一种新型低密度脂蛋白胆固醇电化学免疫传感器的制备及应用

摘要

本发明属于实验用仪器技术领域，具体涉及一种新型低密度脂蛋白胆固醇LDL‑C免疫传感器的制备及应用。利用喷墨打印技术在氧化铟锡玻璃ITO上打印聚二甲基硅氧烷PDMS，制备检测区。以ITO玻璃为工作电极，层层修饰包括抗体LDL‑C、进行酶促反应的酶及电子传递介质。以铂丝电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，以电化学工作站作为信号输出设备。本发明同时检测LDL‑C和总胆固醇浓度；微通道检测区域的制备，简化了实验操作，大大降低了检测样品用量；电极上采用的修饰液均为绿色无毒环保材料，价格低廉。

权利要求

1.一种新型低密度脂蛋白胆固醇LDL-C电化学免疫传感器的制备，其特征是利用喷墨打印机将羧基化的聚二甲基硅氧烷PDMS打印在表面修饰氨基的氧化铟锡ITO玻璃上，制成包含一个总进样区和两个检测区的检测体系，所述两个检测区分别为检测区1和检测区2；

所述PDMS和所述ITO玻璃通过表面的化学键结合作用固定成型；首先在检测区1内用喷墨打印机打印金纳米颗粒-低密度脂蛋白抗体AuNPs-AbLDL的混合液，用于捕捉LDL-C；然后，在检测区2和经喷墨打印机打印过的检测区1上采用层层修饰的方法，分别依次打印修饰液：羧甲基纤维素钠CMC，联吡啶钌Ru(bpy)32+，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+，胆固醇脱氢酶CDH，胆固醇酯酶ChEr溶液，修饰到ITO玻璃上；以修饰过的ITO玻璃为工作电极，铂丝为对电极，银/氯化银电极为参比电极，构成检测探针，以电化学工作站作为信号输出设备。

2.根据权利要求1中所述低密度脂蛋白胆固醇LDL-C电化学免疫传感器的制备，其特征在于利用喷墨打印机将羧基化的PDMS打印在表面修饰氨基的ITO玻璃上，制成有一个总进样区和两个检测区的检测体系；PDMS和ITO玻璃通过表面的化学键结合作用，烘干并固定成型。

3.根据权利要求1中所述低密度脂蛋白胆固醇LDL-C电化学免疫传感器的制备，其特征在于其中检测区1内首先用喷墨打印机打印一定浓度的AuNPs-AbLDL混合液；检测区1和检测区2随后以层层修饰的方法，分别依次打印修饰液：CMC，Ru(bpy)32+，NAD+，CDH，ChEr溶液；以修饰过的ITO玻璃为工作电极，铂丝为对电极，银/氯化银电极为参比电极，构成检测探针，以电化学工作站作为信号输出设备。

4.一种根据权利要求1-3任一项所述制备方法制备的低密度脂蛋白胆固醇LDL-C电化学免疫传感器的应用，其特征在于测定时底液用量为30-60μL，线性范围为5-300mg/dL。

说明书

一种新型低密度脂蛋白胆固醇电化学免疫传感器的制备及

应用

技术领域

[0001] 本发明属于实验用仪器技术领域，具体涉及一种低密度脂蛋白胆固醇电化学检测免疫传感器的制备及应用。技术背景

[0002] 电化学免疫传感器能够直接获取复杂体系组成信息，具有高度选择性，传递速度快，易微型化，能在浑浊的溶液中操作等许多优势，是一种理想的分析工具。近年来，随着对抗体和纳米材料研究的不断深入，电化学免疫传感器在生化传感器研发及其商业化领域的重要性逐渐凸显，可广泛应用于临床检测、食品安全、环境监测、医疗卫生等领域。

[0003] 心脑血管疾病的高发病率、高致残率、高死亡率使之成为全球重要的卫生健康和社会问题，动脉粥样硬化是这类疾病发病的重要原因之一。低密度脂蛋白LDL的沉积与动脉粥样硬化的发生和发展关系密切，然而，相对于血糖含量测定而言，利用电化学技术测定胆固醇含量，特别是低密度脂蛋白胆固醇的定量检测极少，因此，微型化胆固醇速测仪的研究技术亟待提高与完善。

[0004] 低密度脂蛋白胆固醇LDL-C电化学检测免疫传感器，是把特异性识别LDL的抗体修饰在具有吸电子性质的纳米颗粒表面以捕获LDL。与LDL连接的胆固醇和识别胆固醇的分子/酶反应，经电子传递介质的运输，所产生的电子被纳米颗粒收集、放大，最终得到易于检测的电信号的器件。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种微型、绿色环保的低密度脂蛋白胆固醇电化学免疫传感器的制备方法及应用。

