无定型灯盏乙素乙酯及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了无定型灯盏乙素乙酯及其制备方法和应用。无定型灯盏乙素乙酯，其为无定型形式，在X射线衍射图谱上无明显的X射线衍射峰。无定型灯盏乙素乙酯是通过将灯盏乙素乙酯晶体溶解至有机溶剂中得到饱和溶液，再将饱和溶液冷却析出得析出物，再将析出物干燥得到的。本发明的无定型灯盏乙素乙酯具有溶解度高，稳定性好，生物利用度高等优点，显示出明显的优势和成药性。因此，可以用作制备治疗缺血性脑血管病或病毒性疾病的口服药物的应用。而且其制备方法简单，易操作。

权利要求

1.无定型灯盏乙素乙酯，其特征在于：其为无定型形式，在X射线衍射图谱上如图5所示，无明显的X射线衍射峰；所述无定型灯盏乙素乙酯在水中的溶解度为0.0502mg·mL-1；

30min后水溶液中保留率为99.98％。

2.如权利要求1所述的无定型灯盏乙素乙酯的制备方法，其特征在于：是通过以下步骤实现的：步骤一、将灯盏乙素乙酯晶体和有机溶剂混合，加热至温度为60～90℃，加热溶解，得到灯盏乙素乙酯饱和溶液；

步骤二、将灯盏乙素乙酯饱和溶液冷却，至不高于室温的温度，并在该温度下静置，析出固体沉淀，然后真空抽滤，得到析出物；

步骤三、将析出物干燥，得到无定型灯盏乙素乙酯；

完成无定型灯盏乙素乙酯的制备。

3.根据权利要求2所述的无定型灯盏乙素乙酯的制备方法，其特征在于：步骤二中，将灯盏乙素乙酯饱和溶液冷却至不高于10℃的温度，并在该温度下静置，析出固体沉淀。

4.如权利要求1所述的无定型灯盏乙素乙酯用作制备治疗缺血性脑血管病或病毒性疾病的口服药物的应用。

5.根据权利要求4所述的无定型灯盏乙素乙酯用作制备治疗缺血性脑血管病或病毒性疾病的口服药物的应用，其特征在于：所述口服药物包含活性成分和辅料，所述活性成分包含本发明的无定型灯盏乙素乙酯。

6.根据权利要求5所述的无定型灯盏乙素乙酯用作制备治疗缺血性脑血管病或病毒性疾病的口服药物的应用，其特征在于：所述活性成分中包含质量分数至少为10％的无定型灯盏乙素乙酯和余量的灯盏乙素乙酯晶体。

7.根据权利要求6所述的无定型灯盏乙素乙酯用作制备治疗缺血性脑血管病或病毒性疾病的口服药物的应用，其特征在于：所述活性成分中包含质量分数至少为50％的无定型灯盏乙素乙酯和余量的灯盏乙素乙酯晶体。

8.根据权利要求6所述的无定型灯盏乙素乙酯用作制备治疗缺血性脑血管病或病毒性疾病的口服药物的应用，其特征在于：所述活性成分中包含质量分数至少为95％的无定型灯盏乙素乙酯和余量的灯盏乙素乙酯晶体。

说明书

无定型灯盏乙素乙酯及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及灯盏乙素前药合成技术领域，尤其涉及无定型灯盏乙素乙酯及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 缺血性脑血管病是严重危害人类健康、临床常见且预后不良的一类疾病，中医学属中风病范畴，灯盏花素注射液在临床上治疗该类疾病疗效确切，但作为恢复期用药，注射给药不适合患者长期在家治疗，加上灯盏花乙素严重的不良反应，因此开发适宜的口服制剂更符合药品“三方便”的原则。病毒性疾病在21世纪肆虐，如SARS、手足口、甲流、禽流感、埃博拉等，开发疗效确切的抗病毒制剂具有重要意义。目前上市的灯盏花素(灯盏花素的主要成分为灯盏乙素)及灯盏乙素口服制剂生物利用度极低(Beagle犬中口服给药的绝对生物利用度仅0.4±0.19％)，严重影响了灯盏花素类口服制剂的发展和临床疗效。分析造成灯盏乙素口服生物利用度低的主要原因有：(1)溶解度低：灯盏乙素特有的平面结构决定了它尽管含有较多的亲水性基团(羟基和葡萄糖醛酸基)，仍几乎不溶于水，25℃溶解度为58.57μg·mL-1，37℃时溶解度为211μg·mL-1，属于极微溶范畴；(2)吸收差：其油水分配系数log P仅0.27，透膜能力非常低；(3)稳定性差：温度和pH值能显著影响灯盏乙素水溶液的稳定性，研究也已表明其在小肠培养液(Ringer液)中也不稳定。

