一种用于治疗乙型病毒性肝炎的siRNA组合物

摘要

本发明属于乙肝药物领域，具体涉及一种用于治疗乙型病毒性肝炎的siRNA组合物。所述的组合物包含siRNA序列以及其他组分，所述siRNA序列为ID No.267，其他组分按重量份为阳离子脂质0.5-3份、T2C1化合物2-8份、磷脂0.5-3份、胆固醇0-2份和脂质-聚乙二醇2-10份。在达到相同效果的情况下，本发明siRNA制剂的注射剂量，远远低于现有技术中的小鼠药物剂量。

权利要求

1.一种用于治疗乙型病毒性肝炎的siRNA组合物，其特征在于，所述的组合物包含siRNA序列组6.25份、三甲基[2,3-( 二亚油烯基氧基) 丙基] 氯化铵1 份、轮环藤宁0.5 份、磷脂酰乙醇胺1 份、T2C1 化合物5 份、胆固醇1 份、胆固醇聚乙二醇1 份和双肉豆蔻酰基甘油聚乙二醇3 份；

其中，所述的siRNA序列组为ID No.267；所述ID No.267由一条正义链和一条反义链组成：正义链 :CCGUGUGCACUUCGCUUCA[dT][dT]反义链 :UGAAGCGAAGUGCACACGGUC

所述的siRNA在5’端和/或3’端的核苷酸单体进行硫代修饰；并且通过5’端和/或3’端连接一个胆固醇分子。

2.如权利要求1所述的用于治疗乙型病毒性肝炎的siRNA组合物，其特征在于，所述siRNA的核糖核酸含有2’修饰；2’修饰为2’-脱氧，2’-脱氧-氟，2’-O-甲基，2’-O-甲氧基，

2’-O-氨基-丙基，2’-O-二甲基氨基乙基，2’-O-二甲基氨基丙基，2’-O-二甲基氨基乙基乙氧基和2’-O-二甲基乙酰胺中的一种或几种。

3.如权利要求1所述的用于治疗乙型病毒性肝炎的siRNA组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将所述siRNA序列溶解于水或含有9%蔗糖的水中，得溶液一；

（2）称取权利要求1所述其他成分，并将这些组分溶解于酒精中得溶液二；

（3）将溶液一与溶液二按照体积比为1:0.25相互混合均匀后，于室温下进行真空抽滤，使其中的酒精逐渐蒸发；

（4）待大部分的酒精蒸发后，进行均质，得到悬浮液，悬浮液中的颗粒大小为40nm；

（5）再对悬浮液进行高压均质、冻干，形成干燥物，即得所述用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物。

说明书

一种用于治疗乙型病毒性肝炎的siRNA组合物

技术领域

[0001] 本发明属于医药生物领域，具体涉及一种用于治疗乙型病毒性肝炎的siRNA组合物。

背景技术

[0002] 乙型病毒性肝炎(Hepatitis B)，简称乙肝，也称血清型肝炎(Serum Hepatitis)，是一种由乙型肝炎病毒引起的疾病。乙型肝炎病毒会引起肝硬化和肝癌。乙肝主要在中国及其他一些亚洲国家中流行，在非洲萨哈拉沙漠南方也非常盛行。2006年中国人口中乙肝表面抗原携带率为7.18％。型肝炎与肺结核和艾滋病并列世界上最常见的传染病。乙型肝炎是全球死亡原因的第10位，全世界约有3.5～4亿人感染乙型肝炎病毒，人数高达艾滋病感染者的八倍以上。

