超顺磁性纳米微球及其制备方法、磁共振造影剂

摘要

本发明公开了一种超顺磁性纳米微球，包括铁氧化物核和包裹在铁氧化物核表面的葡聚糖外壳，铁氧化物核的外表面被络合剂改性，络合剂为羧酸或羧酸盐。络合剂溶解后形成的羧酸根和铁氧化物核中的Fe进行络合反应，提高了铁氧化物核的稳定性。相对于传统的超顺磁性纳米微球，这种超顺磁性纳米微球稳定性较好，不容易团聚。本发明还公开了上述超顺磁性纳米微球的制备方法，以及采用上述超顺磁性纳米微球的磁共振造影剂。

权利要求

1.一种超顺磁性纳米微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将葡聚糖溶液的温度维持在-10℃～10℃的同时通入保护气体除氧，接着加入铁盐、亚铁盐和络合剂，混匀后调节pH为10～12，得到混合溶液，所述络合剂为羧酸或羧酸盐；

将所述混合溶液升温到100℃～300℃并维持30min～300min，得到熟化后的混合溶液；

以及

将所述熟化后的混合溶液进行固液分离后保留固体，所述固体即为所述超顺磁性纳米微球，所述超顺磁性纳米微球包括铁氧化物核和包裹在所述铁氧化物核表面的葡聚糖外壳，所述铁氧化物核的外表面被络合剂改性。

2.根据权利要求1所述的超顺磁性纳米微球的制备方法，其特征在于，通保护气体除氧的操作中，所述保护气体为氮气或氩气，所述保护气体的流量为0.18L/min～0.6L/min，所述除氧的时间为20min～50min。

3.根据权利要求1所述的超顺磁性纳米微球的制备方法，其特征在于，所述铁盐为氯化铁、硫酸铁或羧酸铁，所述亚铁盐为氯化亚铁或硫酸亚铁。

4.根据权利要求1所述的超顺磁性纳米微球的制备方法，其特征在于，得到混合溶液的操作中，所述葡聚糖溶液的溶质、所述铁盐和所述亚铁盐的质量和、所述络合剂三者的质量比为30～60：1.5～3：0.5～2；所述铁盐和所述亚铁盐的质量比为2～2.8。

5.根据权利要求1所述的超顺磁性纳米微球的制备方法，其特征在于，将所述熟化后的混合溶液进行固液分离的操作中，采用超滤、透析或离心沉淀的方法完成固液分离。

6.一种采用如权利要求1～5中任一项所述的超顺磁性纳米微球的制备方法得到的超顺磁性纳米微球，其特征在于，包括铁氧化物核和包裹在所述铁氧化物核表面的葡聚糖外壳，所述铁氧化物核的外表面被络合剂改性，所述络合剂为羧酸或羧酸盐。

7.根据权利要求6所述的超顺磁性纳米微球，其特征在于，所述超顺磁性纳米微球的粒径为5nm～50nm，所述超顺磁性纳米微球中的铁含量占总质量的百分比为3％～40％。

8.根据权利要求6所述的超顺磁性纳米微球，其特征在于，所述葡聚糖外壳的材料为右旋糖酐10、右旋糖酐20或右旋糖酐40。

9.根据权利要求6所述的超顺磁性纳米微球，其特征在于，所述羧酸为柠檬酸、酒石酸、苹果酸、草酸或乙二胺四乙酸，所述羧酸盐为柠檬酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、草酸盐或乙二胺四乙酸盐。

10.一种磁共振造影剂，其特征在于，包括如权利要求6～9中任一项所述的超顺磁性纳米微球。

说明书

超顺磁性纳米微球及其制备方法、磁共振造影剂

技术领域

[0001] 本发明涉及超顺磁性功能微球领域，特别是涉及一种超顺磁性纳米微球及其制备方法，以及采用该超顺磁性纳米微球的磁共振造影剂。

背景技术

[0002] 超顺磁性纳米微球表面通过化学修饰、生物活性物质修饰使其在生物医学、磁共振造影等领域均有相当广阔的应用前景。已报道的铁氧化物核纳米粒子作为应用较少的纳米粒子之一，近年在磁共振成像领域得到极大重视，其生物医学应用的进展依赖于发现新的合成的方法来控制粒子的尺寸分布、更好的表面修饰来改进表面性质。