[0003] 基于灯盏乙素的上述缺陷，科学家们对以灯盏乙素作为先导化合物进行结构修饰寄予厚望，以期找到生物利用度更高、药理活性更高和疗效更理想的药物。目前对灯盏乙素的结构修饰研究主要集中在对灯盏乙素苷元羟基位的修饰以及葡萄糖醛酸的羧基位修饰。在苷元的修饰中，由于其结构中有3个邻位酚羟基，其稳定性更差，pH高度敏感，不适宜作为药物进行开发。而基于葡萄糖醛酸的羧基位修饰更适宜前药的开发特点，并证明修饰后得到的灯盏乙素酯具有优于灯盏乙素的药理作用。但是目前的灯盏乙素酯的溶解度仍很低，在95％乙醇中的溶解度仅达到3.96mg/mL，水中约10μg/mL，制约了其作为药物治疗疾病的用途。

发明内容

[0004] 针对现有技术的上述缺陷和问题，本发明的目的是提供无定型灯盏乙素乙酯及其制备方法和应用。解决现有晶体型灯盏乙素乙酯的溶解度低，作为药物应用受限的技术问题。

[0005] 为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0006] 无定型灯盏乙素乙酯，其为无定型形式，如图5所示，在X射线衍射图谱上无明显的X射线衍射峰。

[0007] 其结构式为：

[0008] 无定型灯盏乙素乙酯的制备方法，是通过以下步骤实现的：

[0009] 步骤一、将灯盏乙素乙酯晶体和有机溶剂混合，加热溶解，得到灯盏乙素乙酯饱和溶液；

[0010] 步骤二、将灯盏乙素乙酯饱和溶液冷却，析出固体沉淀，然后真空抽滤，得到析出物；

[0011] 步骤三、将析出物干燥，得到无定型灯盏乙素乙酯；

[0012] 完成无定型灯盏乙素乙酯的制备。

[0013] 进一步地，步骤一中，所述加热溶解过程中，加热至温度为60～90℃。优选地，加热至温度为70～90℃。更佳的是，加热至温度为80～85℃。

[0014] 进一步地，步骤一中，所述加热溶解过程中，采用水浴加热。

[0015] 进一步地，步骤一中，在加热溶解过程中，可以采用超声波处理、搅拌或者振荡等手段促进灯盏乙素乙酯晶体的溶解。

[0016] 进一步地，步骤一中，所述有机溶剂选自碳原子数为1-10个的有机溶剂。

[0017] 具体地，所述有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙醇或者正辛醇等。

[0018] 进一步地，所述有机溶剂采用体积浓度为50％-100％的有机溶剂。优选为75％-95％。更佳的是90％-95％。

[0019] 步骤一中，所述有机溶剂与灯盏乙素乙酯晶体的用量不限定，依据灯盏乙素乙酯晶体在具体有机溶剂中溶解度确定即可。

[0020] 进一步地，步骤二中，将灯盏乙素乙酯饱和溶液冷却至不高于室温的温度，并在该温度下静置，析出固体沉淀。

[0021] 进一步地，步骤二中，将灯盏乙素乙酯饱和溶液冷却至不高于10℃的温度，并在该温度下静置，析出固体沉淀。

[0022] 进一步地，步骤二中，所述真空抽滤采用真空减压抽滤。

[0023] 进一步地，步骤三中，所述干燥可以采用常压干燥、真空干燥或冷冻干燥。

[0024] 本发明的无定型灯盏乙素乙酯用作制备治疗缺血性脑血管病或病毒性疾病的口服药物的应用。

[0025] 进一步地，本发明的无定型灯盏乙素乙酯用作制备治疗缺血性脑血管病或病毒性疾病的药物的应用中，所述口服药物包含活性成分和辅料，所述活性成分包含本发明的无定型灯盏乙素乙酯。