[0003] 乙肝病毒严重困扰着人们的生活、工作和身心健康，我国每年约30万人因乙肝病毒感染导致肝衰竭、肝硬化、肝癌而死亡。治疗HBV的最终目标是抑制或消除HBV，缓和或停止HBV感染引起的肝损伤，防止肝功能衰竭和肝癌的发展。最重要短期和中期治疗目标是最大限度地提高HBV DNA抑制率。但是，彻底根除B型肝炎病毒是困难的，因为它整合到宿主基因组中，产生继续作为潜在复发倾向的cccDNA。聚乙二醇干扰素α-2a、干扰素α-2a、核苷类药物和核苷酸类似物是FDA批准的抗HBV药物市场上常用的药物。干扰素治疗的主要缺点是其显著的副作用，限制其长期使用。它对失代偿期肝硬化与转氨酶正常患者往往是无效的。此外，只有三分之一的患者对PEG-IFN-α抗病毒有效。虽然核苷(酸)类似物抑制HBV复制并能使肝脏坏死性炎症减少，但不能完全根除病毒。停药后，多数患者观察到病毒血症的反弹。此外，长期治疗产生耐药HBV病毒株，导致治疗失败。迫切需要一种全新的治疗方法。

[0004] 专利2013102317308公开了一种用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物及其制备方法。该发明的包裹、保护效果较差，药效不能得到充分的发挥，易被降解，需使用较大的药剂量。

发明内容

[0005] 本发明的一个目的是一种用于治疗乙型病毒性肝炎的siRNA组合物，所述的组合物包含siRNA序列和其他组分，所述其他组分为T2C1化合物。

[0006] 所述其他组分为T2C1化合物(公开于ZL201180041450.X大环脂类化合物及其应用)和阳离子脂质。

[0007] 所述其他组分为阳离子脂质、T2C1化合物、磷脂、胆固醇和脂质-聚乙二醇。

[0008] 所述其他组分按重量份为阳离子脂质0.5-3份，优选为1.5-2.5份；T2C1化合物2-8份，优选为3-5份；磷脂0.5-3份，优选为0.7-1份；胆固醇0-2份，优选为0-1份；脂质-聚乙二醇2-10份，优选为4-8份；

[0009] 所述其他组分的重量的和与所述siRNA的重量比为(2-40):1。所述T2C1化合物与所述siRNA的重量比为(0.8-10)：1。

[0010] 所述T2C1化合物的结构式如下：

[0011]

[0012] 所述siRNA序列为ID No.267；所述ID No.267由一条正义链和一条反义链组成：

[0013] 正义链:CCGUGUGCACUUCGCUUCA[dT][dT]；

[0014] 反义链:UGAAGCGAAGUGCACACGGUC。

[0015] 所述siRNA在5’端和/或3’端的核苷酸单体进行硫代修饰。

[0016] 所述siRNA的核糖核酸含有2’修饰；2’修饰为2’-脱氧，2’-脱氧-氟，2’-O-甲基，2’-O-甲氧基，2’-O-氨基-丙基(2’-O-amino-propyl，2’-0-AP)，2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-dimethylaminoethyl，2’-O-DMAOE)，2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-
dimethylaminopropyl，2’-O-DMAP)，2’-O-二甲基氨基乙基乙氧基(2’-O-dimethylaminoethyloxyethyl，2’-O-DMAEOE)和2’-O-二甲基乙酰胺(2’-O-dimethylacetamide，2’-O-NMA)中的一种或几种。

[0017] 所述siRNA通过5’端和/或3’端连接一个胆固醇分子。

[0018] 所述阳离子脂质为三甲基[2,3-(二亚油烯基氧基)丙基]氯化铵；1,4,7,10-四氮杂环十二烷，轮环藤宁；N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵，DOTMA；N,N-二甲基-(2,3-二油烯基氧基)丙胺，DODMA；1,2-二油酰基-3-二甲胺丙烷，DODAP；双硬脂基二甲基铵，DSDMA；N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵，DODAC；N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵，DOTAP；N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵，DDAB；3-(N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇，DC-Chol；N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵，DMRIE；1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷，DLinDMA；1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷，DLenDMA；N4-精胺胆固醇氨基甲酸酯，GL-67；N4-亚精胺胆固醇氨基甲酸酯，GL-53，1-(N4-精胺)-2,3-二月桂基甘油氨基甲酸酯，GL-89中的一种或几种；