[0003] 现有技术合成包含铁氧化物核的超顺磁性纳米微球的方法主要是共沉淀法。共沉淀法通常是在溶液状态下将不同化学成分的物质混合，在混合液中加入适当的沉淀剂制备前驱体沉淀物，再将沉淀物进行干燥或锻烧，从而制得相应的粉体颗粒。共沉淀法制备超顺磁性纳米微球具有制备工艺简单、成本低、制备条件易于控制、合成周期短等优点，已成为目前研究最多的制备方法。但是，现有技术合成的超顺磁性纳米微球稳定性较差，容易团聚，限制了这种超顺磁性纳米微球的应用。

发明内容

[0004] 基于此，有必要提供一种稳定性较好，不容易团聚的超顺磁性纳米微球极其制备方法，以及采用该超顺磁性纳米微球的磁共振造影剂。

[0005] 一种超顺磁性纳米微球，包括铁氧化物核和包裹在所述铁氧化物核表面的葡聚糖外壳，所述铁氧化物核的外表面被络合剂改性，所述络合剂为羧酸或羧酸盐。

[0006] 在其中一个实施例中，所述超顺磁性纳米微球的粒径为5nm～50nm，所述超顺磁性纳米微球中的铁含量占总质量的百分比为3%～40%。

[0007] 在其中一个实施例中，所述葡聚糖外壳的材料为右旋糖酐10、右旋糖酐20或右旋糖酐40。

[0008] 在其中一个实施例中，所述羧酸为柠檬酸、酒石酸、苹果酸、草酸或乙二胺四乙酸，所述羧酸盐为柠檬酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、草酸盐或乙二胺四乙酸盐。

[0009] 一种超顺磁性纳米微球的制备方法，包括如下步骤：

[0010] 将葡聚糖溶液的温度维持在-10℃～10℃的同时通入保护气体除氧，接着加入铁盐、亚铁盐和络合剂，混匀后调节pH为10～12，得到混合溶液；

[0011] 将所述混合溶液升温到100℃～300℃并维持30min～300min，得到熟化后的混合溶液；以及

[0012] 将所述熟化后的混合溶液进行固液分离后保留固体，所述固体即为所述超顺磁性纳米微球，所述超顺磁性纳米微球包括铁氧化物核和包裹在所述铁氧化物核表面的葡聚糖外壳，所述铁氧化物核的外表面被络合剂改性。

[0013] 在其中一个实施例中，通保护气体除氧的操作中，所述保护气体为氮气或氩气，所述保护气体的流量为0.18L/min～0.6L/min，所述除氧的时间为20min～50min。

[0014] 在其中一个实施例中，所述铁盐为氯化铁、硫酸铁或羧酸铁，所述亚铁盐为氯化亚铁或硫酸亚铁。

[0015] 在其中一个实施例中，得到混合溶液的操作中，所述葡聚糖溶液的溶质、所述铁盐和所述亚铁盐的质量和、所述络合剂三者的质量比为30～60：1.5～3：0.5～2；所述铁盐和所述亚铁盐的质量比为2～2.8。

[0016] 在其中一个实施例中，将所述熟化后的混合溶液进行固液分离的操作中，采用超滤、透析或离心沉淀的方法完成固液分离。

[0017] 一种磁共振造影剂，包括上述的超顺磁性纳米微球。

[0018] 上述超顺磁性纳米微球包括铁氧化物核和包裹在铁氧化物核表面的葡聚糖外壳，铁氧化物核的外表面被络合剂改性，络合剂为羧酸或羧酸盐，络合剂溶解后形成的羧酸根和铁氧化物核中的Fe进行络合反应，提高了铁氧化物核的稳定性。相对于传统的超顺磁性纳米微球，这种超顺磁性纳米微球稳定性较好，不容易团聚。