[0026] 进一步地，所述活性成分中包含质量分数至少为10％的无定型灯盏乙素乙酯和余量的灯盏乙素乙酯晶体。

[0027] 优选地，所述活性成分中包含质量分数至少为50％的无定型灯盏乙素乙酯和余量的灯盏乙素乙酯晶体。

[0028] 更佳地，所述活性成分中包含质量分数至少为95％的无定型灯盏乙素乙酯和余量的灯盏乙素乙酯晶体。

[0029] 进一步地，所述口服药物的剂型可以为片剂、胶囊剂、滴丸剂、丸剂、缓控释制剂或者口服液制剂。

[0030] 进一步地，所述辅料的选择依据剂型的需要进行常规选择即可。具体地，例如，在制备口服液体制剂(液体药物组合物)时，可以将活性成分溶解或悬浮于适当的液体(例如水)中。在制备口服固体制剂(固体药物组合物)时，可以在向活性成分中加入赋形剂以及视需要的粘合剂、崩解剂、滑润剂、着色剂、矫味剂等后，按照常规方法制成片剂、包衣片剂、颗粒剂、细粒剂、散剂、胶囊剂或丸剂等。作为赋形剂，可使用例如乳糖、玉米淀粉、白糖、葡萄糖、山梨糖醇、结晶纤维素、二氧化硅等；作为粘合剂，可使用例如聚乙烯醇、乙基纤维素、甲基纤维素、阿拉伯胶、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素等；作为滑润剂，可使用例如硬脂酸镁、滑石、二氧化硅等；作为着色剂，可使用允许在医药品中添加的着色剂；作为矫味剂，可使用可可末、薄荷脑、芳香酸、薄荷油、龙脑、桂皮粉等。当然，也可以在上述片剂、颗粒剂上包覆糖衣、明胶衣、以及其它的必要外衣。

[0031] 与灯盏乙素乙酯晶体相比，本发明的无定型灯盏乙素乙酯具有溶解度高，稳定性好，生物利用度高等优点，显示出明显的优势和成药性。而且其制备方法简单，易操作。

[0032] 本发明的无定型灯盏乙素乙酯具有更好的水溶液中的稳定性，在口服给药的情况下，显示出明显高的生物利用度。因此，本发明的无定型灯盏乙素乙酯可以被开发成口服药物组合物，用于治疗缺血性脑血管病或病毒性疾病。

[0033] 本领域技术人员的公知常识认为，药物的无定型形态相对应晶态属于高能态，稳定性较差。而本发明的无定型灯盏乙素乙酯突破了本领域技术人员的公知常识，得到了比晶态更稳定的无定型灯盏乙素乙酯。本发明的无定型态的灯盏乙素乙酯表现出更高的水溶液中的稳定性。因此，无定型形式的灯盏乙素乙酯的高稳定性是本领域技术人员无法依据现有技术预料得到的技术效果。

附图说明

[0034] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0035] 图1是本发明实施例1制备得到的无定型灯盏乙素乙酯的显微外观形貌图；

[0036] 图2是本发明实施例1中采用的灯盏乙素乙酯晶体的显微外观形貌图；

[0037] 图3是本发明实施例1制备得到的无定型灯盏乙素乙酯的扫描电镜显微图；

[0038] 图4是本发明实施例1中采用的灯盏乙素乙酯晶体的扫描电镜显微图；

[0039] 图5是本发明实施例1制备得到的无定型灯盏乙素乙酯的X射线衍射图谱；

[0040] 图6是本发明实施例1中采用的灯盏乙素乙酯晶体的X射线衍射图谱；

[0041] 图7是本发明实施例1制备得到的无定型灯盏乙素乙酯的水溶液HPLC色谱图；

[0042] 图8是本发明实施例1中采用的灯盏乙素乙酯晶体的水溶液HPLC色谱图。

[0043] 图9是本发明实施例3中体内药代动力学的血药浓度经时曲线图，图中，“■”代表实施例1制备得到的无定型灯盏乙素乙酯，“◆”代表灯盏乙素乙酯针晶。

具体实施方式

[0044] 下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0045] 实施例1无定型灯盏乙素乙酯的制备