[0019] 优选为三甲基[2,3-(二亚油烯基氧基)丙基]氯化铵、轮环藤宁、DOTMA、DOTAP、DODAP、DLinDMA、DC-Chol中的一种或几种。

[0020] 所述三甲基[2,3-(二亚油烯基氧基)丙基]氯化铵的制备过程在氩气中进行。

[0021] 所述三甲基[2,3-(二亚油烯基氧基)丙基]氯化铵的结构式如下：

[0022]

[0023] 所述磷脂为磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、卵磷脂、磷脂酰肌醇和心肌磷脂中的一种或几种；

[0024] 所述脂质-聚乙二醇为胆固醇聚乙二醇、双肉豆蔻酰基甘油聚乙二醇、1,2-二亚油酰基-顺-甘油-3-磷酸乙醇氨、双棕榈酰基甘油聚乙二醇和双硬脂基甘油聚乙二醇中的一种或几种。

[0025] 所述T2C1化合物是由1,4,7,10-四氮杂环十二烷和环氧化合物在90℃反应得到；反应时置于玻璃容器内，持续搅拌，反应摩尔比为1:4，反应时长为24-72小时，优选为28-65小时。环氧化合物优选环氧烷基缩水甘油醚(烷基C12-C14)。

[0026] 用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物的制备方法，包括以下步骤：

[0027] (1)将所述siRNA序列溶解于水或含有9％蔗糖的水中，得溶液一；

[0028] (2)称取权利要求1所述其他成分，并将这些组分溶解于酒精中得溶液二；

[0029] (3)将溶液一与溶液二相互混合均匀后，于室温下进行真空抽滤，使其中的酒精逐渐蒸发；

[0030] (4)待大部分的酒精蒸发后，进行均质，得到悬浮液；

[0031] (5)再对悬浮液进行高压均质、冻干，形成干燥物，即得所述用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物。

[0032] 所述溶液一与溶液二的体积比为1:(0.25-0.8)。

[0033] 所述步骤(4)中，均质后的悬浮液中的颗粒大小为40-240nm。

[0034] 所述溶液一与溶液二的体积比优选为1:(0.25-0.5)。

[0035] 本发明中的siRNA能特异性的抑制靶基因。所以对乙肝基因的特异性抑制效果远大于小化学分子药物。人乙肝病毒的转基因小鼠实验证明，在达到相同效果的情况下，本发明siRNA制剂的注射剂量，远远低于现有技术中的小鼠药物剂量。

[0036] 虽然siRNA特异性较高，但siRNA的序列本身也会使机体产生非特异性反应，即脱靶效应。通过修饰和制剂的siRNA传递，可以将siRNA保护起来，使其不能与免疫细胞和其他组织细胞接触，就避免了免疫因子的产生。本发明，选用最适的脂质、磷脂和胆固醇保护siRNA，使其脱靶效应降为最低。再配合脂质-聚乙二醇有效地包裹siRNA，增加了药物的靶向性，增强了其在血液中的稳定性，使其传递到肝脏，并且减少了副作用。细胞实验证明，在有效剂量下，没有明显的影响免疫因子产生。T2C1在pH中性环境中，不带电荷，即在血液中是不带电的，不会与血液中的成分结合。T2C1被吞噬进入细胞后，在细胞内体pH酸性环境中，带正电荷，能驱使细胞质内的H离子，进入细胞内体，使其膨胀，破裂，释放siRNA进入细胞质。使siRNA在细胞内发生功效。对核苷酸单体进行硫代修饰、核糖核酸的2’修饰，增加siRNA在组织中的稳定性，或减少其引起的不必要的脱靶效应或由双链siRNA分子引起的免疫反应。

