一种枸杞中甜菜碱的测定方法

摘要

本发明公开了一种枸杞中甜菜碱的测定方法。该方法包括以下步骤：（1）以水提取溶剂对枸杞样品进行萃取，经过滤得到的滤液作为待测液；（2）采用离子色谱结合脉冲安培检测器进行样品中甜菜碱的分析测定。本发明建立了离子色谱结合脉冲安培检测器测定枸杞中甜菜碱的方法。本方法线性良好，回收率为90.8～94.7%，精密度1.11%，检测限0.0366μg/ml。本方法不使用有毒试剂，经试验验证，可适用于各种植食性、功能性食品中甜菜碱的快速、批量检测。

权利要求

1.一种枸杞中甜菜碱的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以水提取溶剂对枸杞样品进行萃取，经过滤得到的滤液作为待测液；

（2）采用离子色谱结合脉冲安培检测器进行样品中甜菜碱的分析测定，所述步骤（2）使用阴离子交换树脂为填料的色谱柱、以甲基磺酸(MSA)作为流动相对枸杞中的甜菜碱进行离子色谱分析测定；所述色谱柱为Ion Pac CS19。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤（1）中取粉碎的枸杞样品，精密称取，加水使溶解并定容，超声处理，离心取上清液过滤后，过预活化处理RP柱，弃去最初滤液，取续滤液作为待测液。

3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述步骤（1）中所述枸杞样品包括固体样品或液体样品。

4.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述步骤（1）中所述超声处理的时间为20~30 min。

5.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述步骤（1）中所述最初滤液为前1~3 mL。

6.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述步骤（1）中所述过滤孔径为0.22μm。

7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述离子色谱仪使用的色谱柱为Ion Pac CS19 4×250mm；色谱分析条件为：Ion Pac CS19色谱柱、Ion Pac CG19预柱；进样量10 μL；流速为1.0 mL/min，停泵时间为10 min；柱温30 ℃，流动相为5 mM甲基磺酸(MSA)。

8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述离子色谱仪为ICS-3000型离子色谱仪，包含四元梯度泵，ED 3000电化学检测器，Au工作电极，pH/Ag/AgCl复合参比电极，Ti对电极。

说明书

一种枸杞中甜菜碱的测定方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种测定枸杞中甜菜碱的分析方法，属于检测分析技术领域。

背景技术

[0002] 枸杞(medlar)为茄科、属多年生落叶灌木的干燥果实，是药食同源的产品，具有滋补肝肾、明目的功效。现代药理学研究一般认为枸杞的活性成分、微量元素等有药理效果。枸杞的活性成分主要有3类，甜菜碱为其中之一。甜菜碱是一类季胺盐化合物，分子式C5H11NO2,结构式(CH3)3N+-CH2-COO-，相对分子量117.15。是枸杞果、柄，叶中主要的生物碱之一，它在植物体内起甲基供应体的作用。目前对甜菜碱含量测定方法的研究日益增多，主要有滴定法、比色法、高效液相色谱法等。这些方法各有其特点，滴定法成本低，但受样品中色素成分的干扰，测定终点不易判断；比色法测定过程复杂，且洗脱溶剂为乙醚，其毒性大，环境污染严重，不利于日常检测分析。在高效液相色谱法测定甜菜碱过程中，不可避免的采用离子对试剂和专用柱，采用离子对试剂时，缓冲盐容易析出造成液相系统堵塞，缩短色谱柱使用寿命；采用专用柱(阳离子交换柱SCX或氨柱NH2)分析，前处理操作较繁琐。而离子色谱法成为较适宜的选择，目前涉及甜菜碱测定的国家标准GB/T 21515-2008《饲料添加剂天然甜菜碱》和GB/T 23710-2009《饲料中甜菜碱的测定》。这两个标准均采用离子色谱法，但并不适用于高含糖量样品中甜菜碱的测定，且测定过程存在钠离子的干扰，严重影响定量分析结果。此外，其他涉及甜菜碱测定的标准，操作复杂，检测限高，如NY/T1746-2009《甜菜中甜菜碱的测定》检测限为400mg/kg，远不能满足实际样品检测需求。

发明内容

[0003] 针对现有技术中的不足，本发明提供一种新的检测方法。本发明利用离子色谱仪-脉冲安培检测器所具有的优势准确测定了枸杞中甜菜碱含量，该方法操作简便，无需衍生和复杂样品前处理即可快速检测植食性样品中甜菜碱的含量，且灵敏度高，通常可检测到mg/L数量级。

[0004] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

[0005] 一种枸杞中甜菜碱的测定方法，包括以下步骤：

[0006] (1)以水提取溶剂对枸杞样品进行萃取，经过滤得到的滤液作为待测液；

[0007] (2)采用离子色谱结合脉冲安培检测器进行样品中甜菜碱的分析测定。

[0008] 优选的，所述步骤(1)中取粉碎的枸杞样品，精密称取，加水使溶解并定容，超声处理，离心取上清液过滤后，过预活化处理RP柱，弃去最初滤液，取续滤液作为待测液。