[0046] 无定型灯盏乙素乙酯，是通过以下步骤完成的：

[0047] 步骤一、取20g灯盏乙素乙酯晶体放入锥形瓶中，然后向锥形瓶中加入4000mL体积浓度为95％乙醇中，将锥形瓶在85℃水浴中加热溶解，并采用振荡手段促进灯盏乙素乙酯晶体的溶解，然后趁热过滤，得到灯盏乙素乙酯饱和溶液；

[0048] 步骤二、将步骤一得到的灯盏乙素乙酯饱和溶液冷却至室温后，然后将灯盏乙素乙酯饱和溶液静置于不高于4℃的温度下冷藏，至有大量固体沉淀析出，然后真空减压抽滤，收集滤饼，得到析出物；

[0049] 步骤三、将步骤二的析出物常压烘干干燥，得到无定型灯盏乙素乙酯。

[0050] 本发明实施例1的步骤一中采用的灯盏乙素乙酯晶体采用现有公知方法制备即可，例如采用中国公开专利CN 101423537 A公开的灯盏乙素乙酯的制备方法制备得到。

[0051] 本发明实施例1的步骤一中采用的有机溶剂不限于乙醇，可以采用其它能够溶解灯盏乙素乙酯晶体的有机溶剂。具体地，例如，甲醇、丙醇或者正辛醇等。也可以选自碳原子数为1-10个的烷醇中的其它适宜的有机溶剂。并且灯盏乙素乙酯晶体和有机溶剂的用量也不限定，以能够制备得到灯盏乙素乙酯饱和溶液的用量即可。

[0052] 本发明实施例1制备得到的无定型灯盏乙素乙酯为粉末状态，其结构式为：

[0053] 其在显微镜下的外观形貌如图1所示。步骤一中采用的灯盏乙素乙酯晶体在显微镜下的外观形貌如图2所示。图1和图2采用的是放大40倍下的外观形貌图。

[0054] 本发明对本实施例1制备的无定型灯盏乙素乙酯和步骤一采用的灯盏乙素乙酯晶体分别进行扫描电镜测试，得到的扫描电镜显微图分别如图3和图4所示。

[0055] 分别对比图1和图2，图3和图4，可见，无定型灯盏乙素乙酯和灯盏乙素乙酯晶体二者的形态完全不同，针晶表面比较光滑，呈典型的针晶状，而无定型灯盏乙素乙酯则呈现疏松、多孔的结构。

[0056] 本发明对本实施例1制备的无定型灯盏乙素乙酯和步骤一采用的灯盏乙素乙酯晶体分别进行X射线衍射图谱测试，得到的X射线衍射图谱分别如图5和图6所示。对比图5和图6可见，本实施例1制备的无定型灯盏乙素乙酯在X射线衍射图谱上无明显的X射线衍射峰，为无定型形式，且制备得到的灯盏乙素乙酯全部为无定型。步骤一采用的灯盏乙素乙酯晶体中有明显的X射线衍射峰。

[0057] 实施例2

[0058] 本实施例2是对实施例1制备得到的无定型灯盏乙素乙酯的溶解度、水溶液稳定性和生物利用度相关性能的测试实施例。

[0059] 1、溶解度测试

[0060] 作为对比，同时测试灯盏乙素乙酯针晶的溶解度。具体操作如下：

[0061] 取灯盏乙素乙酯针晶(DZY-01)和实施例1制备得到的无定型灯盏乙素乙酯粉末(DZY-02)分别溶于甲醇、无水乙醇、95％乙醇、乙酸乙酯、异丙醇、丙酮中，超声1小时，室温静置24小时，制成过饱和溶液。4000r/min离心5min，取上清液适当稀释，用0.45μm针头滤器过滤，HPLC测定浓度，计算溶解度。结果如表2-1所示。

[0062] 表2-1灯盏乙素乙酯针晶和无定型在不同溶剂中的表观溶解度

[0063]

