.8Hz,H-6aGlc),4.51(dd,1H,J＝3.0,11.4Hz,H-6eGlc),4.55(d,1H,J＝16.2,one proton of NOCH2COO),4.64(d,1H,J＝16.2,one proton of NOCH2COO),4.73(d,1H,J＝
9.0Hz,H-1Glc),4.80(d,2H,J＝6.6Hz,NOCH2COOCH2),5.36-5.40(m,1H,CH(COO-)NH-)，9.37(d,1H,J＝7.8Hz,NH).13C NMR(Pyridine-d5,150MHz)δ:173.67(COO),170.93(COO),170.43(COO),95.48(C-1Glc),80.23,79.65,71.86,71.65,70.69,65.80,65.63,64.46,62.83,
52.45,38.65,36.21,32.12,30.79,30.01,29.93,29.84,29.77,28.84,26.13,26.07,
22.94,14.28.HRESIMS m/z calcd for C48H93N2O11[M+H]+:873.67739,found:873.67669；
C48H92N2NaO11[M+Na]+:895.65933,found:895.65949.

[0086] 由上可知，该产物结构正确，为目标结构的化合物。

[0087] 按照与上相同的步骤，仅将所用D-(+)-葡萄糖替换为D-(+)-半乳糖、D-乳糖、D-麦芽三糖或GM3三糖，依次得到4b、4c、4d和4e所示化合物，产率依次为52％、82％、75％、40％；

[0088] 各产物的结构确认结果如下：

[0089] 4b(半乳糖鞘脂类似物):

[0090] 1H NMR(Pyridine-d5,500MHz)δ:0.86(t,6H,J＝7.0Hz,2×CH3),1.55～1.59(m,2H,NHCOCH2CH2),1.78～1.82(m,2H,COOCH2CH2),2.47(t,2H,J＝7.8Hz,NHCOCH2CH2),2.99(s,3H,NCH3),4.01(br.t,1H,J＝6.0Hz,H-5Gal),4.70(d,1H,J＝9.3Hz,H-1Gal),4.80(d,2H,J＝5.0Hz,NOCH2COOCH2),5.34-5.36(m,1H,CH(COO-)NH-),9.32(d,1H,J＝8.0Hz,NH).13C Gal
NMR(Pyridine-d5,125MHz)δ:173.72(COO),171.00(COO),170.47(COO),96.01(C-1 ),
78.51,76.35,70.56,70.17,69.31,65.84,64.48,62.35,52.51,36.26,32.19,30.07,
30.05,29.99,29.89,29.83,29.68,29.57,28.89,26.18,26.13,23.00,14.34.HRESIMS m/z calcd for C48H93N2O11[M+H]+:873.67739,found:873.67998.

[0091] 4c(乳糖糖鞘脂类似物):

[0092] 1H NMR(Pyridine-d5,500MHz)δ:0.85(t,6H,J＝7.0Hz,2×CH3),1.56～1.62(m,2H,NHCOCH2CH2),1.78～1.83(m,2H,COOCH2CH2),2.47(t,2H,J＝7.9Hz,NHCOCH2CH2),2.99(s,3H,NCH3),3.77-3.80(m,1H,H-H-5Glc),4.07(br.t,1H,J＝6.0Hz,H-5Gal),4.53(d,1H,J＝16.6Hz,one proton of NOCH2COO),4.61(d,1H,J＝8.9Hz,H-1Glc),4.66(d,1H,J＝16.5,one proton of NOCH2COO),4.79(d,2H,J＝5.0Hz,NOCH2COOCH2),5.06(d,1H,J＝7.6Hz,H-
1Gal),5.33-5.45(m,1H,CH(COO-)NH-),9.33(d,1H,J＝8.1Hz,NH).13C NMR(Pyridine-d5,
125MHz)δ:173.75(COO),170.91(COO),170.50(COO),105.92(C-1Gal),95.30(C-1Glc),
82.15,78.26,77.74,77.39,75.29,72.53,71.50,71.03,70.94,70.17,65.89,64.52,
62.29,62.17,52.54,36.29,32.23,30.11,30.09,30.03,29.93,29.87,29.84,29.72,
29.61,28.94,26.22,26.17,23.04,14.38.HRESIMS m/z calcd for C54H102NaN2O16[M+Na]+:
1057.71216,found:1057.71486.