[0006] 本发明利用喷墨打印技术制备分离样品的微通道，同时检测LDL-C和总胆固醇TC浓度；将检测区与工作电极构建在一起，简化了实验操作过程，大大降低了检测样品用量。

[0007] 本发明的目的是这样实现的：利用喷墨打印机将羧基化的聚二甲基硅氧烷PDMS打印在表面修饰氨基的2cm*4cm长方形氧化铟锡玻璃ITO上，制成进样区直径70-95mm，检测区直径40mm-65mm，样品通道宽3-7mm，高3-6mm的图形。其中包含一个总进样区和两个检测区，通过化学键结合，烘干固定成型。

[0008] ITO玻璃上PDMS内的检测区1：修饰有金纳米颗粒-抗体AuNPs-Ab，其中，抗体种类为，仅结合LDL的AbLDL；

[0009] 检测区域1和2，均以修饰的ITO为工作电极，其中ITO为2cm*4cm长方形，修饰液为羧甲基纤维素钠CMC，联吡啶钌Ru(bpy)32+，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+，胆固醇脱氢酶CDH，胆固醇酯酶ChEr溶液，采用层层修饰的方法，修饰到ITO电极上。铂丝为对电极，银/氯化银电极为参比电极，构成检测探针，以电化学工作站作为信号输出设备。

[0010] 该低密度脂蛋白胆固醇免疫传感器修饰液配比为①5-10层，共3-9μL，浓度为0.5-2mg/mL的金纳米颗粒-低密度脂蛋白抗体AuNPs-AbLDL混合液②1-1.5mg的CMC与5μL的Ru(bpy)32+，2-5μL的NAD+溶于110μL缓冲溶液；③浓度5mg/mL用量1-7μL的CDH④1-10μL浓度
5mg/mL的ChEr。测定时，底液用量为30-60μL。

[0011] 具体地说，本发明：

[0012] 1.设计检测通道的图案，如图1所示。

[0013] 2.将ITO放入水/过氧化氢/氨水混合溶液中，体积比为3∶1∶1-7∶1∶1，加热至60-85℃，1-2.5小时。用水充分清洗后，浸泡在3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES中8-15小时以上，ITO玻璃表面被氨基修饰，以下简称ITO玻璃。

[0014] 3.将甲苯与羧基化的PDMS，以下简称PDMS的混合液以质量比4∶1-7∶1混合，注入喷墨打印机的墨盒中。利用喷墨打印机将图案打印在ITO玻璃上，并将PDMS在50℃下烘干2小时，固化成型，冷却后得到电化学检测通道。制得的透明状PDMS胶片通道宽3-7mm，高3-6mm，进样区直径70-95mm，检测区的直径为40-65mm。

[0015] 4.AuNPs-AbLDL混合液制备：

[0016] 4.1.取10μL表面有羧基的AuNPs 0.5mg，用0.01-0.1M pH5.0-6.0的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液即MES buffer洗涤3-5遍，离心并弃去上清液。再向离心管中加入含有新鲜配制的，体积比为1∶2-3∶7的1μmoL 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液即EDC溶液和2u moLN-羟基琥珀酰亚胺溶液即NHS溶液的MES buffer。用超声混匀仪分散样品10-15秒，超声2秒停1秒，超声功率50W，操作频率：30KHz，在室温下旋转活化AuNPs表面的羧基3-30分钟，用MES buffer洗涤AuNPs 2-5遍。

[0017] 4.2.用250u L的0.02M硼酸-吐温作为缓冲液即BST buffer洗涤AuNPs；洗涤完成后，加入适量的单克隆抗体AbLDL，再加入BST buffer；振荡混匀，使AuNPs表面活化的羧基与抗体的氨基在室温下旋转反应2.5-6小时，用冷冻离心机分离，收集底液；

[0018] 4.3.在分离后的沉淀中加入质量为3％-10％乙醇胺的BST缓冲液，旋转封闭30-180分钟，再用冷冻离心机分离弃上清后，加入酪蛋白封闭液，室温下旋转反应60-90分钟。

[0019] 4.4.用BST buffer洗涤封闭完成的AuNPs-AbLDL混合液2-5次，保存于含酪蛋白和叠氮钠的BST缓冲液的免疫微球保存液中备用。

[0020] 5.两个检测区均采用层层修饰方法完成对ITO玻璃的修饰。

[0021] 检测区域1：首先用喷墨打印机将1mg/mL的AuNPs-AbLDL混合液打印5-10层，共3-9μL，晾干。含羧基的AuNPs与表面有氨基修饰的ITO通过化学键结合并被固定。然后依次打印CMC与[Ru(bpy)32+]混合液、浓度5mg/mL的CDH共1-7μL、浓度为5mg/mL用量1-10μL的ChEr，分别晾干。