[0009] 优选的，所述步骤(1)中所述枸杞样品包括固体样品或液体样品。

[0010] 优选的，所述步骤(1)中所述超声处理的时间为20～30min。

[0011] 优选的，所述步骤(1)中所述最初滤液为前1～3mL。

[0012] 优选的，所述步骤(1)中所述过滤孔径为0.22μm。

[0013] 优选的，所述步骤(2)使用阴离子交换树脂为填料的色谱柱、以MSA作为流动相对枸杞中的甜菜碱进行离子色谱分析测定。

[0014] 优选的，所述离子色谱仪使用的色谱柱为Ion Pac CS19(4×250mm)；色谱分析条件为：Ion Pac CS19色谱柱、Ion Pac CG19预柱；进样量10μL；流速为1.0mL/min，停泵时间为10min；柱温30℃，流动相为5mM甲基磺酸(MSA)。

[0015] 优选的，所述离子色谱仪为ICS-3000型离子色谱仪，包含四元梯度泵，ED 3000电化学检测器，Au工作电极，pH/Ag/AgCl复合参比电极，Ti对电极。

[0016] 本发明的有益效果是：

[0017] 本发明使用结合有脉冲安培检测器的离子色谱方法测定枸杞中甜菜碱，本发明方法的检测限0.0366mg/L，与现有技术相比，检测限更低。

[0018] 本发明以水为提取溶剂对枸杞样品进行萃取，以过滤得到的滤液作为待测样品，以阴离子交换树脂为填料的色谱柱，同时以MSA作为流动相对枸杞中的甜菜碱进行分析。从而避免了有毒有害有机溶剂的使用，只使用价格低的纯水作为提取溶剂，MSA作为流动相就可以实现对枸杞中的甜菜碱快速、简单、准确、高灵敏测定。本发明具有操作简便、灵敏度高、检测限低、重现性好，且可快速准确获得实验结果，充分满足了对各种功能性食品中甜菜碱的检测，并可应用于大量实际样品的批量检测分析。

[0019] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

[0020] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

[0021] 图1甜菜碱标准物质色谱图(150mg/L)；

[0022] 图2枸杞样品色谱图。

具体实施方式

[0023] 下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

[0024] 本发明实施例中使用的仪器和试剂如下：

[0025] 仪器与试剂

[0026] 仪器：ICS-3000型离子色谱仪(美国Dionex公司)，包含四元梯度泵，ED 3000电化学检测器，Au工作电极，pH/Ag/AgCl复合参比电极，Ti对电极；Chromeleon 680色谱工作站；AS自动进样器；On Guard II RP固相萃取柱(美国Dionex公司)；0.22μm微孔尼龙膜(天津富集公司)；明澈D24UV超纯水机(美国Millipore公司)。

[0027] 试剂：甜菜碱( ≥99.7％，Sigma公司)，本实施例中实验用水均为超纯水，由明澈D24UV超纯水机制备。甲基磺酸MSA(国药集团)。

[0028] 实施例1离子色谱分析色谱条件的选择

[0029] (1)色谱柱的选择

[0030] 实验比对了常用的IonPac CS17色谱柱和IonPac CS19色谱柱。结果显示，采用IonPac CS17色谱柱进行分析时，枸杞样品中其他杂质色谱峰与甜菜碱色谱峰不能完全分离；采用IonPac CS19色谱柱，分离效果明显优于IonPac CS17，且甜菜碱的保留时间稳定，在123天内保留时间的相对标准偏差小于1.1％。

[0031] (2)柱温和分析时间条件

[0032] 当温度维持在30℃时，获得最佳柱效，与邻近杂峰分离完全，分离度高、分离效果好。

[0033] 本发明确定的色谱条件为：Ion Pac CS19为分析柱、Ion Pac CG19为预柱；进样量10μL；流动相流速为1.0mL/min，停泵时间为10min；柱温30℃，流动相为5mM MSA。

[0034] 实施例2枸杞样品中甜菜碱的测定实验

[0035] 应用本方法对枸杞样品进行甜菜碱的测定实验。

[0036] (1)样品前处理

[0037] 称取经粉碎的固体样品(固体样品为枸杞子)约0.5g或液体样品约2.5g，精密称取，加水使溶解并定容至25ml，超声处理(500W/40KHz)30min，离心10min(转速10000rpm)，取上清液过滤膜后，过预活化处理RP柱，弃去前3mL，取续滤液，上机待测。

[0038] (2)标准溶液的配置

[0039] 甜菜碱标准储备液1000mg/L：准确称取标准物质0.1000g溶于纯水中，摇匀备用。再逐级稀释成所需要的浓度即可。标准物质色谱图(色谱条件同本实施例步骤(3))如图1所示。