附图说明

[0037] 图1是HBV转基因小鼠注射不同剂量的组合物，体内HBV病毒的DNA变化曲线图；

[0038] 图2是HBV转基因小鼠注射0.5mg/kg siRNA剂量的组合物，体内HBV病毒的表面抗原变化曲线图；

[0039] 图3是HBV转基因小鼠注射不同实施例的组合物，体内HBV病毒的DNA变化曲线图；

[0040] 图4是siRNA稳定性检测的琼脂糖凝胶电泳成像图；

[0041] 图5是TNF-α在不同条件下的表达情况柱状图；

[0042] 图6是组合物颗粒进入细胞的电镜扫描图；

[0043] 图7是本发明实施例7所述化合物的核磁氢谱；

[0044] 图8是本发明实施例7所述化合物的核磁碳谱；

[0045] 现结合附图和实施例对本发明作进一步说明：

具体实施方式

[0046] 实施例1

[0047] 将环氧烷基缩水甘油醚(烷基C12)和1,4,7,10-四氮杂环十二烷按照摩尔比1:4，装入有搅拌子的玻璃瓶内，90℃反应36小时。反应产物进行薄层色谱分析，只存在一种主要产物，提纯后用以制备干扰组合物。

[0048] (1)取6.25份ID No.267溶解于水或含有9％蔗糖的水中，得溶液一1L；

[0049] (2)称取三甲基[2,3-(二亚油烯基氧基)丙基]氯化铵1份、轮环藤宁0.5份、磷脂酰乙醇胺1份、T2C1化合物5份、胆固醇1份、胆固醇聚乙二醇1份和双肉豆蔻酰基甘油聚乙二醇3份，并将这些组分溶解于酒精中得溶液二0.25L；

[0050] (3)将溶液一与溶液二相互混合均匀后，于室温下进行真空抽滤，使其中的酒精逐渐蒸发；

[0051] (4)待大部分的酒精蒸发后，进行均质，得到悬浮液的颗粒为40nm；

[0052] (5)再对悬浮液进行高压均质、冻干，形成干燥物，即得所述用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物。

[0053] 实施例2

[0054] (1)将所述0.2份siRNA序列溶解于水或含有9％蔗糖的水中，得溶液一1L；

[0055] (2)称取4份T2C1化合物，并溶解于酒精中得溶液二0.25L；

[0056] (3)将溶液一与溶液二相互混合均匀后，于室温下进行真空抽滤，使其中的酒精逐渐蒸发；

[0057] (4)待大部分的酒精蒸发后，进行均质，得到悬浮液的颗粒为60nm；

[0058] (5)再对悬浮液进行高压均质、冻干，形成干燥物，即得所述用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物。

[0059] 实施例3

[0060] (1)将所述0.5份siRNA序列溶解于水或含有9％蔗糖的水中，得溶液一1L；

[0061] (2)称取6份T2C1化合物，并溶解于酒精中得溶液二0.5L；

[0062] (3)将溶液一与溶液二相互混合均匀后，于室温下进行真空抽滤，使其中的酒精逐渐蒸发；

[0063] (4)待大部分的酒精蒸发后，进行均质，得到悬浮液的颗粒为120nm；

[0064] (5)再对悬浮液进行高压均质、冻干，形成干燥物，即得所述用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物。

[0065] 实施例4

[0066] (1)将所述0.2份siRNA序列溶解于水或含有9％蔗糖的水中，得溶液一1L；

[0067] (2)称取4份T2C1化合物和2份阳离子脂质并溶解于酒精中得溶液二0.7L；

[0068] (3)将溶液一与溶液二相互混合均匀后，于室温下进行真空抽滤，使其中的酒精逐渐蒸发；

[0069] (4)待大部分的酒精蒸发后，进行均质，得到悬浮液的颗粒为180nm；

[0070] (5)再对悬浮液进行高压均质、冻干，形成干燥物，即得所述用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物。

[0071] 实施例5

[0072] (1)将所述2份siRNA序列溶解于水或含有9％蔗糖的水中，得溶液一1L；

[0073] (2)称取7.5份T2C1化合物和2.5份阳离子脂质并溶解于酒精中得溶液二0.7L；

[0074] (3)将溶液一与溶液二相互混合均匀后，于室温下进行真空抽滤，使其中的酒精逐渐蒸发；

[0075] (4)待大部分的酒精蒸发后，进行均质，得到悬浮液的颗粒为90nm；

[0076] (5)再对悬浮液进行高压均质、冻干，形成干燥物，即得所述用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物。