[0022] 检测区域2：用喷墨打印机依次打印CMC与[Ru(bpy)32+]混合液、浓度5mg/mL的CDH共1-7μL、浓度为5mg/mL用量1-10μL的ChEr，分别晾干。

[0023] 检测时，两个检测区分别以铂丝电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，构成检测探针，以电化学工作站作为信号输出设备。

[0024] 6.测定时，底液用量为30-60μL，利用电化学工作站测定样品循环伏安图，利用标准曲线法进行定量。

[0025] 本发明传感器用于胆固醇检测的步骤如下：

[0026] 1.将一定浓度的胆固醇溶液作为底液，用微量进样器取30-60μL，注入到进样区。

[0027] 2.以修饰过的ITO电极为工作电极，铂丝电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极。用电极夹夹住工作电极，将铂丝电极，银/氯化银电极插入检测区，接入CHI电化学工作站，测定样品循环伏安图。

[0028] 3.测定不同浓度LDL和TC标准溶液的循环伏安图，分别建立标准曲线，从曲线上计算得样品的LDL和TC浓度。从而利用该生物传感器检测胆固醇。

[0029] 本发明的优点和积极效果在于：

[0030] 1.利用喷墨打印技术制备分离样品的微通道，同时检测LDL-C和TC浓度；

[0031] 2.将检测区与工作电极构建在一起，简化了实验操作过程，利于今后产业化生产；

[0032] 3.测定时底液需要量较低，适用于床旁快速检测；

[0033] 4.所用修饰液采用绿色环保材料，价格低廉。

附图说明

[0034] 图1是本发明传感器的结构示意图

[0035]

[0036] 1-进样区；2-检测区1；3-检测区2；4-铂丝电极；5-银/氯化银电极；6-ITO玻璃。

[0037] 图2是检测区1内检测LDL-C原理示意图

[0038]

[0039] 1-ITO玻璃；2-AuNPs-AbLDL；3--LDL-C，ChEr，NAD+；4--CDH；5-胆固醇；6-胆烷-4-+ 2+烯-3-酮，NADH+H；7-Ru(bpy)3 ；8-电子。

[0040] 图3是根据不同浓度LDL-C和TC标准溶液的循环伏安检测方法，建立的标准曲线图。■-TC样品，▲--LDL-C样品。(补正内容)

具体实施方式

[0041] 下面结合附图和实施例进一步说明本发明，但对本发明不构成限制。

[0042] 实施例1

[0043] 本实施例装置结构示意图如附图1所示，主要包括银/氯化银电极；铂丝电极；修饰过的ITO电极构成的测量系统；PDMS与工作电极组装成的样品通道-检测区体系以及电化学工作站的信号输出系统。

[0044] 在修饰了氨基的2cm*4cm长方形ITO玻璃上，利用喷墨打印机打印含有羧基的PDMS，在50℃下烘干2-4小时固化成型，PDMS通道宽3-7mm，高3-6mm，进样区直径70-95mm，检测区直径40mm-65mm。制得集样品池与检测于一体的测定装置。以修饰的ITO玻璃为工作电极，检测区1首先通过喷墨打印机打印5-10层仅结合LDL的AuNPs-AbLDL混合液。然后两个检测区分别打印修饰液：CMC，[Ru(bpy)32+]，NAD+，CDH，ChEr溶液。利用层层修饰的方法，将所有修饰液修饰到ITO电极上。铂丝电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，构成检测探针，以电化学工作站作为信号输出设备。测定时底液用量为30-60μL。

[0045] 本发明装置是这样来检测的：如图1所示，将一定浓度的胆固醇溶液作为底液，用微量进样器取40μL，注入到1中。以修饰的ITO为工作电极，4为对电极，5为参比电极。用电极夹夹住ITO玻璃，将4，5插入样品池2或3中，分别接入电化学工作站，测定样品循环伏安图。同样装置下，测定不同浓度LDL-C和TC标准溶液的循环伏安图，建立标准曲线，从曲线上计算得样品的LDL-C和TC浓度。从而利用该生物传感器分别检测LDL-C含量和TC含量，如图3，RTC＝0.9956，RLDL-C＝0.9948。

[0046]

[0047] 实施例2

[0048] 本实施例装置结构示意图如附图1所示，主要包括银/氯化银电极；铂丝电极；修饰过的ITO电极构成的测量系统；PDMS与工作电极组装成的样品池以及电化学工作站的信号输出系统。

[0049] 利用离心系统，分离出高低密度胆固醇，仅加样LDL-C样品。按实例一同样步骤测定，可分别测定并计算LDL-C含量及游离胆固醇酯/甘油三酯含量。