附图说明

[0019] 图1为一实施方式的超顺磁性纳米微球的制备方法的流程图；

[0020] 图2为实施例1制备的超顺磁性纳米微球的X射线衍射图；

[0021] 图3（a）为实施例1制备的超顺磁性纳米微球的透射电镜（TEM）图；

[0022] 图3（b）为实施例1制备的超顺磁性纳米微球的动态光散射（DLS）图；

[0023] 图4为纯四氧化三铁红外光谱图；

[0024] 图5为实施例1制备的超顺磁性纳米微球的红外光谱图；

[0025] 图6（a）为实施例1制备的超顺磁性纳米微球经稀释之后在1.5T磁场下的纵向弛豫率（R1）图；

[0026] 图6（b）为实施例1制备的超顺磁性纳米微球经稀释之后在1.5T磁场下的横向弛豫率（R2）图；

[0027] 图7为实施例1制备的超顺磁性纳米微球经稀释之后的体外T1磁共振成像图。

具体实施方式

[0028] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

[0029] 实施方式的超顺磁性纳米微球，包括铁氧化物核和包裹在铁氧化物核表面的葡聚糖外壳，铁氧化物核的外表面被络合剂改性，络合剂为羧酸或羧酸盐。

[0030] 超顺磁性纳米微球的粒径为5nm～50nm。

[0031] 超顺磁性纳米微球中铁含量占总质量的百分比为3%～40%。

[0032] 铁氧化物为FeO和Fe2O3的复合物。在一个较优的实施方式中，铁氧化物为Fe3O4。

[0033] 葡聚糖外壳的材料为右旋糖酐10（Dextran10）、右旋糖酐20（Dextran20）或右旋糖酐40（Dextran40）。

[0034] 羧酸为柠檬酸、酒石酸、苹果酸、草酸或乙二胺四乙酸。

[0035] 羧酸盐为柠檬酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、草酸盐或乙二胺四乙酸盐。

[0036] 这种超顺磁性纳米微球包括铁氧化物核和包裹在铁氧化物核表面的葡聚糖外壳，铁氧化物核的外表面被络合剂改性，络合剂为羧酸或羧酸盐，络合剂溶解后形成的羧酸根和铁氧化物核中的Fe进行络合反应，提高了铁氧化物核的稳定性。相对于传统的超顺磁性纳米微球，这种超顺磁性纳米微球稳定性较好，不容易团聚。

[0037] 如图1所示的上述超顺磁性纳米微球的制备方法，包括如下步骤：

[0038] S10、将葡聚糖溶液的温度维持在-10℃～10℃的同时通入保护气体除氧，接着加入铁盐、亚铁盐和络合剂，混匀后调节pH为10～12，得到混合溶液。

[0039] 葡聚糖外壳的材料为右旋糖酐10（Dextran10）、右旋糖酐20（Dextran20）或右旋糖酐40（Dextran40）。

[0040] 通保护气体除氧的操作中，保护气体为氮气或氩气，保护气体的流量为0.18L/min～0.6L/min，除氧的时间一般为20min～50min。

[0041] 铁盐为氯化铁、硫酸铁或羧酸铁，亚铁盐为氯化亚铁或硫酸亚铁。

[0042] 羧酸铁为柠檬酸铁或酒石酸铁。

[0043] 络合剂为羧酸或羧酸盐，羧酸为柠檬酸、酒石酸、苹果酸、草酸或乙二胺四乙酸；羧酸盐为柠檬酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、草酸盐或乙二胺四乙酸盐。