[0077] 实施例6

[0078] (1)将所述1份siRNA序列溶解于水或含有9％蔗糖的水中，得溶液一1L；

[0079] (2)称取DODMA0.5份、GL-890.5份、T2C1化合物3.5份、磷脂酰胆碱0.5份、胆固醇1份和1,2-二亚油酰基-顺-甘油-3-磷酸乙醇氨5份，并将这些组分溶解于酒精中得溶液二0.45L；

[0080] (3)将溶液一与溶液二相互混合均匀后，于室温下进行真空抽滤，使其中的酒精逐渐蒸发；

[0081] (4)待大部分的酒精蒸发后，进行均质，得到悬浮液的颗粒为70nm；

[0082] (5)再对悬浮液进行高压均质、冻干，形成干燥物，即得所述用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物。

[0083] 实施例7

[0084] 三甲基[2,3-(二亚油烯基氧基)丙基]氯化铵合成：

[0085] 将亚油醇134.5g，三乙胺77.8g，4-二甲氨基吡啶7.21g加入1L三口烧瓶中，再加入二氯甲烷300ml,于-10℃低温循环泵中搅拌,降至-5℃以下，得到溶液A。将对甲苯璜酰氯130g溶于二氯甲烷200ml中，使用恒压滴液漏斗滴加入溶液A，保持液温-5℃，90分钟滴毕，缓慢升温，室温反应15h。收集产物以薄层层析检测，洗脱机为石油醚和乙酸乙酯，比例为5:
1。监测无油醇，使用二氯甲烷进行产物的分液萃取，经过无水硫酸镁干燥，旋蒸脱溶，得淡黄色油状物201.33g，收率为95％。

[0086] 向500ml四口烧瓶中加入氢化钠4g，四氢呋喃100ml，搅拌均匀，以氩气保护。通过恒压滴液漏斗滴加3-(二甲胺基)-1,2-丙二醇2g，10min滴毕。再滴加对甲苯磺酸油脂22g，0.5h内滴毕，升温至66℃，进行微回流反应24h，反应后产物颜色呈淡黄，降温后，以布氏漏斗抽滤，石油醚萃取，水洗，经无水硫酸镁干燥，旋蒸脱溶，得黄色油状物20g。最后以硅胶柱层析，洗脱剂选用二氯甲烷和甲醇，比例为10：1。分离得7.53g淡黄色油状物,收率71.4％。

[0087] 将N,N,二甲基，2,3-(二油烯基氧基)丙胺7.53g加入500ml单口瓶中，加入碘甲烷20ml，室温下搅拌反应24h，旋蒸抽干反应剩余碘甲烷，得淡黄色油状8g。

[0088] 将三甲基[2,3-(二油烯基氧基)丙基]碘化铵8g溶于20ml二氯甲烷中，加入717树脂100g，搅拌反应72h后抽滤得粗品，硅胶柱层析，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，比例为10：1分离得白色固体4.7g，收率62％。

[0089] 所得化合物鉴定分析：MS:630.6166Calculate Exact Mass:630.6184。

[0090] 核磁氢谱1H NMR(500MHz CDCl3)见图7，核磁13C NMR(500MHz CDCl3)碳谱见图8。

[0091] (1)将取1.42份ID No.267溶解于水或含有9％蔗糖的水中，得溶液一1L；

[0092] (2)称取三甲基[2,3-(二亚油烯基氧基)丙基]氯化铵1.5份、DOTAP 1份、T2C化合物3份、卵磷脂0.45份，磷脂酰肌醇0.25份、双棕榈酰基甘油聚乙二醇4份和双硬脂基甘油聚乙二醇4份，并将这些组分溶解于酒精中得溶液二0.5L；

[0093] (3)将溶液一与溶液二相互混合均匀后，于室温下进行真空抽滤，使其中的酒精逐渐蒸发；

[0094] (4)待大部分的酒精蒸发后，进行均质，得到悬浮液的颗粒为240nm；

[0095] (5)再对悬浮液进行高压均质、冻干，形成干燥物，即得所述用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物。