[0064] 注：“—”表示在相应溶剂中未检测测到DZY-01。

[0065] 由表1结果可以看出，无定型态的灯盏乙素乙酯在上述溶剂中溶解度有显著提高，均高于针晶。无定型态的灯盏乙素乙酯在无水乙醇中的溶解度是针晶的9倍以上。

[0066] 2、水溶液中的稳定性

[0067] 作为对比，同时测试灯盏乙素乙酯针晶的水溶液稳定性。具体操作如下：

[0068] 分别将实施例1中制备得到的无定型灯盏乙素乙酯粉末及灯盏乙素乙酯针晶溶于纯净水中，30min后绘制各自水溶液HPLC色谱图，结果分别见图7和图8。对比图7和图8可知，图8中的灯盏乙素乙酯针晶在水溶液中出现明显的降解产物(灯盏乙素)峰，而图7中的无定型态的灯盏乙素乙酯(DZY-02标注的峰)则更为稳定，未出现降解产物峰。通过外标法计算两种晶型灯盏乙素乙酯30min后在水溶液中的含量，并计算其保留率也证明了上述结论。无定型灯盏乙素乙酯30min后水溶液中保留率为99.98％，而灯盏乙素乙酯针晶保留率仅为62.34％，有37.64％的针晶型灯盏乙素乙酯发生降解。

[0069] 保留率计算公式为：

[0070] 保留率＝(30min后灯盏乙素含量-加入量)/加入量×100％

[0071] 3、生物利用度

[0072] 对实施例1中制备得到的无定型灯盏乙素乙酯粉末(DZY-02)及灯盏乙素乙酯针晶(DZY-01)的体内药代动力学比较。

[0073] 将12只雄性Wistar大鼠随机分为无定型组和针晶组，大鼠做颈静脉插管手术后饲养至初体重开始试验，实验前禁食12h，自由饮水。按43.2mg·kg-1剂量分别灌胃给予无定型灯盏乙素乙酯与灯盏乙素乙酯针晶后，于给药后5min，10min，30min，1h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，16h，24h大鼠颈静脉插管处取血，每次抽取0.5mL血(注射器里预置1moL·L-1磷酸二氢钾0.5mL)，轻摇混匀，离心(5000r·min-1，5min)，取上层溶液600μL，加丙酮3mL进行涡旋，涡旋3min，高速离心(12000r·min-1，7min)，取上清液氮气吹干。残渣用甲醇50μL复溶，高速离-1
心(14000r·min ，7min)后，直接取上清液进样，HPLC法测定，根据标准曲线计算各时间点灯盏乙素和灯盏乙素乙酯的血药浓度，绘制血药浓度经时曲线，如图9所示。

[0074] 应用Winnonlin(Version 5.2，Pharsight Corporation，USA)，对数据进行非房室模型拟合，计算药代动力学参数。采用t检验对各药代动力学参数间进行统计分析。结果见表2-2。

[0075] 通过图9，以及表2-2的结果表明：本发明的无定型灯盏乙素乙酯(DZY-02)较灯盏乙素乙酯针晶(DZY-01)的大鼠体内生物利用度更高，且吸收迅速，表现出明显的药动学差异。

[0076] 表2-2 DZY-02组与DZY-01组药代动力学参数

[0077]

[0078] *P>0.05，**0.01≤P<0.05，***P<0.001 vs DZY-01

[0079] 综上，本发明的无定型灯盏乙素乙酯具有更好的溶解度、水溶液稳定性和生物利用度。

[0080] 实施例3

[0081] 本发明的无定型灯盏乙素乙酯具有更好地水溶液中的稳定性，在口服给药的情况下，显示出明显高的生物利用度。因此，本发明的无定型灯盏乙素乙酯可以用作制备治疗缺血性脑血管病或病毒性疾病的口服药物的应用。

[0082] 所述口服药物包含活性成分和辅料，所述活性成分包含本发明的无定型灯盏乙素乙酯。所述辅料的选择依据剂型的需要进行常规选择即可。

[0083] 所述活性成分中，优选为仅采用无定型灯盏乙素乙酯一种活性成分。当然，也可以与其它同类活性成分配合共同作为活性成分。例如，可以采用与灯盏乙素乙酯晶体配合共同作为活性成分。