[0044] 得到混合溶液的操作中，葡聚糖溶液的溶质、铁盐和亚铁盐的质量和、络合剂三者的质量比为30～60：1.5～3：0.5～2。

[0045] 铁盐和亚铁盐的质量比为2～2.8。

[0046] 用碱性溶液调节pH，碱性溶液为氨水溶液、NaOH溶液、Na2CO3溶液或NaHCO3溶液。

[0047] S20、将步骤S10中的混合溶液升温到100℃～300℃并维持30min～300min，得到熟化后的混合溶液。

[0048] 得到熟化后的混合溶液的操作中，保持搅拌和通氮气的操作。

[0049] S30、将步骤S20中的熟化后的混合溶液进行固液分离后保留固体，固体即为超顺磁性纳米微球，超顺磁性纳米微球包括铁氧化物核和包裹在铁氧化物核表面的葡聚糖外壳，铁氧化物核的外表面被络合剂改性。

[0050] 将所述熟化后的混合溶液进行固液分离的操作中，采用超滤、透析或离心沉淀的方法完成固液分离。其中超滤是一种加压膜分离技术，分离效果好，一般地，超滤的膜孔径规格为10KD～100KD。

[0051] 这种超顺磁性纳米微球的制备方法制得的超顺磁性纳米微球包括铁氧化物核和包裹在铁氧化物核表面的葡聚糖外壳，铁氧化物核的外表面被络合剂改性，络合剂为羧酸或羧酸盐，络合剂溶解后形成的羧酸根和铁氧化物核中的Fe进行络合反应，提高了铁氧化物核的稳定性。相对于传统的制备方法制备的超顺磁性纳米微球，上述制备方法获得的超顺磁性纳米微球稳定性较好，不容易团聚。

[0052] 一实施方式的磁共振造影剂，包括上述实施方式的超顺磁性纳米微球或按照上述超顺磁性纳米微球的制备方法制备的超顺磁性纳米微球。

[0053] 下面为具体实施方式：

[0054] 以下实施例中所用的仪器包括：台秤，型号为YP300D2，生产厂家为上海越平科技有限公司；搅拌器，型号为OS20-pro，生产厂家为大龙兴创实验仪器（北京）有限公司；核磁共振仪，型号为mq60，生产厂家为Bruker；X射线衍射仪，型号为PW1800，生产厂家为philips；透射电镜，型号为JEM2100，生产厂家为JEOL；动态光散射仪，型号为Nano ZS90，生产厂家为Malvern；红外光谱仪，型号为Nicolet iS5FT-IR，生产厂家为Thermo Scientific。

[0055] 以下实施例中所用的原料包括：右旋糖酐10(A.R.)，批号为20110718，生产厂家为国药(沪试)；FeCl3·6H2O(A.R.)，批号为20130917，生产厂家为国药(沪试)；FeCl2·4H2O(A.R.)，批号为20130507，生产厂家为国药(沪试)；氨水(G.R.)，批号为20130523，生产厂家为国药(沪试)；柠檬酸钠(A.R.)，批号为20130508，生产厂家为国药(沪试)；柠檬酸铁(A.R.)，批号为20130117，生产厂家为国药(沪试)；柠檬酸铁铵(A.R.)，批号为20130227，生产厂家为国药(沪试)。

[0056] 实施例1

[0057] 称取20g Dextran40溶解于350ml去离子水中，降温至8℃左右，保持搅拌并通入氮气30min除氧，氮气流量为0.5L/min。

[0058] 向上述溶液中加入15ml2mol/L的氯化铁溶液、9ml2mol/L的氯化亚铁和6.5g柠檬酸钠，并用质量分数为28%的氨水溶液调节溶液的pH到10，在此过程中保持搅拌和通入氮气，氮气流量为0.18L/min，得到混合溶液。

[0059] 将上述混合溶液立即升温至120℃，维持120min，并保持搅拌和通入氮气，氮气流量为0.18L/min，得到熟化后的混合溶液。

[0060] 将上述熟化后的混合溶液冷却至室温，用质量分数为0.05%的柠檬酸钠溶液进行超滤，超滤装置（苏州信望膜技术有限公司）连接分子量10KD膜进行超滤，加水稀释至6L，超滤浓缩至1L，如此反复，直至无铁盐杂质，即滤出液中总游离铁浓度小于10ppm，判断方法为采用铁氰酸铵进行比色，颜色不超过10ppm铁标准液。