[0093] 4d(麦芽三糖糖鞘脂类似物):

[0094] 1H NMR(Pyridine-d5,500MHz)δ:0.86(t,6H,J＝7.0Hz,2×CH3),1.57～1.62(m,2H,NHCOCH2CH2),1.81～1.84(m,2H,COOCH2CH2),2.48(t,2H,J＝7.9Hz,NHCOCH2CH2),2.99(s,3H,NCH3),3.78-3.81(m,1H,H-H-5β-Glc),4.68(d,1H,J＝5.7Hz,H-1β-Glc),4.81(d,2H,J＝5.0Hz,NOCH2COOCH2),5.38-5.42(m,1H,CH(COO-)NH-),5.82(d,1H,J＝3.8Hz,H-1α-Glc),α-Glc 13
5.92(d,1H,J＝3.9Hz,H-1 ),9.39(d,1H,J＝8.0Hz,NH). C NMR(Pyridine-d5,125MHz)δ:173.77(COO),170.97(COO),170.51(COO),103.31(C-1α-Glc),103.08(C-1α-Glc),95.56(C-
1β-Glc),81.66,78.98,78.69,75.54,75.36,75.09,74.61,73.58,72.00,71.44,70.92,
66.90,66.74,64.56,62.78,61.95,52.54,36.32,32.23,30.90,30.11,30.04,29.94,
29.88,29.72,29.62,28.94,26.34,26.24,26.18,23.05,19.50,14.39,13.87.HRESIMS m/z calcd for C60H112NaN2O21[M+Na]+:1219.76498,found:1219.76280.

[0095] 4e(GM3三糖糖鞘脂类似物):

[0096] 1H NMR(Pyridine-d5,500MHz)δ:0.85(t,6H,J＝7.1Hz,2×CH3),1.54～1.63(m,3H,NHCOCH2CH2 and H-3aSia),1.78～1.85(m,2H,COOCH2CH2),1.96(s,3H,Ac),2.47(t,2H,J＝7.8Hz,NHCOCH2CH2),2.98(s,3H,NCH3),4.57(d,1H,J＝8.9Hz,H-1Glc),5.05(d,1H,J＝Gal 13
7.7Hz,H-1 ),5.35-5.38(m,1H,CH(COO-)NH-),9.34-9.46(m,2H,NH). C NMR(Pyridine-d5,125MHz)δ:173.76(COO),173.71(COO),170.08(COO),170.58(COO),170.42(COO),
105.84(C-1Gal),100.75(C-2Sial),95.37(C-1Glc).HRESIMS m/z calcd for C65H118Na2N3O24[M-H+2Na]+:1370.78952,found:1370.78892.

[0097] 由上可知，产物结构正确，为目标结构的化合物。

[0098] 实施例5、活性研究——对B16细胞中MMP-9表达的影响

[0099] 已有的研究表明，神经节苷GM3可显著升高B16细胞(黑色素瘤细胞)中的MMP-9(金属蛋白酶的一种，明胶酶)含量，根据文献，这种升高可抑制B16细胞的迁移。为了研究本课题合成的鞘氨醇类似物以及类糖鞘脂尤其是结构与GM3类似的化合物1e和2e是否具有与GM3类似的功能，按照如下方法检测实施例3所得3a-3e所示化合物和实施例4所得4a-4e所示化合物对B16细胞中MMP-9表达的影响。

[0100] 在培养皿中传代B16细胞至106个细胞，过夜培养至细胞铺满皿底60％时，开始后续实验。吸出原培养液，用无血清培养基清洗皿底两次。将天然神经节苷GM3及类糖鞘脂稀释于1.2ml无血清培养基中至合适的浓度(GM3，3a、3b、3c、3d、4a、4b、4c、4d、4e均为25μM，3e为1μM)，并将1.2ml含药培养基全部加入培养皿中。培养4小时后，向各培养皿中再加入1.2ml无血清培养基，继续培养20小时。吸去培养液，加入1ml Buffer RLT,转移至1.5ml离心管。加入200μl氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置2分钟，4℃12,000rpm离心10分钟，吸取550μl上层水相移到一个新RNase-Free离心管中，加入等体积的70％乙醇，混匀，全部加入到吸附柱(SpinColumn RM)中,12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中,重复该离心过程三次后，收集RNA溶液，-80℃保存，并用RT-PCR测试MMP-9的mRNA相对表达量。

[0101] 结果如图1所示。

[0102] 结果表明，除3a、4b和4d外，其他化合物均可不同程度地升高B16细胞中MMP-9的表达，尤其是3e，在低浓度下仍有较好的升高MMP-9作用。