[0084] 依据实际情况，所述活性成分可以采用包含质量分数至少为10％的无定型灯盏乙素乙酯和余量的灯盏乙素乙酯晶体。优选地，所述活性成分中包含质量分数至少为50％的无定型灯盏乙素乙酯和余量的灯盏乙素乙酯晶体。更佳地，所述活性成分中包含质量分数至少为95％的无定型灯盏乙素乙酯和余量的灯盏乙素乙酯晶体。

[0085] 本发明实施例3中，所述口服药物的剂型可以为片剂、胶囊剂、滴丸剂、丸剂、缓控释制剂或者口服液制剂。所述辅料的选择依据剂型的需要进行常规选择即可。具体地，例如，在制备口服液体制剂(液体药物组合物)时，可以将活性成分溶解或悬浮于适当的液体(例如水)中。在制备口服固体制剂(固体药物组合物)时，可以在向活性成分中加入赋形剂以及视需要的粘合剂、崩解剂、滑润剂、着色剂、矫味剂等后，按照常规方法制成片剂、包衣片剂、颗粒剂、细粒剂、散剂、胶囊剂或丸剂等。作为赋形剂，可使用例如乳糖、玉米淀粉、白糖、葡萄糖、山梨糖醇、结晶纤维素、二氧化硅等；作为粘合剂，可使用例如聚乙烯醇、乙基纤维素、甲基纤维素、阿拉伯胶、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素等；作为滑润剂，可使用例如硬脂酸镁、滑石、二氧化硅等；作为着色剂，可使用允许在医药品中添加的着色剂；作为矫味剂，可使用可可末、薄荷脑、芳香酸、薄荷油、龙脑、桂皮粉等。当然，也可以在上述片剂、颗粒剂上包覆糖衣、明胶衣、以及其它的必要外衣。

[0086] 实施例4无定型灯盏乙素乙酯普通片剂的制备

[0087] 取本发明实施例1的无定形灯盏乙素乙酯20g，乳糖60g，淀粉60g，糊精60g，微粉硅胶2g，硬脂酸镁2g，混合均匀，压片，得无定型灯盏乙素乙酯普通片1000片。

[0088] 实施例5无定形灯盏乙素乙酯缓释微球的制备

[0089] 首先配制含1.5％的海藻酸钠(W/V)、1.5％的淀粉(W/V)、实施例1的无定形灯盏乙素乙酯10g，混合水溶液200mL，加入500mL液体石蜡作为油相，30mL的司盘-80和吐温-80的混合液(5：1)作为乳化剂，搅拌，形成乳液A。

[0090] 同样，配制100mL 8％的CaCl2溶液，加入200mL液体石蜡，10mL乳化剂(司盘-80：吐温-80＝5：1)及适量乙醇，搅拌，形成乳液B。

[0091] 待二者均形成稳定的乳液后，将乳液B加入乳液A进行交联反应15min，离心得灯盏乙素乙酯微球，依次用乙酸乙酯、无水乙醇、去离子水洗涤，室温放置干燥。得灯盏乙素乙酯缓释微球，可用于制备片剂或胶囊等药剂学可接受的其他制剂形式。

[0092] 实施例6不同晶型灯盏乙素乙酯预防给药对大鼠局灶性脑缺血的影响

[0093] 目的：采用大鼠局灶性脑缺血模型(线栓法脑梗塞动物模型：MCAO法)，观察不同晶型灯盏乙素乙酯预防给药对脑缺血的影响。

[0094] 实验动物：SD大鼠，雄性，250～270g。购自中国食品药品检定研究院，许可证：SCXK(京)2009-0017。

[0095] 材料：

[0096] 受试药：实施例1的无定型灯盏乙素乙酯药液(以下简计为DZY-02)和实施例1的步骤一中采用的灯盏乙素乙酯针晶晶体药液(以下简计为DZY-01)。药液配制方法：分别称取等量的DZY-01及DZY-02，与MCT研磨均匀后，加入一定量阿拉伯胶，研磨均匀，再加一定量水，研磨，乳化成初乳后加水稀释至所需药物浓度。