[0061] 超滤后保留固体，固体经干燥后即得到超顺磁性纳米微球。

[0062] 对实施例1制得的超顺磁性纳米微球进行X射线衍射，得到图2。由图2可以看出，实施例1制得的物质与标准图谱中Fe3O4衍射峰一致，说明合成的物质为四氧化三铁纳米微球。

[0063] 对实施例1制得的超顺磁性纳米微球进行透射电镜表征，得到图3（a）。由图3（a）可以看出，实施例1制得的超顺磁性纳米微球的铁氧化物核的粒径大约为7nm。

[0064] 对实施例1制得的超顺磁性纳米微球进行动态光散射分析，得到图3（b）。由图3（b）可以看出，实施例1制得的超顺磁性纳米微球的粒径大约为15nm。

[0065] 对纯四氧化三铁进行红外扫描，得到图4。对实施例1制得的超顺磁性纳米微球进行红外光扫描，得到图5。对比图4和图5可以看出，图5中1616cm-1处为羧酸根峰，588cm-1处为四氧化三铁特征峰。从而说明实施例1制备得到的超顺磁性纳米微球的铁氧化物核的主要成分为四氧化三铁，并且实施例1制备得到的超顺磁性纳米微球的铁氧化物核的外表面被羧酸根改性。

[0066] 弛豫率实验

[0067] 弛豫率是评价纳米磁共振造影剂造影效果的重要指标，将实施例1制得的超顺磁性纳米微球溶解于水中配制成浓度为0.25mmol/L、0.45mmol/L、0.7mmol/L、0.9mmol/L和1.2mmol/L的五份样品，分别取800μL放入不同的样品管中，将样品管放入37℃水浴10min，然后放入透射电镜仪器探头内5min后开始测量，磁场强度为1.5T。得到实施例1制备的超顺磁性纳米微球经稀释之后在1.5T磁场下的纵向弛豫率（R1）图和横向弛豫率（R2）图，分别如图6（a）和图6（b）所示，图6（a）和图6（b）中的横坐标均为铁浓度，即纳米磁共振造影剂中铁氧化物的浓度。由图6（a）可得，实施例1制得的超顺磁性纳米微球的R1为7.85。由图6（b）可得，实施例1制得的超顺磁性纳米微球的R2为17.18。R2/R1=2.18，这说明超顺磁性纳米微球可以做T1造影剂使用。

[0068] 实施例1制备的超顺磁性纳米微球经稀释不同浓度做体外造影实验，得到体外T1磁共振成像图，如图7所示，稀释后不同浓度的样品在1.5T核磁共振仪下体外成像效果呈T1正造影，随着样品浓度增大而逐渐变亮。这说明此纳米微球可以进行T1成像。

[0069] 灭菌实验

[0070] 高压灭菌是注射剂常用的灭菌方法，也是评价注射剂稳定性的一个重要环节。将实施例1制得的超顺磁性纳米微球进行压盖，在灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为在121℃下维持30min。样品灭菌前后各指标变化如表1所示。

[0071] 表1样品灭菌前后各指标变化

[0072]指标 灭菌前 灭菌后
pH 7.32 7.35
外观 深褐色 深褐色

[0073]粒径 20nm 21nm
弛豫率（R1） 7.85 7.80

[0074] 表1可以看出，灭菌前后实施例1制得的超顺磁性纳米微球外观、粒径、弛豫率和pH值都未发生性状改变，说明实施例1制得的超顺磁性纳米微球适合高压灭菌。

[0075] 稳定性实验

[0076] 加速试验是评价制剂的保存期限的重要手段。将实施例1制得的超顺磁性纳米微球于121℃维持30min灭菌后，进行40℃放置试验，分别于1个月、2个月、3个月和6个月拿出来进行检测，评价指标为外观、粒径、弛豫率和pH值。样品加速试验结果如表2所示。

[0077] 表2样品加速试验结果

[0078]指标 0个月 1个月 2个月 3个月 6个月
pH 7.32 7.31 7.30 7.34 7.35
外观 深褐色 深褐色 深褐色 深褐色 深褐色
粒径 20nm 20nm 20nm 20nm 21nm
弛豫率（R1） 7.2 7.3 7.2 7.2 7.3