[0040] (3)离子色谱分析

[0041] Ion Pac CS19色谱柱、Ion Pac CG19预柱；进样量10μL；流速为1.0mL/min，停泵时间为10min；柱温30℃，流动相为5mM MSA。色谱图如图2所示。

[0042] 测定结果见表1所示

[0043] 表1实际样品的甜菜碱含量(g/kg)

[0044]

[0045] 由表1所知，不同产地不同品种的枸杞中甜菜碱含量有些许差别，在枸杞做成枸杞浆的过程中，甜菜碱含量有明显降低。

[0046] 标准曲线线性、检测限和方法精密度

[0047] 采用外标法定量。以浓度(mg/L)为横坐标x，峰面积为纵坐标y进行线性回归。以信噪比为3，用逐级稀释低浓度标准溶液的方法确定检测限。按照本发明方法对枸杞样品A进行3次平行测定，结果见表2所示。

[0048] 表2标准物质的线性方程、相关系数、检出限和方法精密度

[0049]

[0050] 由表2可见，本发明方法的线性良好，相关系数大于0.999；方法的精密度良好，检出限低，可满足对各类功能食品样品中甜菜碱的检测要求。

[0051] 检出限测定方法：对样品空白溶液进行10次测定，计算其标准偏差(δ)，以标准偏差(δ)的3倍所对应的待测元素浓度表示检出限(mg/L):DL＝3(δ)。

[0052] 方法的回收率

[0053] 取枸杞样品，以其平行3次测定的平均值作为计算其甜菜碱的原始含量的依据，添加高低两个浓度水平的标准进行回收实验，实验结果见表4所示。

[0054] 表4方法回收率实验结果

[0055]

[0056] 由表4可见，甜菜碱的回收率在90.8～94.7％之间，结果理想。

[0057] 实施例3

[0058] 对比例1本发明方法与NY/T1746-2009规定的比色法的测试数据对比[0059] 本方法和NY/T1746-2009方法进行了对比，选择表1中的3#液体样品作为待测试样，NY/T1746-2009测得数据如表5所示：

[0060] 表5

[0061]

[0062] 添加回收率数据如表6所示：

[0063] 表6

[0064]

[0065] 实验结果证明，比色法因为样品基质复杂，对吸光度的测定干扰作用大，故回收率较低，重现性也较差，且检出限只有400mg/kg，在测试低含量样品时存在定量不准确，甚至检测不出含量。

[0066] 对比例2

[0067] 本方法和专利201310112554.6(枸杞子中甜菜碱的含量测定方法)具体实施方式中的方法和色谱条件进行了比对。

[0068] 专利专利201310112554.6前处理方法复杂，加热回流、过层析柱净化，耗时、不方便实际操作，且使用大量的有机试剂、甲醇、乙醇，给环境带来极大危害。使用HPLC-DAD，出峰时间20min左右，出峰时间太长，不利于大量样品的检测，且流动相为82％的乙腈，不利于环保。并未提供具体的检出限等关键数据。

[0069] 对比例3

[0070] 申请人经过研究意外发现，当本实施例2的流动相为体积比5mM甲基磺酸(MSA):甲醇：三乙胺＝100：10：(0.1-0.3)时目标峰可以获得较好的峰形，且可以获得更高的回收率和精密度。实施过程如下：

[0071] (1)称取经粉碎的固体样品(固体样品为枸杞子)约0.5g，精密称取，加水使溶解并定容至25ml，超声处理(500W/40KHz)30min，离心10min(转速10000rpm)，取上清液过滤膜后，过预活化处理RP柱，弃去前3mL，取续滤液，上机待测。

[0072] (2)标准溶液的配置

[0073] 甜菜碱标准储备液1000mg/L：准确称取标准物质0.1000g溶于纯水中，摇匀备用。再逐级稀释成所需要的浓度即可。

[0074] (3)离子色谱分析

[0075] Ion Pac CS19色谱柱、Ion Pac CG19预柱；进样量10μL；流速为1.0mL/min，停泵时间为10min；柱温30℃，流动相为体积比5mM甲基磺酸(MSA):甲醇：三乙胺＝100：10：0.2。

[0076] 回收率和精密度测定：

[0077] 取枸杞样品，以其平行3次测定的平均值作为计算其甜菜碱的原始含量的依据，添加高低两个浓度水平的标准进行回收实验，实验结果如表7所示：

[0078] 表7

[0079]

[0080] 由上表4可见，甜菜碱的回收率在94.4～95.7％之间，方法精密度显著提高，结果理想。但由于三乙胺毒性较大，故暂未在实际测定过程中使用。

[0081] 综上所述，本发明的方法线性良好，回收率为90.8～94.7％，精密度1.11％，检出限0.0366μg/ml。经实验比对，本发明方法检测限低，重复性好，回收率理想，样品前处理简单，有效的提高了实验室的日常检测效率，可较快的完成对大量样品的分析。本方法不使用有毒试剂，经试验比对，可用于各种植食性、功能性食品中甜菜碱的快速、批量检测。