[0096] 实施例8

[0097] (1)将份0.2份ID No.267溶解于水或含有9％蔗糖的水中，得溶液一1L；

[0098] (2)称取DODAC 0.9份、DLinDMA 0.6份、DDAB 0.4份、GL-670.3份、DMRIE 0.8份、T2C1化合物2份、心肌磷脂0.5份、胆固醇2份、双肉豆蔻酰基甘油聚乙二醇0.6份、1,2-二亚油酰基-顺-甘油-3-磷酸乙醇氨0.6份和双棕榈酰基甘油聚乙二醇0.8份，并将这些组分溶解于酒精中得溶液二0.8L；

[0099] (3)将溶液一与溶液二相互混合均匀后，于室温下进行真空抽滤，使其中的酒精逐渐蒸发；

[0100] (4)待大部分的酒精蒸发后，进行均质，得到悬浮液的颗粒大小为100nm；

[0101] (5)再对悬浮液进行高压均质、冻干，形成干燥物，即得所述用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物。

[0102] 实施例9

[0103] (1)将所述份1.1份ID No.267溶解于水或含有9％蔗糖的水中，得溶液一1L；

[0104] (2)称取三甲基[2,3-(二亚油烯基氧基)丙基]氯化铵0.5份、T2C1化合物8份、磷脂酰乙醇胺2份、卵磷脂1份、胆固醇0.5份、胆固醇聚乙二醇8份和双棕榈酰基甘油聚乙二醇2份，并将这些组分溶解于酒精中得溶液二0.4L；

[0105] (3)将溶液一与溶液二相互混合均匀后，于室温下进行真空抽滤，使其中的酒精逐渐蒸发；

[0106] (4)待大部分的酒精蒸发后，进行均质，得到悬浮液的颗粒大小为150nm；

[0107] (5)再对悬浮液进行高压均质、冻干，形成干燥物，即得所述用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物。

[0108] 实施例10

[0109] (1)将所述1份ID No.267溶解于水或含有9％蔗糖的水中，得溶液一1L；

[0110] (2)称取DSDMA 0.3份、DDAB 0.5份、DC-Chol 0.8份、GL-530.4份、T2C1化合物4份、磷脂酰肌醇0.8份、胆固醇0.5份、双硬脂基甘油聚乙二醇6.2份，并将这些组分溶解于酒精中得溶液二0.6L；

[0111] (3)将溶液一与溶液二相互混合均匀后，于室温下进行真空抽滤，使其中的酒精逐渐蒸发；

[0112] (4)待大部分的酒精蒸发后，进行均质，得到悬浮液的颗粒大小为180nm；

[0113] (5)再对悬浮液进行高压均质、冻干，形成干燥物，即得所述用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物。

[0114] 对比例1

[0115] (1)将所述6.25份siRNA序列溶解于水或含有9％蔗糖的水中，得溶液一1L；

[0116] (2)量取酒精0.25L得溶液二；

[0117] (3)将溶液一与溶液二相互混合均匀后，于室温下进行真空抽滤，使其中的酒精逐渐蒸发；

[0118] (4)待大部分的酒精蒸发后，进行均质，得到悬浮液的颗粒为40nm；

[0119] (5)再对悬浮液进行高压均质、冻干，形成干燥物，即得所述用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物。

[0120] 实验例

[0121] 按照实施例1的方法制备ID No.267的RNA干扰组合物，并进行下面的动物实验，该动物实验所用小鼠为HBV转基因小鼠。所述的RNA干扰组合物的剂量是2毫克/公斤体重，一次注射，在不同时间取血、动物处死后，测定血浆其肝炎病毒表面抗原及病毒DNA指标。

[0122] 其中肝脏HBV DNA分析采用半定量PCR进行，肝脏HBV DNA测定具体步骤如下：

[0123] 用实时PCR进行，所用引物为HBV3正向引物ATAAAACGCCGCAGACACATC，HBV3反向引物AACCTCCAATCACTCACCAACC，探针为HBV3Taq-man probe [6～FAM]-AGCGATAACCAGGACAAGTTGGAGGACA-[BHQ1a～6FAM]；反应体系为25μL，包括12.5μL FullVelocityTM QPCR master mix、0.375μL稀释参考染料(1:500)、0.25μL StratascriptTM RT/RNase block酶混合物和0.5μL FullVelocityTM酶。反应程序为：95℃下2分钟，在95℃下10秒40个循环，在60℃下30秒。使用标准曲线的方法测定。