[0079] 由表2可以看出，将灭菌后的实施例1制得的超顺磁性纳米微球加速放置6个月后，外观、粒径、弛豫率和pH值均未发现有明显改变，说明实施例1制得的超顺磁性纳米微球能够长期储存。

[0080] 实施例2

[0081] 称取30g Dextran20溶解于350ml去离子水中，降温至5℃左右，保持搅拌并通入氮气30min除氧，氮气流量为0.5L/min。

[0082] 向上述溶液中加入10ml3mol/L的柠檬酸铁溶液和9ml2mol/L的氯化亚铁，缓慢滴入3mol/L的NaOH溶液调节溶液的pH到11，在此过程中保持搅拌和通入氮气，氮气流量为0.5L/min，得到混合溶液。

[0083] 将上述混合溶液立即升温至100℃，维持100min，并保持搅拌和通入氮气，氮气流量为0.2L/min，得到熟化后的混合溶液。

[0084] 将上述熟化后的混合溶液冷却至室温，用质量分数为0.05%的柠檬酸钠缓冲溶液进行超滤，超滤装置连接分子量10KD膜进行超滤，加水稀释至6L，超滤浓缩至1L，如此反复，直至无铁盐杂质，即滤出液中总游离铁浓度小于10ppm，判断方法为采用铁氰酸铵进行比色，颜色不超过10ppm铁标准液。

[0085] 超滤后保留固体，固体经干燥后即得到超顺磁性纳米微球。

[0086] 实施例3

[0087] 称取50g Dextran10溶解于350ml去离子水中，降温至4℃左右，保持搅拌并通入氮气30min除氧，氮气流量为0.6L/min。

[0088] 向上述溶液中加入10ml3mol/L的柠檬酸铁铵溶液和9ml2mol/L的氯化亚铁溶液，并用3mol/L的NaOH溶液调节溶液的pH到12，保持搅拌和通入氮气，氮气流量为0.4L/min，得到混合溶液。

[0089] 将上述混合溶液立即升温至150℃，维持90min，并保持搅拌和通入氮气，氮气流量为0.2L/min，得到熟化后的混合溶液。

[0090] 将上述熟化后的混合溶液冷却至室温，用质量分数为0.05%的柠檬酸钠溶液进行超滤，超滤装置连接分子量10KD膜进行超滤，加水稀释至6L，超滤浓缩至1L，如此反复，直至无铁盐杂质，即滤出液中总游离铁浓度小于10ppm，判断方法为采用铁氰酸铵进行比色，颜色不超过10ppm铁标准液。

[0091] 超滤后保留固体，固体经干燥后即得到超顺磁性纳米微球。

[0092] 实施例4

[0093] 称取20g Dextran40溶解于350ml去离子水中，降温至5℃左右，保持搅拌并通入氮气30min除氧，氮气流量为0.5L/min。

[0094] 向上述溶液加入15ml2mol/L的氯化铁溶液、9ml2mol/L的氯化亚铁溶液和5.1g酒石酸，并用质量分数为28%的氨水溶液调节溶液的pH到11，在此过程中保持搅拌和通入氮气，氮气流量为0.4L/min，得到混合溶液。

[0095] 将上述混合溶液倒入水热反应釜中，密闭升温至120℃，维持120min，并保持搅拌和通入氮气，氮气流量为0.2L/min，得到熟化后的混合溶液。

[0096] 将上述熟化后的混合溶液冷却至室温，用质量分数为0.05%的酒石酸钠溶液进行超滤，超滤装置连接分子量10KD膜进行超滤，加水稀释至6L，超滤浓缩至1L，如此反复，直至无铁盐杂质，即滤出液中总游离铁浓度小于10ppm，判断方法为采用铁氰酸铵进行比色，颜色不超过10ppm铁标准液。

[0097] 超滤后保留固体，固体经干燥后即得到超顺磁性纳米微球。

[0098] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。