[0097] 染色剂：红四氮唑(TTC)：Amresco试剂公司(美国)，PBS溶液新鲜配制。

[0098] MCAO栓线：北京沙东生物技术有限公司，编号2432-A3-100。

[0099] 试剂盒：总超氧化物歧化酶(SOD)测试盒，批号20131228；丙二醛(MDA)测试盒，批号20131230；一氧化氮(NO)测试盒，批号20140318；均购自南京建成生物工程研究所。

[0100] 实验方法：

[0101] 剂量设置：各受试药设置给药剂量为：100，50，25mg/kg。

[0102] 分组与给药：

[0103] 实验分为9组：(1)正常对照组；(2)假手术组；(3)模型组；(4)-(6)针晶大、中、小剂量组，分别为100，50，25mg/kg；(7)-(9)组为无定型大、中、小剂量组，分别为100，50，25mg/kg。每组16只，每日给药1次，连续12天。

[0104] 给药途径：口服灌胃给药，1mL/100g。动物术后6h再给药1次。

[0105] 线栓法脑梗塞动物模型(MCAO法)：

[0106] 大鼠用350mg/kg的水合氯醛腹腔注射麻醉。在颈部正中切口约2cm，在一侧的肩胛舌骨和胸锁乳突肌形成的三角处暴露颈总动脉(CCA)及其分支颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)。结扎ECA及其分支枕动脉、甲状腺上动脉及ECA终末支，分离ICA的分支翼突腭动脉。夹闭CCA、ICA及翼突腭动脉，将前端烧成0.3mm小球的尼龙线自ECA切口插入，导入至ICA，松开ICA，继续插入尼龙线至其颅内段，当感到有明显阻力时，此时插入尼龙线距CCA分叉处约
2cm，即可阻断大脑中动脉(MCA)。结扎ECA切口和尼龙线，松开夹闭血管的血管夹。假手术动物插线入1cm，其余处理同模型。

[0107] 行为学评分：按Longa评分的5级4分法进行评分。

[0108] 0分：无明显神经功能缺损症状；1分：神经功能轻微缺损，不能完全伸展对侧前爪；2分：局灶性神经功能中度缺损，向对侧旋转；3分：局灶性神经功能重度缺损，行走时向对侧倾倒；4分：不能自行行走及昏迷。分别在缺血6h和24h进行行为学评分。

[0109] 脑组织染色：术后24h，处死动物取脑，将梗塞部位切2mm厚片，放入已配好的5ml染液瓶中，立即放入37℃水浴，20-30min后取出染液瓶，弃染液，在原瓶内放入5ml的10％甲醛，固定24h。

[0110] 观察指标：

[0111] 脑梗死体积：脑切片染色，照相或扫描，计算梗死体积和梗死率。

[0112] 梗死率％＝梗死体积/全脑体积×100％

[0113] 计算脑重指数：脑重指数＝脑重/体重×100％

[0114] 统计方法：应用SPSS19.0统计软件，所有实验数据用 表示，组间比较采用单因素方差分析。

[0115] 实验结果：

[0116] 1.对大鼠脑重指数的影响

[0117] 由表6-1可见，模型组脑重指数与假手术和对照组相比明显升高，统计学结果显示有非常显著性差异(P＜0.05，P＜0.001)；各给药组与模型组比较，虽有不同程度降低，但没有统计学意义。体重恢复方面，大剂量恢复较好，与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)。

[0118] 表6-1不同晶型灯盏乙素乙酯对脑梗大鼠体重及脑重指数的影响

[0119]

[0120] 注：各组与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，下表同。

[0121] 2.对大鼠行为学评分的影响

[0122] 由表6-2可见，在缺血后6小时和24小时，模型组大鼠行为学评分显著升高，与假手术组及空白对照组具有显著性差异，表明本研究所制备模型成功，可用于观察灯盏花素抗脑缺血药效学研究.缺血后6小时，无定型组在25mg/kg，50mg/kg和100mg/kg剂量时，均与模型组具有显著性差异，而针晶组未见差异；缺血24小时后对大鼠行为学进行再次评价，结果显示，与模型组相比，针晶组在100mg/kg时可显著降低大鼠行为学评分。与模型组及针晶组相比，无定型组在25mg/kg，50mg/kg和100mg/kg时均可显著降低大鼠行为学评分。上述研究提示，针晶组(DZY-01)和无定型(DZY-02)组均可改善脑缺引发的行为学障碍，其中无定型组疗效显著由于针晶组。