[0124] 血液HBV表面抗原指标分析采用ELISA试剂盒进行测定。

[0125] 由图1可知，HBV转基因小鼠注射不同剂量的siRNA组合物后，在不同时间观察小鼠体内的HBV病毒的DNA变化，逐步降低。值得注意的是，并不是剂量越大，HBV病毒的DNA变化越明显，0.5mg/kg为适宜使用量。凸显了本发明siRNA组合物用量少的特点。

[0126] 由图2可知，HBV转基因小鼠注射不同剂量的siRNA组合物后，在不同时间观察小鼠体内的HBV病毒的表面抗原变化，两组平行样品HBV-TG1、HBV-TG2表示抗原剂量，在20天内，整体趋势为显著降低。人乙肝病毒的转基因小鼠实验证明，一次注射0.5mg/kg的siRNA注射剂量，就可以有效的抑制病毒20天。远远低于现有技术中6mg/kg的小鼠注注射剂量。

[0127] 结果如图1和图2所示，对肝脏和血液中的乙型肝炎病毒性的DNA和抗原具有非常显著的抑制作用，其中作用可维持三周以上。

[0128] 图3为HBV转基因小鼠注射实施例1、实施例2和实施例4的组合物，体内HBV病毒的DNA变化曲线图。注射剂量为0.5mg/kg。如图3所示，经过阳离子脂质、磷酸、胆固醇和脂质-聚乙二醇包裹得到的siRNA药物组合物，效果显著优于未经包裹的实施例2和采用阳离子脂质包裹的实施例4。实施例1、实施例2和实施例4制备的药物组合物，在20天内有效的抑制了体内HBV病毒的DNA。

[0129] 图4为实施例1和对比例1药物稳定性检测的琼脂糖凝胶电泳成像图。将实施例1和对比例1得到的药物组合物，放入新鲜的人血清中进行37℃水浴。然后在指定的时间通过高温95℃停止，灭活RNA酶，进行琼脂糖凝胶电泳检测。泳道1为对比例1中的未包裹的siRNA，泳道2至泳道10为包裹时间不同的实施例1中的siRNA，由图4可知，水浴5分钟后，泳道1中未包裹的siRNA明显比泳道2包裹的siRNA条带浅。对比例1中未包裹的siRNA进行稳定性检测5分钟后，发生了较明显的降解。泳道2至泳道10中包裹的siRNA，条带亮度显著大于泳道1。所以，经过包裹的siRNA，性质稳定，不易被降解。

[0130] 将获得的人外周血单核细胞在37℃，5％CO2的条件下进行培养。按照本发明实施例1、专利2013102317308实施例4为对比例2分组给药，并设置不给药的正常细胞对照组。于2h，6h，12h收取细胞培养液上清，取细胞上清于1000*g离心20min，去除杂质及细胞碎片，检测生物活性因子TNF-α。进行ELISA检测，获得数据后进行分析。

[0131] 结果如图5，实施例1和对比例2的TNF-α表达随着检测时间点的延长，表达量在持续增加。实施例1在3个时间点的TNF-α表达量均高于对比例2，同时显著高于正常细胞对照组。0h三个实验组的TNF-α表达量为23U，6h实施例1的表达量增量为5.7U，对比例2为2.5U，正常细胞组为0U。在给药6h后，本发明实施例1的TNF-α表达量显著增加，为对比例2的2.3倍。生物活性因子TNF-α的增加，对治疗乙型病毒性肝炎有很好的促进作用。

[0132] 结果如图6，电镜扫描结果显示，实施例2中的干扰组合物为纳米级别，能够靶向进入细胞内行使功能。

[0133] 上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。