[0123] 表6-2 DZY对脑梗大鼠行为学评分的影响

[0124]

[0125] 3.对大鼠脑梗死体积的影响

[0126] 由表6-3可见，对照组、假手术组无梗死部分，梗死率为0；模型组梗死率为32.79±9.37％，与空白组及假手术组相比具有显著差异，说明本研究所制备的MCAO模型可用于DZY-02的药效学评价。与模型组相比，针晶组(DZY-01)和无定型组(DZY-02)各剂量组大鼠梗死率均显著下降，其中无定型组梗死率体积显著低于针晶组，提示无定型DZY-02在改善脑梗死率方面优于针晶组DZY-01，均出现显著性差异(P＜0.05)，尤以无定型大剂量组的梗死率下降明显(P＜0.01)。

[0127] 表6-3DZY对脑梗大鼠脑梗体积及梗死率的影响

[0128]

[0129] 4.对大鼠SOD，MDA及NO含量的影响

[0130] 由表6-4可见，对MDA含量的影响，模型组分别与对照组和假手术组比较，含量明显升高(P＜0.001)，各给药组与模型组比较，尼莫地平、灯盏花素及小剂量组的含量降低明显，有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)；对SOD，NO的影响，各组与模型组相比均未见显著性差异。

[0131] 表6-4 DZY对脑梗大鼠SOD，MDA及NO含量的影响

[0132]

[0133]

[0134] 综合以上指标，受试药DZY可显著改善缺血造成的脑损伤，主要表现在：1、显著改善脑缺血造成的大鼠行为学障碍，其中无定型组显著优于针晶组；2、显著降低脑梗死体积，无定型组显著优于针晶组。3、显著改善脑内氧化应激状态，降低脑内脂质过氧化水平。结果提示，DZY对大鼠局灶性脑缺血损伤具有一定的保护作用，无定型组显著优于针晶组。但是，在本研究中未观察到DZY对脑重系数的影响，原因可能是因为缺血后脑水肿高峰期发生于缺血后48-72小时，本研究所观察指标均为缺血后24小时，未达到水肿高峰期所致。

[0135] 实施例7不同晶型灯盏乙素乙酯的抗病毒作用

[0136] 阳性对照药：病毒唑，湖北湖滨制药厂生产，为原料药。

[0137] 动物：昆明种小鼠，雌雄兼用。体重用14±1g。

[0138] 病毒：流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM1),购自中国预防医学科学院病毒研究所，由中药研究所传代，-70℃保存备用。

[0139] 实验方法：小鼠按体重随机分组，采用无定型灯盏乙素乙酯(DZY-02)和灯盏乙素乙酯针晶晶体(DZY-01)的药液，分别为给药高、低剂量组；病毒唑对照组；病毒感染对照组及正常对照组。除正常对照组外，将小鼠用乙醚轻度麻醉，以15个LD50流感病毒液滴鼻感染，每只0.05mL。感染后开始灌胃给药，每天1次，每只0.5mL，连续3天，对照组在同等条件下蒸馏水灌胃。第4天称取小鼠体重后解剖，摘取全肺称重，计算肺指数值，并求出肺指数抑制率。

[0140] 肺指数＝[肺重(g)/体重(g)]×100

[0141] 肺指数抑制率＝(病毒对照组均值-试验组均值)/病毒对照组均值×100％[0142] 结果采用组间t检验进行统计学处理。

[0143] 表7-1 DZY对小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用

[0144]

[0145] 与正常对照组比较：##P＜0.01；与病毒对照组比较：*P＜0.05。

[0146] 结果显示：对小鼠流感病毒性肺炎，给药治疗3天，DZY 2个剂量组的肺指数明显小于病毒对照组，P＜0.05，DZY-02优于DZY-01。

[0147] 本发明的无定型灯盏乙素乙酯的制备方法不仅适用于制备无定型灯盏乙素乙酯，也适用于其他类无定型灯盏乙素酯类的制备。

[0148] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。